腸病毒感染及抗ADPATP載體抗體在病毒性心臟病發(fā)病中的意義

1、    腸病毒感染及抗ADP/ATP載體抗體 在病毒性心臟病發(fā)病中的意義*        摘要目的：探討腸病毒感染與抗二磷酸腺苷/三磷酸腺苷(ADP/ATP)載體抗體在病毒性心臟病發(fā)病中的意義。方法：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)和免疫轉(zhuǎn)印法對臨床診斷為病毒性心肌炎(VMC)和擴張型心肌病(DCM)患者進行腸病毒核糖核酸(RNA)及抗ADP/ATP載體抗體的檢測。結(jié)果：RT-PCR方法檢測腸病毒RNA，VMC組(n=74)42例(56.8%)陽性，DCM組

2、(n=26)11例(42.3%)陽性。與健康組(n=30)比較具有顯著性差異(分別P0.01，P0.05)；腸病毒感染與DCM患者心臟功能降低有明顯相關(guān)性。免疫轉(zhuǎn)印法檢測VMC(n=34)和DCM(n=26)患者血清抗ADP/ATP載體抗體，VMC組23例(67.6%)陽性，DCM組12例(46.2%)陽性，而健康組均為陰性；抗ADP/ATP載體抗體和腸病毒RNA的檢出相關(guān)(r=0.442)。結(jié)論：腸病毒RNA和抗ADP/ATP載體抗體在病毒性心臟病患者中檢出具有相關(guān)性，對臨床上出現(xiàn)前驅(qū)感染和心臟癥狀的患者，及時進行腸病毒RNA、CVB-IgM、抗ADP/ATP載體抗體的檢測，有助于VMC和D

3、CM的早期診斷。關(guān)鍵詞病毒性心肌炎擴張型心肌病腸病毒自身抗體聚合酶鏈反應(yīng) Significance of enterovirus infection and antibody againstADP/ATPcarrier in the etiology of viral heart diseaseLiu YingLiao YuhuaDong Jihuaet al(Institute ofcardiology, Tongjimedical University, Wuhan 430022)AbstractObjective:To evaluate the roles of enterovirus

4、(EV) infection and autoantibody against ADP/ATPcarrier in the pathogenesis of viral heart disease (VHD).method:The reverse transcription-polymerasechain reaction (RT-PCR) amplification assay and western blot assay were developed to detect EVs ribonucleic acid (RNA) and autoantibody against ADP/ATPca

5、rrier in sera from patients suspected of viralmyocarditis(VMC) and DCM. Result:42 of 74(56.8%) patients with VMC and 11 of 26(42.3%) patients with ditaledcardiomyo pathy(DCM) suffered from EVs-RNA infection,both weremuch higher than the health group (n=30). The EVs-RNA infection hadmarkedcorrelation

6、 to the heart function in patients with VHD. The autoantibody against ADP/ATPcarriercould be found in 23 of 34(67.6%) patients with VMC and 12 of 26(46.2%) patients with DCM, while it was negative in the health group. The autoantibody against ADP/ATPcarrier and the EVs-RNA infection hadmarkedcorrela

7、tion in patients with VHD (r=0.442).conclusion:The EVs-RNA and autoantibody against ADP/ATPcarriercould be detected in patients with VHD. To the patients who had precursory infection andcardiac symptoms, the detection of EVs-RNA,CVB-IgM, and autoantibody against ADP/ATPcarriercouldcontribute to th e

8、arly stage diagnosis of the viral heart diseases.KeywordsViralmyocarditisDilatedcardiomyopathyEnterovirusAutoantibodyReverse transcription polymerasechain reaction大量臨床資料及實驗研究提示病毒性心肌炎(VMC)可以轉(zhuǎn)化為擴張型心肌病(DCM)，并將與病毒有關(guān)的心肌疾病統(tǒng)稱為病毒性心臟病(VHD)1。關(guān)于VMC和DCM的病因，目前多認為與病毒感染和自身免疫反應(yīng)有關(guān)。為探討VHD的病因及發(fā)病機理，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-P

9、CR)及免疫轉(zhuǎn)印法，對臨床診斷為VMC和DCM患者血清進行腸病毒核糖核酸(RNA)和抗二磷酸腺苷/三磷酸腺苷(ADP/ATP)載體抗體的檢測，探討腸病毒感染與抗ADP/ATP載體抗體在VHD發(fā)病中的意義。1材料與方法1.1主要材料逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)購自美國Promega公司，Taq酶購自加拿大Sangon公司，引物P1、P2參照文獻2合成，產(chǎn)物為314 bp。P1：5CGGTACCTTTGTGCGCCTGT 36383P2：5CAGGCCGCCAACGCAGCC 33593771.2研究對象VHD組：100例，均符合1995年全國心肌炎、心肌病專題研討會擬訂的成人急性VMC和特發(fā)性DCM診斷參

10、考標準3，其中VMC組74例，男41例，女33例，年齡753歲，平均(23.1±19.3)歲；DCM組26例，男15例，女11例，年齡1564歲，平均(45.3±24.6)歲。超聲心動檢測心功能。健康組：健康獻血員30例，男15例，女15例，平均年齡(22.8±3.2)歲。1.3腸病毒RNA RT-PCR腸病毒RNA提?。喝〔∪搜?00l,依次加入GITC變性液200l，氯仿/異戊醇(491)50l，2molNaAc 25l(pH4.0)水飽和酚200l，劇烈振蕩15s后置-20冷卻10min，12000 r/min離心5min，取上清200l加入等體積異丙醇，

11、-20靜置1h，12000r/min離心10min，棄上清，乙醇洗滌沉淀，開蓋自然揮發(fā)或烘干備用。腸病毒RNA RT-PCR：按以下比例加入RT-PCR各成分：雙蒸水14.35l，10×Buffer 2l,15mmolmgCl2 2l,10mmoldNTP各0.1l共0.4l,引物P1(50 pmol)0.4l，P2(50 pmol)0.4l，Taq酶0.2l，逆轉(zhuǎn)錄酶AMV 0.25l，共計20l；42恒溫水浴逆轉(zhuǎn)錄30min，即可進行擴增。程序如下：94變性5min；94變性30 s，60復(fù)性30 s，72延伸90 s，共30個循環(huán)，72延伸5min。電泳：取擴增產(chǎn)物6l加溴酚藍

12、顯示劑點樣于2%瓊脂糖凝膠(含EB 0.5g/ml)上，100V電泳30min，于紫外燈下觀察結(jié)果。1.4柯薩奇病毒B(CVB)-IgM檢測ELISA間接法：將CVB 16病毒抗原與包被液(pH 9.6，0.05mol碳酸鹽緩沖液)110稀釋，于微量反應(yīng)板中每孔加150l，置4過夜。傾去包被液，用洗滌液(pH 7.4，0.01mol PBS-Tween 20)加滿各孔，置3min，洗滌3次。加120稀釋待測血清150l，置42孵育45min；洗滌后加12000稀釋HRP標記兔抗人IgM(同濟醫(yī)科大學(xué)協(xié)和醫(yī)院病毒室產(chǎn)品)150l，42孵育30min；洗滌后加底物液(OPD-H2O2檸檬酸-磷酸鹽

13、緩沖液)150l，37放置15min，0.01mol H2SO4終止反應(yīng)。酶標儀492nm處讀數(shù)并記錄OD值，以大于健康組OD值的均數(shù)與2.1倍標準差之和為陽性。1.5抗ADP/ATP載體抗體檢測參照廖玉華等4的免疫轉(zhuǎn)印法，待測血清110稀釋，HRP-羊抗人IgG 150稀釋，在轉(zhuǎn)印膜29 763 u處出現(xiàn)棕色條帶者為陽性。1.6統(tǒng)計學(xué)方法計數(shù)資料以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗、2檢驗、相關(guān)分析。2結(jié)果2.1VHD患者腸病毒RNA和CVB-IgM檢測的比較對臨床診斷為VMC和DCM的患者進行腸病毒RNA和CVB-IgM抗體檢測，結(jié)果顯示VMC組和DCM組均明顯高于健康組，但VMC組C

14、VB-IgM抗體陽性率比DCM組更高。見表1。表1VHD患者血清腸病毒感染與病毒抗體出現(xiàn)情況組別總例數(shù)EV-RNA陽性CVB-IgM陽性例數(shù)%例數(shù)%VMC組7442*56.836*48.6DCM組2611*42.35*19.2健康組3026.713.3與健康組比較*P0.05，*P0.01；與DCM組比較P0.05，P0.01 2.2DCM患者腸病毒感染與心功能的關(guān)系26例DCM患者中，11例腸病毒RNA陽性和15例陰性患者的左室舒張期末內(nèi)徑分別為(6.89±1.76)cm與(6.40±2.30)cm(P0.05)，11例腸病毒RNA陽性患者中有10例射血分數(shù)45%(占90

15、.9%)，而15例陰性患者中僅有8例射血分數(shù)45%(占53.3%)，兩組間具有顯著性差異(P0.05)。提示病毒持續(xù)感染與VHD患者心功能改變具有相關(guān)性。2.3VHD患者腸病毒感染與抗ADP/ATP載體抗體的關(guān)系免疫轉(zhuǎn)印法檢測60例VHD患者血清抗ADP/ATP載體抗體，VMC組34例中外周血腸病毒RNA 23例陽性(67.6%)，DCM組26例中12例陽性(46.2%)，健康組30例均為陰性。表明，腸病毒感染與抗ADP/ATP載體抗體的產(chǎn)生具有相關(guān)性(r=0.442，P0.001)。3討論我們采用腸病毒5端保守區(qū)的一對通用引物，對100例臨床診斷為VHD的患者及30例健康人進行RT-PCR檢

16、測，發(fā)現(xiàn)56.8%的VMC患者和42.3%的DCM患者外周血中可檢出腸病毒RNA，而健康人檢出率僅6.7%，說明在VMC和DCM的發(fā)病中，腸病毒RNA感染是一個重要原因。CVB-IgM抗體檢測是VMC早期診斷的重要指標之一，本研究對VMC和DCM患者均進行CVB-IgM抗體的檢測，其患者CVB-IgM抗體陽性率均明顯高于健康人群，同時發(fā)現(xiàn)VMC組的CVB-gM抗體陽性率明顯高于DCM患者，這可能是由于VMC患者均為病毒感染急性期，而DCM患者大多病程較長，IgM抗體滴度已顯著下降或消失。ADP/ATP載體位于心肌線粒體內(nèi)膜，占線粒體蛋白含量的12%，其主要功能是在線粒體與胞漿之間轉(zhuǎn)運ATP，參

17、與心肌細胞的能量代謝?？笰DP/ATP載體抗體在DCM和VMC患者血清中檢出頻率較高，在其他心臟病如風(fēng)濕性心臟病、冠心病及正常人血清中檢出頻率很低，對于DCM的診斷具有特異性4。近年來研究發(fā)現(xiàn)抗ADP/ATP載體抗體通過對心肌細胞膜鈣通道的作用，引起心肌細胞膜鈣電流增加和細胞漿游離鈣濃度增加，導(dǎo)致心肌細胞毒性損害59。本組對60例VHD患者進行抗ADP/ATP載體抗體檢測，VMC患者陽性率為67.6%，DCM患者為46.2%，30例健康人均為陰性，說明抗ADP/ATP載體抗體與VMC或DCM的發(fā)病有一定關(guān)系。Schwimmbeck等10發(fā)現(xiàn)CVB3第12181228位氨基酸與人線粒體內(nèi)膜ADP

18、/ATP載體抗體蛋白第2738位氨基酸高度同源，實驗表明，抗ADP/ATP載體第2738位肽的抗體不僅與ADP/ATP載體第2738位肽反應(yīng)，也與CVB3第12181228位肽反應(yīng)，抗CVB3第12181228位肽抗體與CVB3 12181228和ADP/ATP載體也均發(fā)生反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)60例VHD患者抗ADP/ATP載體抗體陽性的35例患者中，30例可檢出腸病毒RNA，符合率為85.7%；該抗體陰性25例患者中，僅有11例可檢出腸病毒RNA，抗ADP/ATP載體抗體與腸病毒RNA的檢測結(jié)果具有相關(guān)性。病毒基因和自身抗體檢出的一致性，可能是由于人體內(nèi)線粒體ADP/ATP載體蛋白與CVB3外

19、殼蛋白有一段高度同源的序列10。根據(jù)分子模仿理論，腸病毒感染，尤其是CVB組病毒感染人體后激活機體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生抗病毒抗體，并產(chǎn)生抗心肌線粒體ADP/ATP載體自身抗體。目前認為，腸病毒持續(xù)感染和自身免疫系統(tǒng)激活引起的自身免疫損傷是DCM的主要發(fā)病機制1。本研究對26例DCM患者進行腸病毒檢測，腸病毒感染陽性患者中90.9%的患者左心室射血分數(shù)45%，而陰性患者中僅有53.3%的患者左心室射血分數(shù)45%，說明腸病毒持續(xù)感染與心臟收縮功能降低可能有關(guān)。腸病毒感染不僅可以引起直接的心肌損傷，還可以激活機體免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗心肌自身抗體，引起免疫性心肌損傷。在一些病程較長的DCM患者中，病毒檢

20、測為陰性，而心功能繼續(xù)惡化，可能與病毒感染繼發(fā)的持續(xù)的免疫損傷有關(guān)?？傊?，腸病毒感染與抗ADP/ATP載體抗體在VHD患者血清中發(fā)現(xiàn)，對于揭示該病的發(fā)病機制具有重要意義，腸病毒RNA和抗ADP/ATP載體抗體檢測對VHD的診斷具有重要臨床價值。*國家“九五”科技攻關(guān)基金部分資助項目(96-906-02-13)作者單位：同濟醫(yī)科大學(xué)心血管病研究所(武漢，430022)研究生，現(xiàn)在北京市公安醫(yī)院內(nèi)科(北京，100006)參考文獻1Kandolf R, Klingel K, Zell R, et al.molecularmechanisims in pathogenesis of enterovir

21、al heart disease:acute and persistent infections.clin Immunol Immunopathol,1993,68:1531582Linderberg AM, Stalthandske POK. Genome ofcoxsackievirus B3. Virology,1987,156:50633全國心肌炎、心肌病專題研討會組委會.全國心肌炎、心肌病專題研討會紀要.臨床心血管病雜志，1995，11：3243254廖玉華，涂源淑，李淑莉，等.擴張型心肌病抗心肌線粒體ADP/ATP載體自身抗體的研究.中華心血管病雜志，1994，22：43455Liao YH. Functional analysis of autoantibodiesagainst ADP/ATPcarrier from dilatedcardiom-yopathy. Int Jcardiol,1996,54:1651696Schultheiss HP, Kuhl U, Janda I, et al. Antibody-mediated enhancement ofcalcium permibi-lity incardiacmyocytes. J Expmed,1988,168:21052