人臍帶靜脈灌注液間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和鑒定

1、人臍帶靜脈灌注液間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和鑒定         08-03-01 16:46:00     編輯：studa20                  作者：劉曉丹，劉兵，李秀森，毛寧【摘要】  本研究旨在探討人臍帶靜脈灌注液中是否存在間充質(zhì)干細(xì)胞及其分離和擴(kuò)增方法。從正常產(chǎn)婦分娩后的臍帶靜脈

2、灌注液分離間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)并用流式細(xì)胞儀分析其細(xì)胞表型和細(xì)胞周期，在體外分別誘導(dǎo)其成骨、成脂肪和成軟骨細(xì)胞分化。結(jié)果表明：臍帶靜脈灌注液來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞為成纖維細(xì)胞樣，高表達(dá)CD29、HLAABC、CD166、CD105、CD73、CD44；不表達(dá)造血和內(nèi)皮標(biāo)志（CD34、CD45、CD144和CD14）。它們可向骨、脂肪和軟骨細(xì)胞分化，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的基本功能特征。結(jié)論：人臍帶靜脈灌注液存在間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，可作為今后細(xì)胞治療和組織工程的種子細(xì)胞。 【關(guān)鍵詞】  臍帶靜脈灌注液     Isolation an

3、d Identification of Mesenchymal Stem Cells from Perfusion of Human Umbilical  Cord Vein      Abstract    This study was aimed to investigate whether mesenchymal stem cells (MSCs) existed in human umbilical cord vein and to establish the methods of isolati

4、on and expansion in vitro. The MSCs direved for perfusion of umbilical cord vein (UVMSCs) were collected after parturition of Healthy pregnant women. The morphology of MSCs and their differentiation potential into osteoblast, adipocyte and chondrocyte were observed the phenotype and cell cycle of MS

5、Cs were determined by using flow cytometry. The result showed that the mesenchymal stem cells separated from umbilical cord  vein gave rise to a population of adherent cells with a typical fibroblastlike morphology. Similarly to bone marrowderived MSCs,  they highly expressed CD29, HLAABC,

6、 CD166, CD105, CD73 and CD44, and were negative for any hematopoietic and endothelial markers (CD45, CD34, CD14 and CD144). Functionally, they could differentiate into the osteoblast, adipocyte and chondrocyte. It is concluded that  MSCs exist in the human umbilical cord vein perfusion.  T

7、heir read amplification in vitro contribute to  clinical applications for cell therapy and tissue engineering.    Key words    mesenchymal stem cell; umbilical  cord vein perfusion; cell  isolation; cell identification    間充質(zhì)干細(xì)胞（mensenchyma

8、l stem cells,  MSC）最早自骨髓中分離，是一類(lèi)具有自我更新及多向分化潛能的  中胚層源干細(xì)胞1。作為多種骨髓基質(zhì)的前體細(xì)胞，MSC能通過(guò)調(diào)節(jié)造血微環(huán)境以促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖、分化，它亦能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞免疫功能，從而減輕移植排斥反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)2。MSC的發(fā)現(xiàn)為針對(duì)性解決造血干細(xì)胞移植，尤其是臍血移植中的干細(xì)胞數(shù)量相對(duì)不足及減輕移植物抗宿主病提供了一個(gè)有效手段3，4。然而，臨床上骨髓取材困難，供體有限，隨年齡的增加其增殖和分化能力下降，且有病毒污染的可能5 。因此，尋找MSC的新來(lái)源具有重要意義。本研究從易于獲取、且組織來(lái)源較為原始的臍帶靜脈灌注液中尋找MSC（U

9、VMSC），并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定。    材料和方法    材料與試劑    臍帶來(lái)自北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院正常分娩產(chǎn)婦，均經(jīng)父母授權(quán)同意。膠原酶為Sigma公司產(chǎn)品，DMEM為Hyclone公司產(chǎn)品，胎牛血清為FBS，Stem Cell產(chǎn)品，L谷氨酰胺為Amresco公司產(chǎn)品，EGF為Peprotech公司產(chǎn)品，rhVEGF為R&D公司產(chǎn)品，bFGF為雙鷺?biāo)帢I(yè)公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為Amresco公司產(chǎn)品，誘導(dǎo)試劑：地塞米松、甘油磷酸鈉、抗壞血酸磷酸鹽、3異丁酸1甲基黃嘌呤（IBMX），胰島素、

10、消炎痛、丙酮酸鈉均為Sigma公司產(chǎn)品，TGF3為R&D公司產(chǎn)品，ITSA為Sigma公司產(chǎn)品；流式相關(guān)鼠抗人單克隆抗體：CD29PE、CD166PE、 CD14、CD144PE、CD34FITC、CD45FITC、HLAABCFITC、HLADRFITC、CD44FITC、CD105FITC均為Becton Dickinson公司產(chǎn)品），堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品。    中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志  J Exp Hematol 2007; 15(5)人臍帶靜脈灌注液間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和鑒定UVMSC的分離培養(yǎng)與傳代  

11、;  取正常產(chǎn)婦分娩后的臍帶靜脈，無(wú)菌條件下用PBS清洗臍帶靜脈外表面及臍帶靜脈，止血鉗夾住一端，根據(jù)臍帶靜脈的長(zhǎng)度，加入適量的0.1% 型膠原酶，37孵育30分鐘，棄去臍帶靜脈內(nèi)液體，用PBS灌注臍帶靜脈3次，收集灌注液，按1×105/cm2,接種于25 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)體系為： 10% FBS、MEM、EGF（10 ng/ml）、rhVEGF（10 ng/ml），青霉素（100 U/ml ）、鏈霉素（100 U/ml ）、L谷氨酰胺2 mmol/L，置于37和5% CO2條件下孵育72小時(shí)后換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合達(dá)80%以上，加入0.05%胰蛋白酶EDTA溶

12、液消化，按13或14傳代。待3代后，細(xì)胞形態(tài)呈纖維細(xì)胞狀，可停止加入EGF和VEGF。取3代以上細(xì)胞作后續(xù)試驗(yàn)。    UVMSC 表面抗原的檢測(cè)    取第5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期UVMSC，按每管2×105個(gè)細(xì)胞，依次加入10 l鼠抗人單克隆抗體CD29PE、CD166PE、CD73PE、CD14PE、CD144PE、CD34FITC、CD45FITC、HLAABC、HLADR、CD44FITC、CD105FITC，另設(shè)1管為對(duì)照組，室溫避光30分鐘；用PBS反復(fù)洗2-3次，減少非特異性結(jié)合；離心后，加入1%多聚甲醛固定，4保

13、存，1周以?xún)?nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。    UVMSC的細(xì)胞周期檢測(cè)    收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期UVMSC 1×106，PBS洗2次，0.9% FBS的70%乙醇重懸，4保存過(guò)夜，然后用PBS洗2次，加1 mg/ml RNase于37孵育30分鐘，加入150 g/ml PI,室溫避光20分鐘，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。    UVMSC的生長(zhǎng)曲線檢測(cè)    收集UVMSC細(xì)胞，按每孔500個(gè)細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每組3個(gè)復(fù)孔，待24小時(shí)后，加入MTT 20 l，4小時(shí)后加

14、入100 l裂解液，于37過(guò)夜，第2天用酶聯(lián)儀測(cè)定OD540，連續(xù)測(cè)定6天。    定向誘導(dǎo)UVMSC向成骨細(xì)胞分化的方法與鑒定    收集消化后UVMSC，按3 000/cm2接種于6孔板內(nèi)，成骨的誘導(dǎo)體系為：地塞米松0.1  mol/L、甘油磷酸鈉10 mmol/L、抗壞血酸磷酸鹽50 mol/L、10% FBS、高糖DMEM，每3天全量換液，維持3周，然后進(jìn)行堿性磷酸酶檢測(cè)，方法同文獻(xiàn)6。    定向誘導(dǎo)UVMSC向脂肪細(xì)胞分化的方法與鑒定    收集UVMSC后按9 000/cm2接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，加入脂肪誘導(dǎo)體系:地塞米松1 mol/L、IBMX 0.5 mol/L、消炎痛200 mol/L、10% FBS、高糖DMEM，每3天全量換液，維持3周，然后進(jìn)行油紅染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪小滴形成情況。    定向誘導(dǎo)UVMSC向