貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同課件

1、l1. 1.細胞培養(yǎng)中為什么添加血清？細胞培養(yǎng)中為什么添加血清？l2.2.使用血清需注意哪些方面？使用血清需注意哪些方面？l3.3.消化液胰酶的濃度是多少？消化液胰酶的濃度是多少？l4.4.使用小濾器過濾要注意哪些？使用小濾器過濾要注意哪些？ 針頭濾器使用應注意的問題針頭濾器使用應注意的問題 1. 1.擰緊濾器擰緊濾器 2.2.注射器吸液體注射器吸液體 3.3.注射器插好濾器注射器插好濾器 4.4.對著燒杯慢推壓針芯看是否漏對著燒杯慢推壓針芯看是否漏 5.5.如不漏對小瓶過濾。如不漏對小瓶過濾。 6.6.濾器放在小瓶瓶口上，取下針頭再吸液體，濾器放在小瓶瓶口上，取下針頭再吸液體，反復多次，濾完

2、。反復多次，濾完。 7.7.檢查濾器濾膜是否完好。檢查濾器濾膜是否完好。一、實驗原理一、實驗原理 細胞貼壁過程細胞貼壁過程培養(yǎng)細胞一代生長過程 什么時候傳代？什么時候傳代？ 細胞消化的最佳程度細胞消化的最佳程度 細胞凍存細胞凍存要求要求凍存條件凍存條件操作要點操作要點 二、實驗目的 掌握無菌操作技術。 掌握傳代細胞的培養(yǎng)的一般方法與步驟。 掌握培養(yǎng)細胞的消化方法。 了解在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)和生長狀況。三、實驗材料及設備三、實驗材料及設備 1. 1. 細胞細胞 人宮頸癌人宮頸癌HeLaHeLa 細胞細胞 人胃癌人胃癌BGC-823BGC-823細胞細胞2. 2. 試劑試劑 胰酶、

3、DMEM培養(yǎng)基、血清、DMSO、抗生素 3. 3. 儀器儀器 超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡4.其它用品： 培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75酒精棉球，酒精燈 四、實驗步驟四、實驗步驟1.準備：超凈工作臺紫外線處理30分鐘, 用肥皂洗手, 穿鞋套，用新潔爾滅溶液拭擦雙手消毒。2. 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置室溫下預熱。3關閉超凈臺紫外燈, 打開可見光燈開關,打開抽風機清潔空氣，除去臭氧。用75%酒精擦雙手消毒 。 4.正確擺放超凈臺內(nèi)的實驗用品：酒精燈、酒精棉球、新潔爾滅紗布、試管架、滴管筒（頭）、吸管筒（頭）、廢液缸

4、等。點燃酒精燈，準備好實驗試劑：DMEM培養(yǎng)基（其中血清含量10%）、 血清、胰酶等。5.點燃酒精燈；取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。6.將培養(yǎng)用液（90mL) 瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。7. 打開血清（10.5mL) 瓶，瓶口過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。8. 無菌吸取10mL血清加入到培養(yǎng)液（90mL)中，用微量移液器加入雙抗100L輕輕混勻，配置完全培養(yǎng)基。9. 在血清中（剩余0.5mL) 加入4mL完全培養(yǎng)基輕輕混勻，加入0.5mL DMSO（凍存保護劑），輕輕混勻即為凍存液 。10.細胞瓶口靠

5、近火焰打開瓶蓋并在酒精燈上燒口消毒，倒掉或吸出培養(yǎng)基（對于小口的培養(yǎng)瓶可采用傾倒方法,對于培養(yǎng)皿,必須用吸管吸出）11.加一滴管胰酶輕輕漂洗一下細胞，棄胰酶，再加入一滴管或兩滴管胰酶（以蓋住細胞量為準，轉動培養(yǎng)瓶，使其濕潤整個細胞層，蓋好瓶蓋。12.顯微鏡下觀察細胞的消化狀態(tài)，待細胞大部分收縮、突起、一半變圓，細胞邊界清晰時，即可立起或翻轉培養(yǎng)瓶停止消化，在超凈臺內(nèi)靠近火焰處棄胰酶13. 加兩滴管（約1.8-2mL）凍存液既全面吹打細胞瓶壁,吹打均勻，細胞濃度宜大，3106個/mL左右。14.將細胞懸液吸至凍存管中，擰好蓋，封好膠布，并標記好細胞種類，凍存時間，保存條件以及凍存者姓名等（懸浮細

6、胞凍存將細胞離心后再加凍存液）15.在培養(yǎng)瓶(殘余少量細胞）中加入5mL完全培養(yǎng)及，蓋好瓶蓋（擰緊后并旋回半圈）。做好記錄，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。16.凍存管在4度以下存放30min，轉放到20度 1.52h，再轉到70度412h后即可轉移到液氮內(nèi)，注意做好凍存記錄。把握好傳代時機，80-90%匯合度階段最好，過早細胞產(chǎn)量少，過晚細胞健康狀態(tài)不佳消化時間要適度，過短細胞不易脫落，過長細胞可脫落流失。消化液濃度要適宜，過濃時消化作用強烈，細胞反應快，所需消化時間短，掌握不好，細胞易流失。不同細胞對消化反應不同。 貼壁不牢直接吹下細胞損傷注意事項注意事項1. 1.試述傳代培養(yǎng)的步驟和注意事項，并指出哪些是試述傳代培養(yǎng)的步驟和注意事項，并指出哪些是關鍵步驟關鍵步驟? ?2.2.細胞胞傳代培養(yǎng)的目的是什么細胞胞傳代培養(yǎng)的目的是什么? ? 3.3.貼壁細胞和懸浮