SOP紙片法藥敏實(shí)驗(yàn)

1、紙片法藥敏試驗(yàn)1）目的 本操作規(guī)程依據(jù)WS/T 125-1999，規(guī)定了臨床抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（紙片法）內(nèi)容做必要的細(xì)化和補(bǔ)充，規(guī)范紙片法藥敏檢測方法。2）適用范圍 本細(xì)則適用于適用于多種動物細(xì)菌病藥物篩選。3）職責(zé) 檢測人員：負(fù)責(zé)按照本細(xì)則對被檢樣品進(jìn)行檢測。 復(fù)核人員：負(fù)責(zé)對檢測操作是否符合規(guī)范以及檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確進(jìn)行復(fù)核。4）方法原理 紙片法藥敏試驗(yàn)由快速生長的致病菌標(biāo)定，適合腸桿菌科、葡萄球菌、腸球菌、銅綠假單胞菌、不動桿菌。經(jīng)適當(dāng)改動可用來測定嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌。對于使用培養(yǎng)基不同、孵育環(huán)境不同或生長率不同的菌類，不能用紙片法做藥敏試驗(yàn)。5）儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱、冰箱等。

2、6）試劑與材料 普通瓊脂培養(yǎng)基、藥敏片。7）環(huán)境條件 操作環(huán)境溫度2228、濕度4080%、電源220V。8）檢測步驟 8.1 制備接種菌液8.1.1 增菌法選瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落至少45個(gè)，用接種環(huán)挑其頂部，移至45ml肉湯或大豆酪蛋白消化液中。放置35培養(yǎng)至菌液濃度達(dá)到或超過比濁管濃度（一般需26h），濃度約12×108cfu/ml。用生理鹽水或肉湯校正菌液濃度至與麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)比濁管相同。可用光電比濁。8.1.2 直接菌懸液法 可直接用過夜培養(yǎng)的菌落（必須用無選擇性培養(yǎng)基，如血平板）在鹽水或肉湯中制備接種菌液。菌液濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)比濁管。此法亦適用于在肉湯培養(yǎng)基中生

3、長不好的細(xì)菌如嗜血桿菌、淋病奈瑟菌及葡萄球菌的甲氧西林或苯唑西林的藥敏試驗(yàn)。8.2 接種平板 校正的菌液須在15 min內(nèi)使用。用一無菌棉拭子蘸取菌液，并在上端管壁旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉過多的菌液。用拭子涂布整個(gè)瓊脂平板表面。Mueller-Hinton 瓊脂平板用前應(yīng)烘干。反復(fù)涂布幾次，每次將平皿旋轉(zhuǎn)60度，保證涂布均勻。8.3 貼紙片 接種平板后，貼上藥敏紙片。用鑷子或針尖壓一下紙片使其與培養(yǎng)基表面貼牢。紙片要貼得均勻，紙片與紙片中心距離不得小于24。原則上，直徑150的平板貼12張紙片，直徑100平板貼6張紙片。貼上紙片15min內(nèi)，須把平板倒放在35孵箱中。8.4 測量抑菌環(huán) 經(jīng)1618h

4、培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。菌液濃度合適且涂得好，抑菌環(huán)規(guī)則，細(xì)菌呈融合生長。手持平皿從背面目測檢查每塊平板，借反射光（黑色無反光背景），用卡尺、普通尺或特制的模板量取抑菌環(huán)直徑，測量抑菌環(huán)直徑須包含紙片直徑，單位為毫米。培養(yǎng)基中如果加了血液，須打開平皿蓋，借反射光，從正面量抑菌環(huán)。葡萄球菌和腸球菌，須培養(yǎng)24h后，經(jīng)透射光檢查苯唑西林和萬古霉素的抑菌環(huán)內(nèi)有無耐藥菌株的生長。抑菌環(huán)內(nèi)有任何生長都判斷為耐藥。 肉眼見不到細(xì)菌明顯生長的區(qū)域?yàn)橐志h(huán)邊緣，有很難辨認(rèn)的細(xì)小菌落者不算。如抑菌環(huán)內(nèi)有大菌落長出，須再移種出來，重新鑒定，重新做敏感試驗(yàn)。變形菌在某些抗菌藥物紙片周圍可彌漫生長到抑菌的區(qū)域內(nèi)，但抑菌環(huán)邊

5、緣清楚，彌漫生長不算。甲氧芐胺嘧啶和磺胺藥的拮抗劑會支持細(xì)菌生長，因而測這類藥時(shí)可忽略輕微生長（80以上受抑制），以濃密生長的區(qū)域作為抑菌環(huán)的界限。9） 檢測記錄和數(shù)據(jù)處理 參照表1表8的標(biāo)準(zhǔn)對抑菌環(huán)的大小作出解釋，以敏感、中介或耐藥的形式報(bào)告結(jié)果。表1 腸桿菌科用的抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)和相對應(yīng)的最小抑菌濃度（MIC）折點(diǎn)表2 銅綠假單胞菌和不動桿菌用的抑菌環(huán)直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)和相對應(yīng)的最小抑菌濃度（MIC）折點(diǎn)表3 葡萄球菌屬的抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)和對應(yīng)的最小抑菌濃度（MIC）折點(diǎn)表4 腸球菌屬的抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)和對應(yīng)的最小抑菌濃度（MIC）折點(diǎn)表5嗜血桿菌屬的抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)和對應(yīng)的最小抑菌濃度（MIC）折點(diǎn)表6淋病奈瑟軍的抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)和對應(yīng)的最小抑菌濃度（MIC）折點(diǎn)表7 肺炎鏈球菌的抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)和對應(yīng)的最小抑菌濃度（MIC）折點(diǎn)表8