第三章基因工程設(shè)計(jì)策略及操作流程2

1、3 基因工程設(shè)計(jì)策略及操作流程 外源DNA 載體DNA 重組分子 原核細(xì)胞 真核細(xì)胞 擴(kuò)增或表達(dá) 表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞3.4.1 基因的體外連接重組 含目的基因的外源DNA在體外通過(guò)限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用與載體連接，獲得重組DNA的過(guò)程，稱為基因的體外連接重組。 基因的體外重組有兩種方式：插入式和置換式?；蝮w外重組的類型基因體外重組的類型 插入式是用一種限制性內(nèi)切酶消化載體，在載體上此酶只有一個(gè)識(shí)別序列，實(shí)現(xiàn)外源片段插入載體的切口； 置換式可用兩種限制性內(nèi)切酶或是在載體上有兩個(gè)識(shí)別序列的一種限制性內(nèi)切酶處理載體，載體被切成大小不等的兩個(gè)片段，把外源DNA與載體

2、大片段連接，即置換了載體中原有的小片段，形成重組DNA分子。 形成重組DNA的實(shí)質(zhì)就是催化外源DNA與載體DNA間高效地形成3,5-磷酸二酯鍵，連接方式有很多種，具體使用時(shí)要根據(jù)外源DNA與載體DNA末端的性質(zhì)選擇合適的方法，以保證連接效率。DNA連接酶連接酶（1）互補(bǔ)黏性末端的連接 互補(bǔ)黏性末端的產(chǎn)生是由于外源DNA和載體DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割或是用兩種同尾酶切割，但用同尾酶切割后產(chǎn)生的重組DNA分子喪失了原有的兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列。黏性末端的連接黏性末端的連接A兩段兩段DNA的連接的連接依靠粘性末端B DNA片斷與載體的連接片斷與載體的連接依靠粘性末端ligasenickC

3、載體與載體的連接載體與載體的連接 20 L的互補(bǔ)黏性末端連接反應(yīng)體系為： 2 L T4 DNA連接酶緩沖液或E. coli DNA連接酶緩沖液 5 L外源DNA片段 5 L載體DNA片段 1 L T4 DNA連接酶或E. coli DNA連接酶 其它用ddH2O補(bǔ)齊 充分混勻后，16過(guò)夜連接連接體系 連接效率的檢測(cè)可用瓊脂糖凝膠電泳法，以載體酶切片段、外源DNA酶切片段為對(duì)照，若只出現(xiàn)兩條與對(duì)照帶相同的條帶，表明連接反應(yīng)失敗；若出現(xiàn)一系列新帶，表明發(fā)生連接。 為了保證連接效率，減少連接過(guò)程中的副產(chǎn)物，連接時(shí)要注意以下幾點(diǎn)：接反應(yīng)中外源DNA片段和載體DNA片段的濃度、防止載體自身環(huán)化、產(chǎn)生兩種

4、重組DNA分子。載體去磷酸化載體去磷酸化雙酶切法雙酶切法5端與3端并列靠近的時(shí)間太短，不容易被連接酶連接。T4 DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5 5 5 5 3 3 3 3 -OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3 -OH-PP-HO-5 3 （2）平末端的連接 如果把由兩種不同限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平末端DNA片段進(jìn)行連接，得到的連接產(chǎn)物就喪失了原有的識(shí)別序列。 如果將由同一種限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的平末端DNA片段進(jìn)行連接，得到的連接產(chǎn)物仍保留原有的識(shí)別序列或是出現(xiàn)一個(gè)新的識(shí)別序列。平末端片段的連接平末端片段的連接（3）末端修飾后的連接 片段末端同聚物加尾法

5、： 一個(gè)為平末端和一個(gè)為黏性末端的DNA片段之間的連接，也可以兩個(gè)平末端DNA片段間的連接。需要末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transforase）催化，在酶的作用下按照53方向?qū)⑺姆N脫氧核苷酸分子的任意一種依次添加到DNA片段的3-OH末端，形成同聚物poly(dC)或poly(dG)或poly(dT)或poly(dA)。 待連接的DNA片段末端加上長(zhǎng)度約10-40個(gè)核苷酸的互補(bǔ)的同聚物尾巴后，在T4 DNA連接酶的作用下形成重組DNA分子，重組DNA分子中有缺口的部分可待其轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后，利用受體細(xì)胞中的DNA聚合酶和DNA連接酶將缺口填補(bǔ)起來(lái)。片段末端同聚物加尾法片段末端同聚物加尾法能

6、把任何片段連接起來(lái)不能把插入片段再切下來(lái)黏性末端修飾為平末端 適用于兩個(gè)DNA片段末端為非互補(bǔ)黏性末端的情況，也可用于一個(gè)片段為平末端另一片段為黏性末端的情況。 將黏性末端改為平末端需要在核酸外切酶（exonuclease ，Exo）的作用下，將雙鏈DNA片段的5或3端突出部分的單鏈斷裂，使黏性末端的DNA片段變?yōu)槠侥┒?。黏性末端修飾為平末端黏性末端修飾為平末端?）末端加連桿的連接 連桿又叫銜接物(linker)，是指用化學(xué)法合成的由10-12個(gè)核苷酸組成，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。 將連桿加在待連接的DNA分子的末端，然后用在連桿中具有識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶處理，即可得

7、到具有互補(bǔ)黏性末端的兩種DNA片段，再在DNA連接酶作用下實(shí)現(xiàn)連接。GGAATTCC CCTTAAGGEcoR I linker： 這種方法適合于具有平末端的兩種DNA片段，或是具有平末端和黏性末端的兩種DNA片段，也適用于非互補(bǔ)黏性末端的兩種DNA片段的連接。末端加連桿末端加連桿1978年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 BamHI adapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。 adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。 adapter的作用（5）DNA接頭接頭 (adapter)連接連接法法Blun

8、t-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG -GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接頭自我連接3.4.2 重組分子的轉(zhuǎn)移 重組分子構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞，才能實(shí)現(xiàn)復(fù)制、擴(kuò)增和表達(dá)。受體細(xì)胞又稱為宿主細(xì)胞，是指能夠攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞。 將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法有很多種，如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、顯微注射和電穿孔等多種方式，在轉(zhuǎn)移重組分子時(shí)根據(jù)受體

9、細(xì)胞的區(qū)別選擇合適的導(dǎo)入方法。 一般原核細(xì)胞和低等真核細(xì)胞作受體時(shí)主要用轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染法，而高等動(dòng)植物的真核細(xì)胞作受體時(shí)主要用顯微注射和電穿孔法。感受態(tài)感受態(tài)制備過(guò)程制備過(guò)程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4On ice 5-10 min4 離 心收集菌用 冰 冷 的0 . 1 m M CaCl2重懸4離心收集菌4離心收集菌分 裝 、 -70凍存用 冰 冷 的0 . 1 m M CaCl2重懸On ice 30 min用 冰 冷 的0 . 1 m M CaCl2重懸（1）重組分子轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞 熱激法轉(zhuǎn)化（Ca2+有助于轉(zhuǎn)化） 往感受態(tài)細(xì)胞中加入重組DNA分子 置冰浴中培養(yǎng)30 min后 42熱

10、休克90s 實(shí)現(xiàn)感受態(tài)細(xì)胞對(duì)重組DNA分子的吸收。（2）重組分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞 酵母作為受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與細(xì)菌類似，先去除細(xì)胞壁游離出原生質(zhì)球，接著在有CaCl2和聚乙二醇的溶液中，重組DNA很容易被受體細(xì)胞吸收。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為受體細(xì)胞可用磷酸鈣沉淀法、病毒顆粒轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、電穿孔法和顯微注射法等將外源基因?qū)搿Ｍ庠椿驅(qū)胫参锛?xì)胞還可利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法。作業(yè)1. 如何將兩端平齊末端的DNA進(jìn)行連接？都有哪些可能的方法？2. 如何保證克隆在載體上的目的基因片段的方向性？3. 試比較轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染。4. 受體細(xì)胞應(yīng)滿足的條件有哪些？5.請(qǐng)寫(xiě)出真核生物電穿孔、顯

11、微注射、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的全過(guò)程。3.5 重組體的篩選3.5.1 遺傳表型篩選法 遺傳表型篩選法是比較直接的篩選方法，是根據(jù)轉(zhuǎn)化子接受了重組DNA而與非轉(zhuǎn)化子在表型上存在差異進(jìn)行區(qū)分的一種方法。主要包括抗藥性篩選、插入失活篩選和顯色互補(bǔ)篩選。（1）載體表現(xiàn)特征篩選 抗藥性篩選利用載體DNA分子上攜帶的抗藥性基因進(jìn)行篩選?？顾幮曰蛑饕邪逼S抗性基因（ampr）、氯霉素抗性基因（cmpr）、卡那霉素抗性基因（kanr）、四環(huán)素抗性基因（tetr）、鏈霉素抗性基因（smr）等。 插入失活篩選法可彌補(bǔ)抗藥性篩選的不足，可直接篩選出含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。這種方法利用質(zhì)粒載體的雙抗藥性。插入失活篩選插入失活

12、篩選-半乳糖苷酶 乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)+深藍(lán)色1. 原理：載體上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點(diǎn)。 受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達(dá)。 載體和受體菌基因組可以互補(bǔ)形成完整有功能的-半乳糖苷酶。藍(lán)白班篩選藍(lán)白班篩選 互補(bǔ)而產(chǎn)生的lacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG（異丙基-D-硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色沉淀物，使菌落顯藍(lán)色。如果外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，無(wú)法實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落

13、。-半乳糖苷酶使X-gal分解成藍(lán)色產(chǎn)物。藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選（2）插入序列表現(xiàn)特性篩選 如果重組DNA分子中的插入序列在受體細(xì)胞中能夠?qū)崿F(xiàn)功能性表達(dá)，則可賦予受體細(xì)胞表現(xiàn)出插入序列編碼的表型特征，可利用此特點(diǎn)篩選含有重組子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。分子量 Marker載體重組克隆3.5.2 結(jié)構(gòu)特征篩選法（1）凝膠電泳篩選 凝膠電泳篩選法是利用了重組質(zhì)粒和非重組質(zhì)粒在分子大小上存在差異的性質(zhì)。將平板上長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（2）菌落PCR篩選 菌落PCR篩選是利用質(zhì)粒上的引物對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)鑒定重組子菌落。 在多數(shù)載體

14、DNA分子中，外源DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的序列是已知的。 如果受體細(xì)胞中含有的是重組質(zhì)粒，以插入位點(diǎn)兩側(cè)序列的互補(bǔ)序列為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，則可獲得外源DNA。 接著進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳在外源DNA的位置就應(yīng)該有對(duì)應(yīng)的條帶。 如果受體細(xì)胞中是非重組質(zhì)粒，以插入位點(diǎn)兩側(cè)序列的互補(bǔ)序列為引物進(jìn)行PCR，則在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)時(shí)無(wú)法獲得與外源DNA相符的條帶。（3）酶切鑒定 酶切鑒定是利用重組質(zhì)粒中外源DNA可選用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶再回收的原理。 將平板上長(zhǎng)出的菌落增殖培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒分子進(jìn)行酶切反應(yīng)，接著用瓊脂糖凝膠電泳。 重組質(zhì)粒會(huì)得到兩條帶，一條是與線性載體大小一致，另一條帶與插入的外源

15、DNA大小一致，但非重組質(zhì)粒僅有一條帶，其位置與線性載體一致。ABA或B不同克隆的酶切結(jié)果不同克隆的酶切結(jié)果3.5.3 核酸分子雜交篩選法 核酸分子雜交法是利用特異的核酸探針與待測(cè)核酸進(jìn)行雜交，檢測(cè)待測(cè)核酸中是否存在與探針互補(bǔ)的DNA片段。 此法也可用于鑒別期望重組子和非期望重組子。在雜交前先將待測(cè)核酸變性，將其固定在硝酸纖維素膜上或尼龍膜上。 然后用探針與之孵育，洗去多余的探針，若最終有顯示的條帶則證明含有目的基因，反之則無(wú)。 核酸分子雜交法根據(jù)待測(cè)核酸來(lái)源和固相支持物的不同可分為Southern雜交法、Northern雜交法、斑點(diǎn)印跡雜交法和菌落印跡原位雜交法。Southern blot

16、篩選結(jié)篩選結(jié)果果 Southern雜交是將待測(cè)DNA分子酶切后變性，轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)臑V膜上用已標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針雜交以檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。 Northern雜交是將RNA分子變性及電泳分離后再用探針進(jìn)行檢測(cè)。 斑點(diǎn)印跡雜交是將變性的DNA或RNA核酸樣品直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交膜上，然后加探針進(jìn)行雜交以檢測(cè)核酸樣品中是否存在特異的DNA片段或RNA片段。 菌落原位雜交是直接把菌落或噬菌斑印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來(lái)并與濾膜原位結(jié)合，再用特異性DNA或RNA探針雜交，篩選出含有目的基因的菌落或噬菌斑。3.5.4 免疫化學(xué)篩選法 免疫化學(xué)篩選法是用抗體作

17、為探針，而非DNA或RNA探針來(lái)鑒定目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。免疫化學(xué)篩選法分為放射性抗體篩選、非放射性抗體篩選法和免疫沉淀篩選法。（1）放射性抗體篩選 在放射性抗體篩選法中，先將待檢測(cè)的菌落或噬菌體按原位印跡到硝酸纖維素膜上，裂解細(xì)胞使目的蛋白抗原釋放并結(jié)合在膜上，然后與第一抗體反應(yīng)生成抗原 - 抗體復(fù)合物。 接著再用放射性125I標(biāo)記了的第二抗體（抗第一抗體中特異性抗原決定簇的抗體）直接檢測(cè)，去除過(guò)剩的第二抗體，薄膜干燥后放射性自顯影，即可顯示出是否有所需的重組體。放射性抗體檢測(cè)法過(guò)程放射性抗體檢測(cè)法過(guò)程（2）非放射性抗體篩選 由于放射性物質(zhì)的半衰期短和安全問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)出了非放射性標(biāo)記物。

18、如第二抗體可用辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶相偶聯(lián)，檢測(cè)目的蛋白抗原 - 抗體復(fù)合物，或者也可用于辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白來(lái)檢測(cè)與生物偶聯(lián)的第二抗體等。待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶 待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗 二抗無(wú)色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶 （3）免疫沉淀篩選 免疫沉淀篩選法是把與目的基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的標(biāo)記抗體加在有轉(zhuǎn)化子菌落的培養(yǎng)基中。利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的原理，如果在菌落周圍有白色圓圈，說(shuō)明發(fā)生了抗體-抗原反應(yīng)，表明該菌落產(chǎn)生與抗體相對(duì)應(yīng)的抗原蛋白（目的基因產(chǎn)物）。對(duì)于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。3.5.5 轉(zhuǎn)譯篩選法 利用克隆的DN

19、A同所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行篩選，分為雜交抑制轉(zhuǎn)譯篩選和雜交選擇轉(zhuǎn)譯篩選。作業(yè)1舉例說(shuō)明插入失活的基本原理。2. 何謂-互補(bǔ)？何謂安慰性誘導(dǎo)物？3. 如何用PCR來(lái)檢測(cè)目的基因是否被克隆？他是基于什么原理？3.6 克隆基因的表達(dá)3.6.1 克隆基因的表達(dá)系統(tǒng) 基因工程的表達(dá)系統(tǒng)分為原核和真核兩類，常用的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和鏈霉菌等，真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母、絲狀真菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳類細(xì)胞。 原核生物作表達(dá)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)迅速、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但大多缺乏轉(zhuǎn)錄后加工和對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾的能力。 真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)雖能去除外源基因中的內(nèi)含子，并可對(duì)蛋白質(zhì)

20、進(jìn)行翻譯后加工，但其選擇標(biāo)記少、轉(zhuǎn)化效率低。克隆基因的表達(dá)：外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因外源基因表達(dá)載體表達(dá)載體重組載體重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中表達(dá)出蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)出蛋白提取蛋白提取蛋白宿主細(xì)胞：宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。3.6.2 克隆基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)與調(diào)控 轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是基因表達(dá)調(diào)控的主要層次。基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄的起始階段和終止階段，調(diào)控方式有順式作用和反式作用兩類，每一類中又有正調(diào)控和負(fù)調(diào)控兩種形式。 順式調(diào)控是一段非編碼DNA序列對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，反式調(diào)控是一種蛋白質(zhì)作用于某一順式作用元件來(lái)影響基

21、因的轉(zhuǎn)錄。 正調(diào)控促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，而負(fù)調(diào)控是抑制轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。(1) 原核的轉(zhuǎn)錄起始與轉(zhuǎn)錄終止 RNA聚合酶與啟動(dòng)子的直接結(jié)合；強(qiáng)啟動(dòng)子如Lac、Trp。轉(zhuǎn)錄終止有兩種類型一種是不依賴于因子的終止另一種終止機(jī)制是依賴于因子的終止(2) 真核的轉(zhuǎn)錄起始與轉(zhuǎn)錄終止 真核生物的啟動(dòng)子由核心啟動(dòng)子元件和上游啟動(dòng)子元件兩部分構(gòu)成。 核心啟動(dòng)子元件是保證基礎(chǔ)水平轉(zhuǎn)錄所必須的最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和TATA box。 上游啟動(dòng)子元件決定著轉(zhuǎn)錄起始的頻率與效率，包括GC box和CAAT box。 在轉(zhuǎn)錄起始時(shí)需要其他的蛋白質(zhì)因子參與，這些蛋白質(zhì)因子稱為轉(zhuǎn)錄因子。 真核生物的RNA聚合酶有三種，其中

22、RNA聚合酶負(fù)責(zé)mRNA的合成，對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子為轉(zhuǎn)錄因子II，為反式作用因子。 反式作用因子與啟動(dòng)子親和力高，則表明此啟動(dòng)子有很高的轉(zhuǎn)錄起始效率。 增強(qiáng)子是順式正調(diào)控元件，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄有極強(qiáng)的激活作用。3.6.3 克隆基因在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控 真核生物的mRNA加工包括三個(gè)內(nèi)容：5端加帽、3端加尾、RNA剪接。 由于原核生物沒(méi)有切除內(nèi)含子的能力，因此當(dāng)用原核生物表達(dá)真核基因時(shí)，應(yīng)先從真核細(xì)胞中分離mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA有完整的編碼序列但無(wú)內(nèi)含子，將cDNA與載體連接導(dǎo)入原核細(xì)胞中表達(dá)。3.6.4 克隆基因在翻譯水平的表達(dá)與調(diào)控 翻譯是基因表達(dá)的最后一個(gè)階段，翻譯的效率會(huì)受翻譯起始復(fù)合

23、物的形成、mRNA的穩(wěn)定性、密碼子偏愛(ài)性、反義RNA、翻譯起始因子的修飾等因素影響。(1) 原核生物在翻譯起始的調(diào)控 起始密碼子AUG SD序列 融合蛋白被認(rèn)為是避免細(xì)菌蛋白酶破壞的最好選擇 在插入真核基因時(shí)，閱讀框應(yīng)與原核DNA片段的密碼子閱讀框一致，翻譯時(shí)才不致產(chǎn)生閱讀框改變的情況（2）真核生物在翻譯起始的調(diào)控 mRNA5端先與翻譯起始因子中的CBP（cap binding protein，帽子結(jié)合蛋白）結(jié)合 然后eIF-4A和eIF-4B與之結(jié)合，為小亞基提供結(jié)合位點(diǎn)，形成40S-Met-tRNAiMet-eIF-3與eIF-4A和eIF-4B形成復(fù)合物 接著此復(fù)合物從帽子結(jié)構(gòu)開(kāi)始沿著m

24、RNA掃描，尋找起始密碼子AUG。 作為起始密碼子的AUG兩側(cè)翼序列有兩個(gè)保守堿基，AUG上游3個(gè)堿基位必定是A，少數(shù)情況下是G，而下游4個(gè)堿基位必定是G。 這段序列（NNPuNNAUGG）對(duì)翻譯很重要，稱為Kozak序列。 當(dāng)掃描時(shí)遇到了具有Kozak序列的AUG時(shí)，復(fù)合物在此處停留下來(lái)，60S大亞基結(jié)合，形成翻譯起始復(fù)合物。（3）反義RNA 反義RNA是翻譯水平上的一種新的調(diào)控方式。反義RNA是能與mRNA5端互補(bǔ)的RNA分子。反義RNA分子以堿基互補(bǔ)配對(duì)方式與mRNA成為雜合分子，阻止了mRNA的翻譯。細(xì)菌鐵蛋白的翻譯就受反義RNA的調(diào)控 細(xì)菌鐵蛋白是用來(lái)儲(chǔ)存細(xì)胞中過(guò)剩的鐵離子。細(xì)胞中無(wú)

25、論鐵離子濃度高或濃度低時(shí)，細(xì)菌鐵蛋白的編碼基因bfr基因都以相同速率轉(zhuǎn)錄成mRNA，而anti-bfr基因的轉(zhuǎn)錄卻受鐵離子濃度的調(diào)控。 鐵離子濃度高時(shí)，anti-bfr基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，bfr基因翻譯成細(xì)菌鐵蛋白。當(dāng)鐵離子濃度低時(shí)，anti-bfr基因大量表達(dá)，與bfr基因的mRNA形成雜合雙鏈，阻止了bfr基因的翻譯。3.6.5 克隆基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 檢測(cè)包括轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測(cè)、翻譯產(chǎn)物的檢測(cè)。作業(yè)1. 在原核細(xì)胞中表達(dá)真核基因時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？2. 都有哪些順式作用元件會(huì)影響到真核基因的表達(dá)？在構(gòu)建真核表達(dá)體系時(shí)，這些因素如何考慮？基因工程操作流程基因工程操作流程 載體的提純載體的提純目的

26、基因的獲得目的基因的獲得重組載體的構(gòu)建重組載體的構(gòu)建(酶切酶切/連接）連接）宿主細(xì)胞的培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)1.1.什么是基因工程？基因工程的操作步驟有哪些？什么是基因工程？基因工程的操作步驟有哪些？從狹義上講：基因工程又稱從狹義上講：基因工程又稱DNADNA重組技術(shù)，是指將一種或多種重組技術(shù)，是指將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入到另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿遺傳并入到另一種生物體（受體）

27、內(nèi)，使之按照人們的意愿遺傳并表達(dá)出新的性狀。表達(dá)出新的性狀。 從廣義上講：基因工程是指重組從廣義上講：基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。 上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即重組（即重組DNA技術(shù)）。技術(shù)）。 下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過(guò)程?；虍a(chǎn)物的分離純化過(guò)程。 制備目的基因（制備目的基因（切切）；）； 將目的基因與載體連接，構(gòu)建重組將目

28、的基因與載體連接，構(gòu)建重組DNADNA（接接）；）； 將重組將重組DNADNA導(dǎo)入受體生物細(xì)胞（導(dǎo)入受體生物細(xì)胞（轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)）；）； 篩選具有重組篩選具有重組DNADNA的轉(zhuǎn)化體陽(yáng)性克?。ǖ霓D(zhuǎn)化體陽(yáng)性克?。ㄔ鲈觯唬?； 使目的基因在受體生物細(xì)胞中高效表達(dá)（使目的基因在受體生物細(xì)胞中高效表達(dá)（檢檢）。）。2. 基因工程常用的工具酶有哪些？什么是限制性內(nèi)基因工程常用的工具酶有哪些？什么是限制性內(nèi)切酶？切酶？目前，常用的工具酶已有目前，常用的工具酶已有300多種。主要包括限制性內(nèi)切酶、多種。主要包括限制性內(nèi)切酶、DNA甲基化酶、聚合酶、連接酶、激酶、磷酸化酶和核酸甲基化酶、聚合酶、連接酶、激酶、磷酸化酶和核酸酶等。酶等。限制性核酸內(nèi)切酶，簡(jiǎn)稱限制酶。能夠識(shí)別能夠識(shí)別DNADNA大分大分子雙鏈上特定的核苷酸順序，并能在某一特定部位子雙鏈上特定的核苷酸順序，并能在某一特定部位將將DNADNA斷裂。斷裂。3. 什么是基因工程的載體？理想載體應(yīng)具有哪些特什么是基因工程的載體？理想載體應(yīng)具有