利用細(xì)菌鑒定卡保存菌種

1、利用細(xì)菌鑒定卡保存菌種    美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)自50年代開(kāi)始研究和推行血脂測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化。多年來(lái)，他們的血脂測(cè)定參考方法和參考材料一直作為美國(guó)和許多其他國(guó)家血脂測(cè)定的準(zhǔn)確性基礎(chǔ)；他們的血脂標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃為美國(guó)和世界上許多心血管病研究的血脂標(biāo)準(zhǔn)化和臨床實(shí)驗(yàn)室血脂分析質(zhì)量的提高做出了突出貢獻(xiàn)。了解他們的血脂標(biāo)準(zhǔn)化工作有助于我國(guó)血脂標(biāo)準(zhǔn)化的開(kāi)展。 一、概述 血脂標(biāo)準(zhǔn)化的核心是準(zhǔn)確性的可溯源性。要開(kāi)展標(biāo)準(zhǔn)化工作，首先要建立一個(gè)可靠的參考系統(tǒng)作為準(zhǔn)確性基礎(chǔ)，然后再將準(zhǔn)確性轉(zhuǎn)移到常規(guī)分析中去，或使常規(guī)分析的準(zhǔn)確性可溯源到參考系統(tǒng)所提供的準(zhǔn)確性基礎(chǔ)上。完整的參

2、考系統(tǒng)包括決定性方法、一級(jí)參考物質(zhì)、參考方法和二級(jí)參考物質(zhì)。目前美國(guó)已有總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)決定性方法，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)由于被分析物存在形式的復(fù)雜性和目前技術(shù)水平的限制，則只有參考方法。TC、TG決定性方法是由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所(NIST)建立的1，2，CDC建立并維持TC、TG、HDL-C和LDL-C參考方法3，其中TC參考方法是國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)的國(guó)家膽固醇參考系統(tǒng)(NRS/CHOL)的組成部分，TG、HDL-C和LDL-C參考方法也已為國(guó)家膽固醇教育計(jì)劃(NCEP)所推薦46。決定性方法由于其技術(shù)和成

3、本的高要求，一般只用于參考方法的評(píng)價(jià)和監(jiān)督，而參考方法往往是日常標(biāo)準(zhǔn)化工作的主要角色。目前CDC的TC、TG、HDL-C和LDL-C參考方法和用參考方法準(zhǔn)確定值的冰凍血清參考物質(zhì)實(shí)際上在為美國(guó)和世界上許多國(guó)家的血脂分析提供準(zhǔn)確性基礎(chǔ)。 轉(zhuǎn)移準(zhǔn)確性需制定轉(zhuǎn)移計(jì)劃，亦即標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃。CDC與國(guó)家心肺血液研究所(NHLBI)的血脂標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃是世界上最早的血脂標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃。此計(jì)劃主要通過(guò)經(jīng)參考方法準(zhǔn)確定值的冰凍血清物質(zhì)轉(zhuǎn)移準(zhǔn)確性。使用定值血清轉(zhuǎn)移準(zhǔn)確性是最簡(jiǎn)便、最經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)化方法，但適合大規(guī)模生產(chǎn)、貯存和運(yùn)輸?shù)难咫y免要經(jīng)過(guò)一定的處理，如冰凍、凍干等，而這些處理會(huì)在一定程度上改變血清性質(zhì)，使某些分析系統(tǒng)的

4、分析結(jié)果出現(xiàn)偏差，即產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。為此，CDC于1988年建立膽固醇參考方法實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)(CRMLN)，以便儀器、試劑生產(chǎn)廠家和臨床實(shí)驗(yàn)室直接用新鮮血清與參考方法對(duì)比分析結(jié)果。 下面將分別對(duì)CDC參考方法、參考血清、CDC-NHLBI血脂標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃和CRMLN作簡(jiǎn)單介紹。另外，質(zhì)控調(diào)查計(jì)劃在血脂標(biāo)準(zhǔn)化中也起重要作用，它們與CDC參考系統(tǒng)的關(guān)系也將作簡(jiǎn)單介紹。 二、CDC血脂參考方法 1.TC：TC參考方法為Abell-Levy-Brodie-Kendall(ALBK)法，包括皂化、提取、顯色和比色等步驟。此法移液步驟多，提取和顯色也需嚴(yán)格控制，一般情況下難以得到可靠結(jié)果。CDC能成功地用作參考方法

5、是由于他們?cè)谝韵路矫孀隽烁倪M(jìn)。(1)取樣和各部移液均用高性能自動(dòng)稀釋器操作，保證了移液精密度。(2)在取樣過(guò)程中使用了沖洗程序，即用醇性氫氧化鉀(皂化劑)將標(biāo)準(zhǔn)和樣品沖入試管中，避免了樣品(血清)和標(biāo)準(zhǔn)(乙醇溶液)由于基質(zhì)不同而對(duì)取樣準(zhǔn)確度的影響。(3)確保提取完全。由于標(biāo)準(zhǔn)和樣品的基質(zhì)不同，膽固醇在提取系統(tǒng)的兩相間的分配速度不同，故提取是ALBK法的關(guān)鍵步驟之一。(4)用計(jì)算機(jī)將標(biāo)準(zhǔn)、樣品和質(zhì)控的分析順序隨機(jī)化，以便明察各分析步驟出現(xiàn)任何系統(tǒng)性漂移。經(jīng)此改進(jìn)的ALBK法精密度能達(dá)到變異系數(shù)(CV)小于1%，一次最多可分析120個(gè)試管，與決定性方法之間的偏差約+1.6%。此法用NIST的膽固醇

6、一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 911b作標(biāo)準(zhǔn)。此法除用于TC測(cè)定外，也用于HDL-C和LDL-C參考方法中的各項(xiàng)膽固醇測(cè)定。 2.TG：TG不是單一化合物，其測(cè)定比膽固醇復(fù)雜得多。目前CDC的TG參考方法分兩部分，一部分為“凈”TG的化學(xué)測(cè)定法，另一部分為游離甘油的同位素稀釋氣相色譜質(zhì)譜法。TG化學(xué)法中用二氯甲烷提取TG，用硅酸吸附各種鄰羥基化合物和磷脂，用醇性氫氧化鉀水解TG為甘油，用高碘酸氧化甘油，使生成的甲醛與變色酸反應(yīng)后用比色法測(cè)定。取樣、提取和皂化中的各步液體轉(zhuǎn)移用稀釋器操作，氧化、還原、顯色和比色在流動(dòng)注射分析儀上進(jìn)行。每次分析的流動(dòng)注射分析部分都包括一套甘露醇標(biāo)準(zhǔn)，以便結(jié)果出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)判斷問(wèn)

7、題的來(lái)源。此法用Supelco的三油酸甘油酯和NIST的三軟脂酸甘油酯 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM1595的21混合物作標(biāo)準(zhǔn)。此法的精密度為2%6%。與決定性方法的初步對(duì)比結(jié)果顯示，此法的測(cè)定值不僅是TG，還包括(或部分包括)甘油二酯和甘油一酯。 游離甘油的測(cè)定用1，3-13C2甘油作內(nèi)標(biāo)，用甲醇沉淀蛋白并提取甘油，用正己烷洗去甲醇提取液中的少量脂質(zhì)，將甲醇提取液揮發(fā)干，經(jīng)衍生后用氣相色譜分離、質(zhì)譜檢測(cè)甘油衍生物。此法是1992年建立的，建立此法的原因是目前絕大多數(shù)TG常規(guī)分析用酶法測(cè)總甘油，測(cè)游離甘油的試劑尚不十分可靠，單獨(dú)一個(gè)測(cè)凈TG的參考方法難以滿足TG標(biāo)準(zhǔn)化的需要。 3.HDL-C和LDL-C：血

8、清不同脂蛋白之間沒(méi)有明確的界限，其理化性質(zhì)存在一定重疊，準(zhǔn)確測(cè)定他們的膽固醇含量十分困難。HDL-C和LDL-C標(biāo)準(zhǔn)化首先要定義HDL和LDL，其依據(jù)應(yīng)是目前血脂與心血管病關(guān)系研究資料中HDL和LDL的定義。目前CDC的HDL-C和LDL-C參考方法為超速離心-化學(xué)沉淀法(定量法)。用超速離心法去除血清中密度小于1.006的組分(頂部組分，主要為乳糜微粒和極低密度脂蛋白)，測(cè)定底部組分(BF)膽固醇(BFC)，用肝素-錳離子試劑沉淀BF中的LDL，測(cè)定上清液中的HDL-C，從BFC中減去HDL-C得LDL-C。BFC和 hDL-C的測(cè)定均采用ALBK法。LDL-C中包括脂蛋白(a)和中間密度脂

9、蛋白。 4.血清參考物質(zhì)：CDC血清參考物質(zhì)一直是CDC血脂參考系統(tǒng)的重要組成部分，絕大多數(shù)準(zhǔn)確性轉(zhuǎn)移都是通過(guò)這些物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。CDC血清參考物質(zhì)是經(jīng)參考方法準(zhǔn)確定值的冰凍混合血清。這些物質(zhì)已有幾十年的應(yīng)用歷史，而且應(yīng)用范圍廣，是目前性質(zhì)明確、質(zhì)量好的血脂分析物質(zhì)。它們以往的應(yīng)用主要是TC、TG和HDL-C。LDL-C的標(biāo)準(zhǔn)化工作剛剛開(kāi)始，初步研究證明LDL-C對(duì)冰凍比其它血脂指標(biāo)敏感，血清冰凍后LDL-C下降，但在參考方法中LDL-C下降發(fā)生在冰凍初期，在以后的貯存中不再下降，說(shuō)明冰凍血清用于LDL-C參考方法的標(biāo)準(zhǔn)化是可行的。CDC血清參考物質(zhì)的制備過(guò)程大致如下。取來(lái)自不同個(gè)體的血清，測(cè)定血

10、脂后冰凍(-70)保存，按血脂水平需要將適當(dāng)水平的血清化凍后混合。高膽固醇血清用添加血清脂蛋白(乙醇沉淀法制備)的方法制備，高TG血清添加蛋黃提取物?；旌涎鍨V過(guò)0.22m的濾膜后分裝于玻璃小瓶中，冰凍保存。隨機(jī)取一定數(shù)量的小瓶，用參考方法分析血脂12次，每次分析兩瓶，每瓶分析兩份，用所得48個(gè)結(jié)果檢驗(yàn)均勻性和計(jì)算參考值。 三、CDC-NHLBI血脂標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃 此計(jì)劃始于1957年。建立此計(jì)劃的最初原因是當(dāng)時(shí)許多血脂水平與冠心病關(guān)系研究要求血脂分析的可靠性和實(shí)驗(yàn)室間分析結(jié)果的可比性。到目前為止己為100多個(gè)美國(guó)和國(guó)際心血管病研究提供血脂分析標(biāo)準(zhǔn)化。除此之外，它還為血脂分析方法學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室、質(zhì)控

11、調(diào)查計(jì)劃中的參考實(shí)驗(yàn)室和血脂分析儀器試劑生產(chǎn)廠家實(shí)驗(yàn)室中血脂分析的質(zhì)量提高與保證做出了突出貢獻(xiàn)。此計(jì)劃的目前版本如下。 1.對(duì)象：美國(guó)國(guó)內(nèi)的血脂研究實(shí)驗(yàn)室、參加流行病學(xué)和臨床研究的實(shí)驗(yàn)室、公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室、質(zhì)控調(diào)查計(jì)劃和標(biāo)準(zhǔn)化活動(dòng)中的參考實(shí)驗(yàn)室；國(guó)際上參加重要流行病學(xué)和臨床研究的實(shí)驗(yàn)室。 2.標(biāo)準(zhǔn)化程序：分三階段。第一階段為初步評(píng)價(jià)階段，評(píng)價(jià)申請(qǐng)者的分析質(zhì)量及所用分析系統(tǒng)有無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。申請(qǐng)者分析CDC提供的6種冰凍血清6次，每次每種血清分析2份；收集6個(gè)病人血清，將每個(gè)病人血清一分為二，一組在分析CDC血清的同時(shí)分析血脂一次，每種血清分析2份，另一組冰凍后送CRMLN實(shí)驗(yàn)室。若申請(qǐng)者分析結(jié)果滿足

12、此計(jì)劃的分析質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且無(wú)基質(zhì)效應(yīng)，進(jìn)入第二階段。第二階段為主要評(píng)價(jià)階段，評(píng)價(jià)申請(qǐng)者血脂分析的精密度和準(zhǔn)確度及維持分析質(zhì)量的能力。申請(qǐng)者分析CDC提供的9種冰凍血清和2種自己血清8次，每次每種血清分析2份。第三階段評(píng)價(jià)申請(qǐng)者長(zhǎng)期維持分析質(zhì)量的能力。申請(qǐng)者每季度分析9種CDC冰凍血清和2種自己血清4次，每次每種血清分析2份。進(jìn)入此階段的申請(qǐng)者，CDC發(fā)給證書(shū)，申請(qǐng)者每通過(guò)一次季度考核，CDC發(fā)給膠簽一個(gè)，貼在證書(shū)的相應(yīng)位置。證書(shū)每年換發(fā)一次。 四、CRMLN 建立此網(wǎng)絡(luò)的背景是有些血脂分析系統(tǒng)對(duì)凍冷血清參考材料有基質(zhì)效應(yīng)，它們的分析質(zhì)量不能通過(guò)CDC冰冷材料溯源到參考方法上來(lái)。1988年CDC建

13、立 了CRMLN，以便于生產(chǎn)廠家和臨床實(shí)驗(yàn)室直接用新鮮血清與參考方法對(duì)比分析結(jié)果。目前此網(wǎng)絡(luò)有美國(guó)實(shí)驗(yàn)室6家，國(guó)際實(shí)驗(yàn)室6家，其中的一家亞洲實(shí)驗(yàn)室為日本大阪癌癥與心血管病醫(yī)學(xué)中心。網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室均采用ALBK法測(cè)定TC，TG和HDL-C多采用專(zhuān)用對(duì)比法，TG為酶法(包括游離甘油和總甘油兩部分)，HDL-C為硫酸葡聚糖(50K MW)-鎂離子沉淀法。網(wǎng)絡(luò)與實(shí)驗(yàn)室間準(zhǔn)確性轉(zhuǎn)移方案如下。 1.生產(chǎn)廠家：收集新鮮血清4050份，將每份血清一分為二，一組4貯存，在兩天內(nèi)開(kāi)始分析血脂，在至少5次分析(89份血/次)中完成。另一組冰凍保存，與分析結(jié)果一起送網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。質(zhì)量合格后CDC發(fā)給證書(shū)。分析系統(tǒng)做明顯改動(dòng)

14、、室內(nèi)質(zhì)控出現(xiàn)漂移時(shí)，需重新進(jìn)行對(duì)比。 2.臨床實(shí)驗(yàn)室：收集至少6份新鮮血清，將每種血清一分為二，一組分析血脂3次，每次每種血清分析兩份。另一組在收集后的當(dāng)天，送往網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，否則冰凍后送網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。合格后發(fā)證書(shū)，有效期半年。 應(yīng)該指出，目前此計(jì)劃的主要服務(wù)對(duì)象是生產(chǎn)廠家，一方面廠家產(chǎn)品質(zhì)量影響面廣，保證廠家產(chǎn)品質(zhì)量是血脂標(biāo)準(zhǔn)化的有效手段。另一方面目前食品與藥品管理局(FDA)也要求膽固醇產(chǎn)品在上市前的報(bào)批資料中包括該產(chǎn)品分析結(jié)果與CRMLN分析結(jié)果的對(duì)比資料。臨床實(shí)驗(yàn)室目前參加此計(jì)劃的較少，更多的參加美國(guó)國(guó)會(huì)1988年通過(guò)的臨床實(shí)驗(yàn)室提高分析質(zhì)量修正案(CLIA88)要求的質(zhì)控調(diào)查計(jì)劃。 五

15、、質(zhì)控調(diào)查計(jì)劃與CDC參考系統(tǒng) 質(zhì)控調(diào)查計(jì)劃在血脂標(biāo)準(zhǔn)化中也起重要作用。它們有效地提供實(shí)驗(yàn)室間精密度和各實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確度情況。CLIA88規(guī)定質(zhì)控調(diào)查作為實(shí)驗(yàn)室分析質(zhì)量的評(píng)價(jià)手段，并批準(zhǔn)了13個(gè)質(zhì)控調(diào)查計(jì)劃，其中影響最大的為病理學(xué)家協(xié)會(huì)(CAP)的計(jì)劃。血脂質(zhì)控調(diào)查計(jì)劃每年進(jìn)行三次，每次5個(gè)水平，血脂指標(biāo)包括TC、TG和HDL-C。CDC自1984年為CAP和美國(guó)生物分析學(xué)家協(xié)會(huì)(AAB)等質(zhì)控調(diào)查計(jì)劃的質(zhì)控材料測(cè)定靶值。但這些靶值并沒(méi)有直接用于準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)(TC除外)，原因是多數(shù)質(zhì)控物質(zhì)為凍干血清，有些分析系統(tǒng)對(duì)此有基質(zhì)效應(yīng)，使調(diào)查總均值與靶值之間有偏差。但靶值的提供是研究質(zhì)控物質(zhì)性質(zhì)、各分析系統(tǒng)

16、基質(zhì)效應(yīng)大小及質(zhì)控物質(zhì)改進(jìn)等標(biāo)準(zhǔn)化中的重要問(wèn)題所必需的。 百事通  參考文獻(xiàn) 1 Cohen A, Hertz HS, mandel J, et al. Total serum cholesterol by isotope dilution/mass spectrometry: a candidate definitive method. Clin Chem, 1980,26:854-860. 2 Ellerbe P, Sniegoski LT, Welch MJ. Isotope dilution mass spectrometry as a candidate definitiv

17、e method for determining total glycerides and triglycerides in serum. clin Chem, 1995, 41:397-404. 3 Myers GL, Cooper GR, Henderson LO, et al. Standardization of lipid and lipoprotein measurements. In: Rifai N, Warnick GR, Dominiczak MH, eds. handbook of Lipoprotein testing. AACC Press: Washington DC, 1997, 223-250. 4 Stein EA, Myers GL. National Cholesterol Education Program recommendations for triglyceride measurement: executive summary. Clin Chem, 1995,41:1421-1426. 5 Warnick GR, Wood PD. National Cholesterol Education Program recommendations for measureme