人氣管上皮細胞對綠膿桿菌抗菌作用觀察

1、人氣管上皮細胞對綠膿桿菌抗菌作用觀察         11-04-21 13:35:00     編輯：studa20               作者：劉燕翔 趙麗君 隋鵬諾 劉珍 王伯瑤 黃寧 吳琦【摘要】  目的：探討呼吸道上皮細胞與呼吸道致病菌之間的相互關(guān)系，觀察呼吸道上皮細胞對綠膿桿菌的抗菌作用。方法：(1)貼壁生長的

2、人呼吸道上皮細胞株HBE16與綠膿桿菌標準株ATCC27853共孵育，慶大霉素殺死胞外菌，動態(tài)觀察上皮細胞內(nèi)活細菌數(shù);(2)HBE16細胞與綠膿桿菌共同懸浮于細胞培養(yǎng)基，在不同孵育時間點用平板菌落計數(shù)法計數(shù)活菌數(shù)。結(jié)果：綠膿桿菌不能在HBE16細胞內(nèi)生長，并被細胞逐漸清楚。懸浮狀態(tài)下的HBE16細胞對綠膿桿菌有一定殺菌作用。結(jié)論：呼吸道上皮細胞對胞內(nèi)外綠膿桿菌的抗菌作用，可能是呼吸道抵抗細菌感染的一種天然免疫防御機制。 【關(guān)鍵詞】  呼吸道上皮細胞;綠膿桿菌;抗菌作用機體在生物進化過程中，為抵抗微生物的侵襲，發(fā)展出各種抗感染防御機制。機體的免疫系統(tǒng)分為天然免疫和獲得性免疫，他們共同作

3、用，使機體在復(fù)雜的外環(huán)境中，維持正常的生命過程。在發(fā)生學(xué)上最古老的防御機制是天然免疫，其在對抗病原微生物的感染過程中所發(fā)揮的作用越來越引起人們的注意1。上皮細胞是天然免疫的重要組成部分，構(gòu)成機體抵御外來病原微生物的首要防線。研究顯示泌尿道、消化道及口腔上皮細胞對細菌有直接抗菌作用2-3。呼吸道上皮細胞是呼吸道防御微生物感染的第一道屏障，綠膿桿菌在自然界中廣泛存在，是肺囊性纖維化病人和醫(yī)院內(nèi)感染最常見的條件致病菌之一4-6。綠膿桿菌對正常人不致病，只在免疫功能低下或粘膜上皮細胞受損和功能失常的時候才引起感染7。呼吸道上皮細胞在防御這類機會致病菌感染時可能發(fā)揮了重要的作用。為了了解呼吸道上皮細胞與

4、綠膿桿菌之間的相互關(guān)系，本實驗觀察呼吸道上皮細胞對綠膿桿菌的抗菌作用。1 材料與方法1.1 材料綠膿桿菌標準株ATCC27853株、人呼吸道上皮細胞株HBE16為本實驗室保存。酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉為OXOID公司產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸購自GIBCO公司，新生牛血清購自Hyclon公司，TritonX100購自Sigma，其余試劑為國產(chǎn)分析純。1.2 細菌的準備從LB平板中挑取單個菌落接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)3-5h，取100l菌液涂布接種于固體LB培養(yǎng)板上。倒置于37°C孵箱培養(yǎng)，16h后收集活菌。用PBS洗滌細菌三次，紫外分光光度計測定

5、650nmOD值，確定細菌的濃度(綠膿桿菌OD650=1.3相當于每mL細菌量109)。1.3 細胞的準備HBE16細胞用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基(無抗生素)，37°C，5%CO2孵箱常規(guī)培養(yǎng)。待細胞進入快速生長期，PBS洗滌，胰酶消化，收集并計數(shù)確定細胞數(shù)量。將HBE16細胞以8×104/孔接種于48孔板，經(jīng)48小時生長細胞匯合后(細胞數(shù)大約為1.2×105/孔)進行實驗。1.4 單層貼壁HBE16細胞對胞內(nèi)綠膿桿菌生長的影響HBE16細胞用PBS洗三次，每孔加入200l DMEM培養(yǎng)基稀釋好的ATCC2785細菌(細菌與細胞的數(shù)量比分別是10:1，2

6、0:1，50:1)，每個實驗組做3復(fù)孔。放入37°C，5%CO2孵箱孵育兩小時。用PBS洗細胞三次，每孔加入含慶大霉素(100g·mL-1)及10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基500l，37°C，5%CO2孵箱孵育兩小時以殺死細胞外的綠膿桿菌(慶大霉素不進入細胞內(nèi)，只殺死胞外的細菌)。分別于實驗的4小時、24小時用TritonX100裂解細胞，釋放出細胞內(nèi)的活細菌，用平板菌落計數(shù)法計算胞內(nèi)活菌數(shù)。實驗重復(fù)3 次,數(shù)驗數(shù)據(jù)以SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗。1.5 懸浮狀態(tài)HBE16細胞對綠膿桿菌的抗菌實驗HBE16細胞用含10%

7、新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基(無抗生素)，37°C，5%CO2常規(guī)培養(yǎng)。待細胞進入快速生長期，PBS洗滌，胰酶消化，收集并計數(shù)確定細胞數(shù)量。細菌與細胞數(shù)按10：1的比例混合，加入EP管(體積為200l)，細胞的終濃度為1×105個/ml，細菌的終濃度為1×106個/ml。實驗分二組：對照組只加細菌;實驗組加入細胞和細菌，試驗采用三復(fù)管。放入37，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱，分別于孵育后的15min、30min、60min、90min、120min，加入200l 濃度為0.25%的Tritonx100，放置15 min，作10倍系列稀釋,每個稀釋度取100ul 樣品涂布于LB 瓊脂平板, 37 溫箱培養(yǎng),菌落計數(shù)。實驗重復(fù)3 次,實驗數(shù)據(jù)以SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗。2 結(jié)果2.1 綠膿桿菌在貼壁生長HBE16細胞內(nèi)的存活情況HBE16細胞與綠膿桿菌共孵育(細菌與細胞數(shù)比值分別為10：1，20：1，50：1)，以慶大霉素殺滅細胞外