痛必定注射液對(duì)慢性結(jié)扎損傷模型大鼠脊髓背角c-fos和P物質(zhì)的影響

1、痛必定注射液對(duì)慢性結(jié)扎損傷模型大鼠脊髓背角c-fos和P物質(zhì)的影響         08-05-16 15:12:00     作者：張昊旻    編輯：studa20【摘要】  目的痛必定注射液是具有良好鎮(zhèn)痛效果的中成藥，擬通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究了其鎮(zhèn)痛機(jī)理。方法采用免疫組化的方法，研究痛必定注射液對(duì)CCI（慢性結(jié)扎損傷）模型大鼠脊髓背角c-fos基因表達(dá)和P物質(zhì)含量的影響。結(jié)果痛必定注射液能明顯降低CCI大鼠脊髓背角c-fos基因

2、和P物質(zhì)含量。結(jié)論該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了痛必定注射液對(duì)CCI大鼠具有很好的鎮(zhèn)痛作用，減少脊髓背角神經(jīng)元對(duì)傳入的傷害性刺激的反應(yīng),可能是其發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的途徑之一。 【關(guān)鍵詞】  痛必定注射液 c-fos P物質(zhì) 免疫組化    痛必定注射液是由4種中藥（有效成分或部位）組成的具有良好鎮(zhèn)痛作用的中成藥。其動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用均顯示和度冷丁1，2有相似的鎮(zhèn)痛效果，但無(wú)明顯成癮性。其鎮(zhèn)痛作用產(chǎn)生的機(jī)理尚未完全清楚，且近年來(lái)研究表明，外周傷害性刺激等因素可激活脊髓內(nèi)即刻早期基因c-fos并表達(dá)fos蛋白36；P物質(zhì)(substance P ,SP)被認(rèn)為是脊髓傷害性信息傳遞物

3、質(zhì)7,在脊髓痛覺(jué)信息傳遞過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用8，二者是疼痛在分子水平的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫組化方法研究了痛必定注射液對(duì)CCI（chronic constriction injur，慢性結(jié)扎損傷）模型大鼠脊髓背角淺層c-fos基因表達(dá)和SP含量的影響，初步探討痛必定注射液的鎮(zhèn)痛機(jī)理。1  材料1.1  動(dòng)物成年Wistar大鼠，雌雄各半，體重（200±20） g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2  主要試劑痛必定注射液40 mg/支，加入生理鹽水2 ml，即成為濃度20 mg/ml溶液。按20 mg/kg體重劑量腹腔注射。兔抗大鼠c-fos多克隆抗體(

4、Santa CruzBiotechnology Inc. USA ,北京中山技術(shù)有限公司分裝)，SP免疫組化染色試劑盒為武漢博士德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，DAB染色試劑盒為北京中山技術(shù)有限公司產(chǎn)品，曲拉通X-100(Triton-100)為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。2  方法2.1  分組、用藥、造模Wistar大鼠30只，隨機(jī)分成A（正常組）、B（CCI造模組）、C（CCI+痛必定）3組。將B組和C組大鼠在無(wú)菌條件下1%異戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，暴露左側(cè)的坐骨神經(jīng)干，在中部45 mm范圍內(nèi)，用4-0號(hào)鉻制羊腸線打34個(gè)結(jié)，以引起小腿微微抽動(dòng)為宜，然后逐層

5、縫合。另一側(cè)行假手術(shù)。14 d后用特制大鼠固定籠固定大鼠，SHXYT型小型動(dòng)物壓痛儀（深圳凱強(qiáng)利股份有限公司），分別測(cè)量雙側(cè)后肢的痛閾值，左側(cè)痛閾顯著降低，并結(jié)合行為學(xué)改變，認(rèn)為造模成功。C組按20 mg/kg體重劑量連續(xù)5 d腹腔注射痛必定注射液，B組同時(shí)給予同劑量生理鹽水。2.2  取材、切片1%異戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定，快速開(kāi)胸，暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心耳，進(jìn)行心臟灌注。先以無(wú)菌生理鹽水100 ml快速?zèng)_去血液，至流出的液體變清亮，隨后用4含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)先快后慢灌流固

6、定約30 min。打開(kāi)脊柱，取脊髓L3L5節(jié)段置于4含40 g/L多聚甲醛PBS中后固定4 h , 再移入4含300 g/L蔗糖的0.1 mol/L PBS(pH7.4)中直至組織沉底。冰凍切片機(jī)-20冠狀連續(xù)切片，片厚5 m。選取結(jié)構(gòu)完整者貼于APES處理過(guò)的玻片上。2.3  免疫組織化學(xué)反應(yīng)2.4  免疫組化對(duì)照實(shí)驗(yàn)非特異性對(duì)照用正常羊血清代替c-fos或SP抗體，陰性對(duì)照用PBS代替c-fos或SP抗體,其它步驟同上。2.5  圖像觀察、分析用Olympus顯微鏡觀察每一張切片，F(xiàn)os蛋白的測(cè)定方法采用免疫陽(yáng)性（F-LI）神經(jīng)元計(jì)數(shù)法，用低倍鏡下每張切片脊髓

7、背角所有F-LI數(shù)目表示數(shù)量（五張切片，取均值；單位：個(gè)）。SP的結(jié)果采用北京航空航天大學(xué)圖像中心研制的CMIAS-多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)（版本4.0）進(jìn)行分析，每張切片中SP免疫活性物質(zhì)（SP-LI）陽(yáng)性面積值（五張切片，取均值；單位：陽(yáng)性單位）。2.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 9.0軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組內(nèi)比較用t檢驗(yàn)；組間比較用單因素方差分析，并以q檢驗(yàn)比較兩兩差異，P0.05認(rèn)為差異顯著。3  結(jié)果3.1  fos蛋白表達(dá)情況F-LI陽(yáng)性神經(jīng)元呈棕黃色，定位于細(xì)胞核，呈圓形或卵圓形，胞漿和核仁均不染色或染色較淺

8、，易與周?chē)尘皡^(qū)別開(kāi)來(lái)。光鏡下見(jiàn)脊髓背角淺層內(nèi)有大量的fos免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示：B組脊髓背角F-LI神經(jīng)元數(shù)目明顯高于正常組(P<0.01，t=16.381)；與B組比較，C組左側(cè)脊髓背角的F-LI神經(jīng)元數(shù)目明顯降低(P<0.01，t=7.564)。免疫組化染色所顯示的對(duì)照實(shí)驗(yàn)均呈陰性反應(yīng)(見(jiàn)表1)。3.2  P物質(zhì)含量情況光鏡下可見(jiàn)SP免疫陽(yáng)性反應(yīng)物主要分布于脊髓背角淺層,以外側(cè)帶最為濃密。脊髓的其他部位不著色或呈淡黃色。計(jì)算機(jī)圖像分析檢測(cè)結(jié)果顯示:B組脊髓背角SP-LI的含量明顯高于右側(cè)和正常組(P<0.01，t=8.576)；與B組比較，C組大鼠脊髓背角的SP-LI含量明顯降低(P<0.01，t=9.258，見(jiàn)表1)。表1  各組大鼠脊髓背角淺層F-LI和SP-LI含量比較（略）4  討論    原癌基因c-fos是一種存在于正常神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)的即刻早期基因，fos是其蛋白表達(dá)產(chǎn)物。正常情況下，