實驗11-抗生素的抑菌試驗

1、抗生素的抑菌試驗一 目的要求1、掌握紙片法測定抗生素抗菌作用的基本方法2、了解抗生素的抗菌譜二實驗原理抗生素是某些植物與微生物生長到對數(shù)期前后所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，其在低濃度下 可其它微生物生長具抑制作用或殺死作用的物質(zhì)。抗生素對敏感微生物的作用機理分為抑制細胞壁的形成、破壞細胞膜的功能、干擾蛋白質(zhì)合成及阻礙核酸的合成。由于不同微生物對不同抗生素的敏感性不一樣，抗生素的作用對象就有一定的范圍， 這種作用范圍成為抗生素的抗菌譜，作用對象廣的抗生素稱為廣譜抗生素，作用對象少的 抗生素稱為窄譜抗生素。而且當某種抗生素長時間用于敏感微生物生長后，即使同一種菌 的不同菌株對不同藥物的敏感性也常發(fā)生改變，

2、甚至出現(xiàn)耐藥菌株，亦即產(chǎn)生抗性菌株， 則抗生素將失去對抗性菌株生長的抵制，只以采用新的抗生素才可能控制抗性菌株的生長 與繁殖，因而不斷開發(fā)新的抗生素是保健人類身體健康的重要工作。新抗生素產(chǎn)生菌的分 離篩選應(yīng)通過拮抗菌發(fā)酵，然后以發(fā)酵產(chǎn)物進行抗菌活性實驗，根據(jù)實驗結(jié)果而獲得產(chǎn)新 抗生素的菌株。微生物代謝產(chǎn)物的抗菌活性常以管碟法與紙法進行檢測，根據(jù)透明抑菌圈 的有無與大小作為依據(jù)。三實驗器材1、菌種 枯草桿菌、大腸桿菌。2、培養(yǎng)基 MH (Mueller-Hintion)瓊脂。3、試劑 青霉素、鏈霉素。四方法步驟1、無菌濾紙片 以孔徑6mm打孔器將濾紙打為圓形紙片，放入培養(yǎng)皿內(nèi)，121c蒸汽濕熱滅

3、菌，100c烘干2h。2、抗生素溶液制備 將取適量青霉素、鏈霉素，以無菌水溶解。3、指示菌懸浮液的制備 枯草桿菌、大腸桿菌斜面菌種分別以無菌水洗下菌苔細胞， 到入無菌三角瓶內(nèi)，制備適宜濃度的細胞懸浮液。4、混菌平板制備取批示菌細胞懸浮液 1mL加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再加入溫度為4345C的PDA培養(yǎng)基或牛肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基 20mL,立即振蕩使細胞與培養(yǎng)基混合均 勻，靜置冷凝。5、平板加抗生素溶液 將濾紙片在抗生素溶液中充分浸泡 2min以上，然后將紙片放 于混菌平板上，每皿呈三角形放 3點，每點貼放紙片2張。6、培養(yǎng)與觀察 將平板放于33H左右的溫度培養(yǎng)，每24h測量一次透明抑菌圈直徑， 共測

4、量3次五結(jié)果1、實驗結(jié)果測量每個平板3個抑菌圈直徑，計算每次測量各平板3個抑菌圈直徑的平均值，結(jié)果填于表內(nèi)。表1青霉素對供試菌的抑菌效果（抑菌圈直徑：mm）培養(yǎng)時間菌種名 244896120144168表2鏈霉素對供試菌的抑菌效果（抑菌圈直徑：mm）培養(yǎng)時間菌種名 2448961201441682、結(jié)果分析1菌液制備1）對數(shù)生長法：從瓊脂平板上選取至少 35個形態(tài)特征一致的菌落，用接種環(huán)轉(zhuǎn)移 至含45ml的肉湯培養(yǎng)管（如胰酶消化大豆肉湯）中，35c培養(yǎng)26h。用無菌鹽水或肉湯 調(diào)整菌液濁度相當于麥氏標準。2）直接菌落法：從培養(yǎng)18-24h的非選擇性培養(yǎng)基（如血瓊脂）平板上，挑取單個菌 落，直接

5、用肉湯或無菌鹽水制成麥氏標準濁度的懸液。2接種細菌懸液制備后15min內(nèi)接種至MH瓊脂平板。用無菌棉拭醮取菌懸液，在管內(nèi)壁液 面上方旋轉(zhuǎn)緊壓，將多余菌液擠去，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。3貼藥敏紙片涂布后的平板在室溫下干燥35min,用紙片分配器或無菌銀子將紙片貼于瓊脂表面并 輕壓，使紙片與瓊脂表面完成接觸。各紙片中心相距應(yīng)大于24mm,紙片貼上后就不能再移動位置。4培養(yǎng)將平板倒置放入35c孵箱（厭氧菌敏平板應(yīng)放置于5%10%CO環(huán)境中），1618h讀取 結(jié)果，葡萄球菌和腸球菌必須培養(yǎng) 24h以檢測對苯睡西林和萬古霉素的耐藥性。5結(jié)果判斷抑菌圈的直徑（包含紙片的直徑），以毫米數(shù)報告（取整數(shù)）。根據(jù)

6、CLS判定標準測量 抑菌圈直徑大小可以判斷細菌對該抗生素是敏感、中介還是耐藥，如下圖。敏感（S）:表示常規(guī)劑量的測定藥物在體內(nèi)所達到的濃度能抑制或殺滅待測菌。中介（I）:不是敏感性的度量，而是一個 緩沖區(qū)”，用以防止因微小的技術(shù)因素失控 導(dǎo)致的結(jié)果偏差，因而其臨床意義是不確定的，故不應(yīng)作臨床報告。耐藥（R）:表示常規(guī)劑量的測定藥物在體內(nèi)達到有效濃度時不能抑制待測菌生長。五、結(jié)果與思考題1、記錄各菌對不同藥物的敏感程度2、思考題（1）圓紙片藥敏試驗操作時應(yīng)注意什么事項（2）試述藥敏試驗的意義實驗十二細菌對抗生素的藥物敏感試驗各種微生物對化學藥物、抗生素等敏感性各異，即使同一種菌的不同菌株對不同藥

7、物的敏感性也常發(fā)生改變，甚至出現(xiàn)耐藥菌株，亦即產(chǎn)生耐藥性變異。因此，測定細菌對藥物的敏感程度，對于臨床治療中選擇用藥，及時控制感染具有重要意義。常用方法有紙片彌散法和試管稀釋法。實驗?zāi)康囊?、紙片法材?菌種：枯草桿菌、大腸桿菌。2培養(yǎng)基：普通瓊脂平皿培養(yǎng)基。3抗菌藥物：青霉素、鏈霉素、氯霉素、慶大霉素紙片。4其他：無菌棉棒、鑷子、酒精缸等。方法1用滅菌棉棒分別沾取金黃色葡萄球菌1 號和 2 號及痢疾桿菌肉湯培養(yǎng)物，分別涂布在瓊脂表面，每種菌涂一個平皿（沾菌棉棒用后，放入消毒缸中，勿亂丟 ）。2用小鑷子沾酒精燒灼消毒，待冷后鑷取一種藥物紙片，貼在涂有細菌的平皿上，然后將鑷子再沾酒精燒灼后，鑷取另一種藥物紙片，貼布于瓊脂平皿另一處，如此將幾種藥物紙片貼完，各紙片距