實(shí)驗(yàn)11-抗生素的抑菌試驗(yàn)

1、抗生素的抑菌試驗(yàn)一 目的要求1、掌握紙片法測定抗生素抗菌作用的基本方法2、了解抗生素的抗菌譜二實(shí)驗(yàn)原理抗生素是某些植物與微生物生長到對數(shù)期前后所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，其在低濃度下 可其它微生物生長具抑制作用或殺死作用的物質(zhì)?？股貙γ舾形⑸锏淖饔脵C(jī)理分為抑制細(xì)胞壁的形成、破壞細(xì)胞膜的功能、干擾蛋白質(zhì)合成及阻礙核酸的合成。由于不同微生物對不同抗生素的敏感性不一樣，抗生素的作用對象就有一定的范圍， 這種作用范圍成為抗生素的抗菌譜，作用對象廣的抗生素稱為廣譜抗生素，作用對象少的 抗生素稱為窄譜抗生素。而且當(dāng)某種抗生素長時間用于敏感微生物生長后，即使同一種菌 的不同菌株對不同藥物的敏感性也常發(fā)生改變，

2、甚至出現(xiàn)耐藥菌株，亦即產(chǎn)生抗性菌株， 則抗生素將失去對抗性菌株生長的抵制，只以采用新的抗生素才可能控制抗性菌株的生長 與繁殖，因而不斷開發(fā)新的抗生素是保健人類身體健康的重要工作。新抗生素產(chǎn)生菌的分 離篩選應(yīng)通過拮抗菌發(fā)酵，然后以發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抗菌活性實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果而獲得產(chǎn)新 抗生素的菌株。微生物代謝產(chǎn)物的抗菌活性常以管碟法與紙法進(jìn)行檢測，根據(jù)透明抑菌圈 的有無與大小作為依據(jù)。三實(shí)驗(yàn)器材1、菌種 枯草桿菌、大腸桿菌。2、培養(yǎng)基 MH (Mueller-Hintion)瓊脂。3、試劑 青霉素、鏈霉素。四方法步驟1、無菌濾紙片 以孔徑6mm打孔器將濾紙打?yàn)閳A形紙片，放入培養(yǎng)皿內(nèi)，121c蒸汽濕熱滅

3、菌，100c烘干2h。2、抗生素溶液制備 將取適量青霉素、鏈霉素，以無菌水溶解。3、指示菌懸浮液的制備 枯草桿菌、大腸桿菌斜面菌種分別以無菌水洗下菌苔細(xì)胞， 到入無菌三角瓶內(nèi)，制備適宜濃度的細(xì)胞懸浮液。4、混菌平板制備取批示菌細(xì)胞懸浮液 1mL加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再加入溫度為4345C的PDA培養(yǎng)基或牛肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基 20mL,立即振蕩使細(xì)胞與培養(yǎng)基混合均 勻，靜置冷凝。5、平板加抗生素溶液 將濾紙片在抗生素溶液中充分浸泡 2min以上，然后將紙片放 于混菌平板上，每皿呈三角形放 3點(diǎn)，每點(diǎn)貼放紙片2張。6、培養(yǎng)與觀察 將平板放于33H左右的溫度培養(yǎng)，每24h測量一次透明抑菌圈直徑， 共測

4、量3次五結(jié)果1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果測量每個平板3個抑菌圈直徑，計(jì)算每次測量各平板3個抑菌圈直徑的平均值，結(jié)果填于表內(nèi)。表1青霉素對供試菌的抑菌效果（抑菌圈直徑：mm）培養(yǎng)時間菌種名 244896120144168表2鏈霉素對供試菌的抑菌效果（抑菌圈直徑：mm）培養(yǎng)時間菌種名 2448961201441682、結(jié)果分析1菌液制備1）對數(shù)生長法：從瓊脂平板上選取至少 35個形態(tài)特征一致的菌落，用接種環(huán)轉(zhuǎn)移 至含45ml的肉湯培養(yǎng)管（如胰酶消化大豆肉湯）中，35c培養(yǎng)26h。用無菌鹽水或肉湯 調(diào)整菌液濁度相當(dāng)于麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。2）直接菌落法：從培養(yǎng)18-24h的非選擇性培養(yǎng)基（如血瓊脂）平板上，挑取單個菌 落，直接

5、用肉湯或無菌鹽水制成麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度的懸液。2接種細(xì)菌懸液制備后15min內(nèi)接種至MH瓊脂平板。用無菌棉拭醮取菌懸液，在管內(nèi)壁液 面上方旋轉(zhuǎn)緊壓，將多余菌液擠去，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。3貼藥敏紙片涂布后的平板在室溫下干燥35min,用紙片分配器或無菌銀子將紙片貼于瓊脂表面并 輕壓，使紙片與瓊脂表面完成接觸。各紙片中心相距應(yīng)大于24mm,紙片貼上后就不能再移動位置。4培養(yǎng)將平板倒置放入35c孵箱（厭氧菌敏平板應(yīng)放置于5%10%CO環(huán)境中），1618h讀取 結(jié)果，葡萄球菌和腸球菌必須培養(yǎng) 24h以檢測對苯睡西林和萬古霉素的耐藥性。5結(jié)果判斷抑菌圈的直徑（包含紙片的直徑），以毫米數(shù)報(bào)告（取整數(shù)）。根據(jù)

6、CLS判定標(biāo)準(zhǔn)測量 抑菌圈直徑大小可以判斷細(xì)菌對該抗生素是敏感、中介還是耐藥，如下圖。敏感（S）:表示常規(guī)劑量的測定藥物在體內(nèi)所達(dá)到的濃度能抑制或殺滅待測菌。中介（I）:不是敏感性的度量，而是一個 緩沖區(qū)”，用以防止因微小的技術(shù)因素失控 導(dǎo)致的結(jié)果偏差，因而其臨床意義是不確定的，故不應(yīng)作臨床報(bào)告。耐藥（R）:表示常規(guī)劑量的測定藥物在體內(nèi)達(dá)到有效濃度時不能抑制待測菌生長。五、結(jié)果與思考題1、記錄各菌對不同藥物的敏感程度2、思考題（1）圓紙片藥敏試驗(yàn)操作時應(yīng)注意什么事項(xiàng)（2）試述藥敏試驗(yàn)的意義實(shí)驗(yàn)十二細(xì)菌對抗生素的藥物敏感試驗(yàn)各種微生物對化學(xué)藥物、抗生素等敏感性各異，即使同一種菌的不同菌株對不同藥

7、物的敏感性也常發(fā)生改變，甚至出現(xiàn)耐藥菌株，亦即產(chǎn)生耐藥性變異。因此，測定細(xì)菌對藥物的敏感程度，對于臨床治療中選擇用藥，及時控制感染具有重要意義。常用方法有紙片彌散法和試管稀釋法。實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、紙片法材?菌種：枯草桿菌、大腸桿菌。2培養(yǎng)基：普通瓊脂平皿培養(yǎng)基。3抗菌藥物：青霉素、鏈霉素、氯霉素、慶大霉素紙片。4其他：無菌棉棒、鑷子、酒精缸等。方法1用滅菌棉棒分別沾取金黃色葡萄球菌1 號和 2 號及痢疾桿菌肉湯培養(yǎng)物，分別涂布在瓊脂表面，每種菌涂一個平皿（沾菌棉棒用后，放入消毒缸中，勿亂丟 ）。2用小鑷子沾酒精燒灼消毒，待冷后鑷取一種藥物紙片，貼在涂有細(xì)菌的平皿上，然后將鑷子再沾酒精燒灼后，鑷取另一種藥物紙片，貼布于瓊脂平皿另一處，如此將幾種藥物紙片貼完，各紙片距