胎盤間充質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng) 2016.07.21

1、胎盤間充質(zhì)干細胞的分別，原代與繼代培育及鑒定劉亭 2016.7.21名目前言21分別制備PMSC組織的選取32臍帶，胎盤MSC的分別與純化52.1胎盤組織的獵取，存儲與清洗52-2 臍帶，胎盤MSC的分別及純化方法63 原代培育和繼代培育103-1培育基103-2培育密度113-3培育條件113-4換液113-5 傳代培育123-6細胞形態(tài)與生長速度123-7 MSC的凍存與復(fù)蘇：124細胞表面抗原檢測135生長曲線136細胞周期137分化潛能13參考文獻13附件1不同試驗室從臍帶血，臍帶和胎盤等各組織中分別MSC的方法15臍帶血15臍帶15羊膜17絨毛膜18蛻膜層18胎盤19整體灌注法20附

2、件2 背景學(xué)問20附件3 PMSC試驗所需試劑21前言干細胞（Stem cell，SC）是一種能夠自我更新且未分化并可分化成兩個或兩個以上其它品系的細胞。在肯定的條件下，干細胞能夠分化成為多種成熟細胞類型。依據(jù)來源和分化潛能不同，干細胞可分為胚胎干細胞（Embryonic stem cell，ESC）和成體干細胞（Adult stem cell，ASC）兩類。胚胎干細胞來源于早期的胚泡和胚胎內(nèi)層的細胞群，并且具有向3個胚層細胞分化的力量。但是胚胎干細胞應(yīng)用時產(chǎn)生的免疫排斥、體內(nèi)試驗中引發(fā)腫瘤生成以及所涉及的倫理問題等影響并制約了臨床應(yīng)用。成體干細胞形成于原腸胚形成后的胎兒和成體組織，早期爭辯認

3、為，成體干細胞主要分化為其來源組織的細胞類型。然而，近幾年來的很多爭辯表明，成體干細胞具有能夠分化成為除來源以外的其他胚層組織的力量。間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cell, MSC）又稱為基質(zhì)干細胞，是屬于成體干細胞的一種，最早從骨髓中分別而來。MSC是由早期中胚層發(fā)育而來的非造血成體干細胞，該細胞在體外可以貼壁生長，并呈現(xiàn)梭狀。胞質(zhì)豐富，細胞核呈圓形，1-3個核仁。在適當(dāng)?shù)臈l件下可以大量擴增，并轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)祖細胞，進而分化成包括三個胚層的各種組織細胞，如脂肪、骨、軟骨、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等。MSC具有低的免疫原性、能向腫瘤遷移、具有免疫調(diào)整和造血支持等功能，而且易于外源

4、基因?qū)氡磉_，是基因治療中重要的載體細胞。此外，一些爭辯學(xué)者還發(fā)覺，MSC具有類似免疫抑制劑作用，可抑制T淋巴細胞在混合淋巴細胞中的免疫反應(yīng)，并同時抑制T細胞的異基因增殖反應(yīng)。所以，MSC在治療組織缺損、器官退行性疾病、腫瘤及免疫疾病具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用前景。近年來MSC已逐步成為干細胞爭辯的熱點（張慧娟等，2014）。 目前所報道的間充質(zhì)干細胞主要來源于骨髓，接受密度梯度離心法獲得。雖然分別方法簡便，但供者取骨髓需要經(jīng)受一個比較苦痛的手術(shù)，并在取材過程中及取材后會有很高的感染機會；由于人體骨髓中間充質(zhì)干細胞的含量極其稀有，每105-106個單個核細胞中大約只有1個；而且隨著年齡的增加，骨髓中間

5、充質(zhì)干細胞的數(shù)量、增殖和分化力量均顯著下降，使其在爭辯和應(yīng)用尤其是臨床應(yīng)用中受到限制。其他組織中，如動員的外周血、乳牙、臍帶、臍血也存在間充質(zhì)干細胞，然而，從這些組織中獲得的細胞數(shù)量較為有限。以上因素，都限制了間充質(zhì)干細胞在組織工程和臨床中的運用。目前胎盤或臍帶屬于臨床廢棄物，簡潔獲得，并且無污染，取材爭辯和應(yīng)用基本無倫理學(xué)爭議，爭辯表明胎盤或臍帶含有豐富的MSC。有爭辯表明PMSC比骨髓間充質(zhì)干細胞更簡潔分別培育，細胞活性更好，還可誘導(dǎo)分化成脂肪，成骨等多種細胞。并且這些胎盤源的間充質(zhì)干細胞（placenta-derived mesenchymal stem cells，PMSCs）具有極低

6、的免疫原性，大多數(shù)患者對于胎盤或臍帶間充質(zhì)干細胞具有自然的免疫耐受，因此，人胎盤間充質(zhì)干細胞在爭辯相關(guān)疾病的動物模型中，即便是人-動物模型間的異種間移植，由于存在自然的免疫耐受，對試驗爭辯的結(jié)果影響甚小，這對于很多疾病爭辯的模型建立具有很好的作用。目前MSC主要臨床應(yīng)用于抑制移植物抗宿主反應(yīng)。動物模型爭辯結(jié)果表明PMSC對子宮內(nèi)膜損傷（劉芳，2013），大鼠肝組織損傷（宮黎明等，2011），APP+轉(zhuǎn)基因鼠阿爾茨海默?。ü鶃喣械龋?009）均有療效，也可以用于構(gòu)建組織工程皮膚（徐彪等，2013）。所以，綜合充分利用胎盤和臍帶作為間充質(zhì)干細胞新來源，優(yōu)化分別純化以及傳代培育條件，加快細胞繁殖速度

7、，降低培育成本以高效率獵取大量的PMSC對于的各種疾病試驗爭辯及醫(yī)院各個科室的臨床應(yīng)用，都具有重要意義。1分別制備PMSC組織的選取胎盤起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚層，人足月娩出的胎盤由羊膜層、絨毛膜層和蛻膜層組成。從臍帶血（于海微等，2009；管英華等，2011），臍帶（徐燕等，2009；韓之波等，2012；管英華等，2011；李艷琪等，2014；趙琳等，2016），整個胎盤（陸琰等，2009；沙文瓊等，2010；劉洋等，2015；賴公平，2016），胎盤的羊膜層（宮黎明等，2011；徐彪等，2013；張慧娟等，2014；叢姍等，2015），絨毛膜層（洪艷等，2014；韓之波等，2012）和蛻膜

8、層（韓之波等，2013）分別培育MSC均有報道。目前大多數(shù)爭辯者取胎盤小葉（包括絨毛層和絨毛滋養(yǎng)層）進行分別（洪艷等，2014）。胎盤的細胞成分較簡單，既有滋養(yǎng)細胞，也有間質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞和Hofbauer細胞（沙文瓊等，2010）。由胎盤組織分別制備MSC時不行避開會有其它細胞的干擾（苗宗寧等，2009），其中以數(shù)量最多的血細胞干擾為主。分別MSC選取組織時需要考慮哪個部位的組織可能含有最多的MSC，并且盡可能降低其它種類細胞的干擾，以獲得純度高，活力強的MSC。對于人臍帶血來源的MSC（human umbilical cord blood MSC, hUCB-MSC）的存在及能否穩(wěn)定傳

9、代擴增，曾有肯定爭議，后來的試驗結(jié)果證明臍帶血中存在MSC，并表明臍帶血來源MSC與骨髓來源MSC具有相同的生物學(xué)特性及功能特征（于海微等，2009）。但是臍帶血中也存在多能成體干/祖細胞，分別間充質(zhì)干細胞的過程以丟失造血干細胞為代價，而且個體差異大（徐燕等，2009）。臍帶包括一條靜脈和兩條動脈，四周是Whartons Jelly，外層由羊膜來源的上皮包裹，從發(fā)育角度來說，臍帶是干細胞形成及所經(jīng)通路（管英華等，2011）。不同爭辯機構(gòu)均從人臍帶組織中分別到MSC（human umbilical cord MSC, hUC-MSC）。已有爭辯表明人臍帶的結(jié)締組織是間充質(zhì)干細胞豐富的組織來源（徐

10、燕等，2009），故制備hUC-MSC一般剝離臍帶動靜脈和外層上皮。管英華等（2011）比較了臍血和臍帶兩種來源的MSC原代培育過程，結(jié)果表明臍血中細胞成分簡單，原代培育多見成纖維樣和大圓形破骨樣兩種形態(tài)的貼壁細胞，隨著換液和傳代破骨樣細胞漸漸削減和消逝，剩下形態(tài)較為單一的呈漩渦樣的細胞集落; 臍帶來源培育的貼壁細胞不會隨換液丟失，且細胞形態(tài)以成纖維樣細胞為主，種類單一。hUC-MSCs比hUCB-MSCs原代培育的時間短，培育成功率明顯增高。羊膜是胎膜最內(nèi)層，胎盤包裹胎兒面的一層薄而半透亮的膜，由胚胎羊膜囊壁發(fā)育而成，在胎盤面與絨毛膜相貼，由人羊膜間充質(zhì)細胞和人羊膜上皮細胞組成，其表面沒有神

11、經(jīng)、血管、肌肉和淋巴等組織。人羊膜間充質(zhì)細胞來源于原條期的胚胎中胚層，而人羊膜上皮細胞來源于胚胎外胚層。越來越多的爭辯已證明，人羊膜間充質(zhì)細胞和人羊膜上皮細胞都具有干細胞的特征。其中人胎盤羊膜來源的間充質(zhì)干細胞（human amnion-derived mesenchymal cells, hAD-MSCs）不但表達成體干細胞特性中的間充質(zhì)干細胞特性也表達部分胚胎干細胞特性，相關(guān)爭辯表明人羊膜間充質(zhì)干細胞表達胚胎干細胞全能型標志轉(zhuǎn)錄因子基因OCT4、SOX2和NANOG（張惠娟等，2014）以及SSEA-3、SSEA-4、Oct-4等胚性標志（宮黎明等，2011），近年來發(fā)覺hAD-MSCs在

12、體外誘導(dǎo)培育條件下，可分化成來自3個胚層的全部細胞（宮黎明等，2011）。有爭辯比較人羊膜間充質(zhì)干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖力量，發(fā)覺培育人羊膜間充質(zhì)干細胞的細胞數(shù)量在各時間點均明顯高于骨髓間充質(zhì)干細胞（徐彪等，2013）。洪艷等（2014）分別從絨毛膜和絨毛滋養(yǎng)層分別并培育MSC，發(fā)覺在分別過程中，從絨毛膜和絨毛滋養(yǎng)層得到的細胞量都很多，絨毛滋養(yǎng)層的細胞量甚至?xí)浇q毛膜的細胞量。但是在接種后培育時，由于絨毛滋養(yǎng)層血細胞較多，血細胞難以處理，影響間充質(zhì)干細胞的貼壁，無法貼壁就無法連續(xù)生長，由此導(dǎo)致后期細胞生長慢，收獲細胞少。韓之波等（2013）的爭辯表明來自母體的底蛻膜組織也可以分別制備M

13、SC。苗宗寧等（2009）將胎盤組織分為3 組，分別是中心帶組即臍帶附著處，邊緣帶組即距臍帶附著點最遠處和中間帶組即兩者之間中點處。分別全層連續(xù)切片，以抗CD166、抗CD44、抗CD29 分別做免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀看陽性細胞表達及分布分布區(qū)域，結(jié)果表明中間層的陽性細胞數(shù)量與表達水平強于絨毛板層和底板層；同為中間層，中心帶較中間帶及邊緣帶表達更強。由此推想，在接近血管豐富的臍帶附著部的胎盤中間層取材易于獲得較豐富的PMSCs。2臍帶，胎盤MSC的分別與純化2.1胎盤組織的獵取，存儲與清洗母血檢測 HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、梅毒均為陰性。產(chǎn)婦無傳染性疾病，胎兒無先

14、天性疾病。臨床足月正常剖宮產(chǎn)后胎盤，大小及質(zhì)量在正常范圍內(nèi)，胎盤臍帶附著點均在胎盤中心稍偏位。經(jīng)與產(chǎn)婦及其家屬簽署知情同意書，試驗方案經(jīng)并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。在產(chǎn)房無菌條件下獵取臍帶，胎盤。文獻報道中取組織后有如下處理方法：馬上浸入胎盤儲存袋（加拿大LABPLAS公司的無菌采樣袋，含99%低糖DMEM，1%雙抗即青鏈霉素的組織愛護液），在48 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至試驗室。臍帶靜置于冰箱12h， 觀看保存臍帶的PBS液， 若無渾濁說明無感染。臍帶采集后在6 h內(nèi)進行處理，切除雙側(cè)帶夾痕及淤血的部分。無菌采集健康足月剖宮產(chǎn)羊膜，冰盒中2 h內(nèi)運達試驗室進入試驗流程。無菌采集健康足月剖宮產(chǎn)胎盤，并馬上進入分

15、別提取程序。文獻報道中組織塊的用量及獲得：胎盤組織約 50 g35個胎盤小葉剪取胎兒側(cè)的絨毛膜層組織10 mL眼科手術(shù)剪將組織剪碎（細碎小塊；1mm3大??；呈肉糜狀，以能用吸管吸取為標準；約3mm；5 mm3大小的碎塊）組織絞碎分別機（近似肉糜）文獻中的組織浸泡液/清洗液：# 生理鹽水# D-Hanks平衡液# 磷酸緩沖液（PBS）# 杜氏磷酸緩沖液（D-PBS）# 含肝素的PBS# 含有雙抗生素的PBS (0.1%的青鏈霉素，1%的青鏈霉素, 100 U/mL青霉素, 100 µg/mL鏈霉素)# 含有青霉素和鏈霉素的無血清 DMEM /F12 培育基2-2 臍帶，胎盤MSC的分別

16、及純化方法已報道臍帶，胎盤MSC的分別方法有組織塊貼壁法，酶消化法以及整體灌注法。組織貼壁培育法得到的細胞純度較高，對細胞損害小，操作相對簡潔，將組織塊剪碎、貼壁后加培育基培育即可，但原代培育所需周期較長、獲得細胞數(shù)量相對有限。李艷琪等（2014）在首次組織塊貼壁培育獲得MSC后，將組織塊轉(zhuǎn)移到新的培瓶中連續(xù)培育，兩三天后仍可見到貼壁細胞，第5 天可形成明顯的細胞克隆。這種改進的組織塊二次貼壁方法可在較短時間內(nèi)獲得大量原代細胞。 酶消化法可直接將消化得到原代細胞，但是獲得的細胞純度略低、狀態(tài)不均一，由于消化時間不易把握，消化時間過短不能得到足量細胞，消化時間過長會對細胞造成損害，損傷細胞膜成分

17、，導(dǎo)致無法貼壁生長，影響細胞的成活率和增殖力量，甚至導(dǎo)致細胞死亡，給后續(xù)培育帶來困難（李艷琪等，2014）；對于某些組織如臍帶Whartons膠經(jīng)酶消化后的膠體黏稠，不易離心。徐燕等2009比較，植塊法培育 610 d 可見成纖維樣細胞從植塊邊緣爬出，在原代細胞克隆數(shù)、細胞產(chǎn)率、傳代時間及擴增倍數(shù)上明顯好于膠原酶消化法（1 g/L膠原酶3.05.0 mL， 置于含雙抗的PBS中，37 孵育0.5 h）比較存在差異；而膠原酶與胰酶聯(lián)合消化法（1 g/L膠原酶于37 孵育16 h，以PBS洗滌后加入25 g/L胰酶于37 孵育0.5 h）接種后未見明顯貼壁細胞。常用的酶包括胰蛋白酶，膠原蛋白酶，和

18、。胰蛋白酶消化力量強，型膠原酶消化力量相對較弱，但對細胞膜損害較小。很多爭辯者對酶的濃度，消化時間，消化方式，多種消化酶聯(lián)合消化做了大量探究。尋求既能充分的分別細胞，又能避開細胞的損傷的方法（賴公平，2016）組織經(jīng)酶消化后需要用篩網(wǎng)/多層紗布過濾（100目，200目，300目，100 µm的濾器），除去未被消化的大組織塊。濾出的細胞成分簡單，常含有大量的血細胞?，F(xiàn)階段用于分別純化方法間充質(zhì)干細胞的方法主要有以下幾種：一般離心、密度梯度離心法、貼壁篩選法、紅細胞裂解液法、淋巴細胞分別液( Ficoll) 、羥乙基淀粉沉淀、流式細胞儀分選法或磁珠分選法。由于間充質(zhì)干細胞沒有特異的表面標

19、志，應(yīng)用流式細胞儀分選法或磁珠分選法會損失大量細胞，且成本高。每種方法各有優(yōu)缺點，使用紅細胞裂解液對于間充質(zhì)干細胞的損傷大，使用淋巴細胞分別液進行分別的可重復(fù)性較差，技術(shù)不穩(wěn)定（洪艷等，2014）。文獻中報道的消化酶的濃度，消化時間，次數(shù)及組合消化：機械剝離胎盤羊膜組織，PBS反復(fù)沖洗，將羊膜組織剪成細碎小塊，0.25%胰酶37 消化10 min，過100目篩網(wǎng)過濾獲得細胞液。經(jīng)胰酶消化后的組織塊，連續(xù)經(jīng)0.1%型膠原酶37消化15 min。含體積分數(shù)為10%胎牛血清的L-DMEM終止反應(yīng)后，過100目篩網(wǎng)獲得細胞液。兩次收集的細胞液1 000 r/min離心10 min，棄上清液（徐彪等，2

20、013）。將胎盤組織碎片置于200 mL無菌離心管中，聯(lián)合應(yīng)用0.25%胰蛋白酶和0.1%型膠原酶消化胎盤組織碎片。37 搖床消化30 min，去除組織留取消化液，經(jīng)1 500 r/min離心5 min，收集離心獲得的細胞沉淀。將離心后收集到的細胞重懸于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的-MEM培育基（劉洋等，2015）。剪碎羊膜，加入0.5 g/L 胰蛋白酶-0.02% EDTA-2Na消化液，37，200 r/min旋轉(zhuǎn)消化10 min，棄上清，再加入消化液， 37 旋轉(zhuǎn)消化30 min，棄上清，按同樣的程序再重復(fù)消化2次。經(jīng)胰酶消化后剩余的組織用D-PBS液沖洗，加入0.75 g/L 型膠原酶

21、-0.075 g/L DNase I消化液， 37 、200 r/min旋轉(zhuǎn)消化2.03.0 h，直至組織完全消化，經(jīng)300目 不銹鋼網(wǎng)過濾， 收集細胞濾液，1 500 r/min，離心10 min，棄上清，細胞沉淀懸浮于LG-DMEM培育基（宮黎明等，2011）。張慧娟等（2014）無菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的羊膜剪成碎片，分別通過7 種消化方法，發(fā)覺用 0.05 g/L 的胰蛋白酶連續(xù)消化 2 次每次消化 30 min，然后用 1 g/L 的膠原酶消化 60 min 是最合適的人羊膜間充質(zhì)干細胞體外分別培育條件。0.05 g/L胰蛋白酶消化10 min后，再加0.75 g/L膠原酶消化

22、60 min0.75 g/L膠原酶直接消化120 min0.05 g/L胰蛋白酶與0.75 g/L膠原酶同時消化60 min0.05 g/L的胰酶消化30 min后，再加0.75 g/L膠原酶消化30 min0.05 g/L的胰蛋白酶連續(xù)兩次消化30 min后，再加入0.75 g/L的型膠原酶消化60 min0.05 g/L的胰酶連續(xù)2次消化40 min后，再加0.75 g/L膠原酶消化60 min0.05 g/L的胰酶連續(xù)2次消化30 min后，再加1 g/L的型膠原酶消化60 min取前處理的樣品在37 下，用0.05 g/L的胰蛋白酶連續(xù)2次消化30 min，用含體積分數(shù)5%的胎牛血清D

23、MEM終止消化，輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，篩中組織經(jīng)PBS沖洗后裝入培育皿中，然后加入1 g/L的型膠原酶，在37 下消化60 min，之后用含體積分數(shù)5%的胎牛血清DMEM終止消化，輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，濾液在1 500 r/min的離心機中離心5 min，去上清液，換DMEM/F12培育基混懸細胞并接種于培育皿中（張慧娟等，2014）。用眼科手術(shù)剪將羊膜剪碎約1 mm×1 mm組織塊，加入等體積的0.05% trypsin-EDTA， 37 水浴震蕩消化30 min 后加入含血清的培育液， 離心去上清， 如此反復(fù)消化兩次， 再用PBS洗23次， 盡可能去除上皮

24、細胞。用細胞篩過濾后剩余的羊膜組織加入不同濃度型膠原酶(0.75、1.00和2.00 mg/mL)，37 水浴震蕩消化60 min， 加入含血清的培育液終止消化， 混勻后用200 目細胞篩過濾， 再將濾液1 500 r/min 離心 5 min 收集細胞（叢珊等，2015）。按體積比約 16 加入型膠原酶( 0.1% ) ， 置于 37 恒溫水浴箱中消化30 min， 間隔 5 min 適當(dāng)混勻組織與消化液。之后紗布過濾，上淋巴細胞分別液（賴公平，2016）。使用pH 7.4、含25 mmol/LHEPES的D-Hanks作為消化緩沖液，加入終濃度為2.5 g/L胰酶和300 U/mL DNa

25、se組成消化液，沖洗后的胎盤組織分階段消化，每個階段在恒溫氣浴搖床中37 、180 r/min消化20 min（沙文瓊等，2010）。用手術(shù)剪分別將絨毛膜層組織塊剪成約5 mm3大小的碎塊型膠原酶10 mL （酶消化終濃度0.1%），置于搖床內(nèi)37 、250 r/min振蕩，約90 min后終止消化（洪艷等，2014）。文獻中報道的純化方法：將細胞懸液緩慢加至已配好的淋巴細胞分別液中。1 500 r · min-1， 4離心20 min，離心后可見“白膜層”，當(dāng)心吸取該區(qū)域細胞，并加入 4 倍于該體積的 PBS 稀釋，1000 r·min-1，常溫下離心 5 min。重復(fù)一

26、次，棄上清（賴公平，2016）Percoll梯度密度分別： 在50 mL離心管中逐層鋪入7個密度的Percoll分別液，每個密度5 mL。再緩緩加入5 mL細胞懸液，使用水平離心機室溫下1 200 g離心20 min。 當(dāng)心棄除離心管20 mL刻度以上的液體，收集12.520.0 mL刻度的細胞層(滋養(yǎng)細胞)和12.57.5 mL刻度(胎盤間充質(zhì)干細胞)的液體，分別放入不同離心管里，用D-Hanks液稀釋5倍后，室溫下1 000 g離心15 min（沙文瓊等，2010）。陸琰等（2009）比較了四種胎盤組織分別純化從MSC的方法：膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶+

27、 淋巴細胞分層液分別組、膠原酶+ 氯化銨裂解紅細胞組。與膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組比較，其余3 組獵取的細胞數(shù)均明顯削減（t =2.928.16，P < 0.05）。在其他條件相同的狀況下，膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組培育成功率為100%，其余3 組分別為80%，80%，20%。剪碎的胎盤組織與1 g/L膠原酶中， 37 消化45 min。然后過細胞篩網(wǎng)，收集各組細胞懸液，分別于室溫以1 000 r/min離心5 min，棄上清。用PBS重懸細胞，加入60 g/L羥乙基淀粉（體積比為4:1）充分混勻，室溫靜置45 min，當(dāng)心吸取上清，1 000 r/min離心5 min，棄上清， PBS

28、洗滌2次。以完全培育基重懸，制成單細胞懸液，錐蟲藍染色計數(shù)活細胞數(shù)。按1.5×109 L-1密度接種于T-25塑料培育瓶中（陸琰等，2009）。3 原代培育和繼代培育3-1培育基從文獻報道可以看出，需要10%胎牛血清，低糖的DMEM/F12完全培育基，100 U/mL青霉素+100 µg/mL鏈霉素，此外可選的有5 g/L堿性成纖維細胞生長因子，10 g/L表皮生長因子，10 µg/L血小板衍生生長因子。文獻中報道的培育基：# 10%胎牛血清的L-DMEM完全培育基# 5 g/L堿性成纖維細胞生長因子和10 g/L表皮生長因子的L-DMEM完全培育基#10%胎牛血

29、清的-MEM培育基# LG-DMEM培育基(含體積分數(shù)為10%的胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、10 g/L非必需氨基酸、55 mol/L 2-巰基乙醇、1 mmol/L丙酮酸鈉、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素)# DMEM/ F12+10% FBS+10 ng/mL bFGF+100 U/mL青霉素+100 µg/mL鏈霉素# 10%的胎牛血清的低糖DMEM# 含體積分數(shù)為0.1胎牛血清的DMEM/F12 # 含體積分數(shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培育基# 完全培育基(含體積分數(shù)為2%胎牛血清、40% M

30、CDB201、10 µg/L血小板衍生生長因子、10 µg/L堿性成纖維細胞生長因子、10 µg/L表皮生長因子的DF12培育基)# DMEM+體積分數(shù)為10%胎牛血清+1% enicillin-Streptomycin+5 µg/L堿性成纖維細胞生長因子3-2培育密度原代培育的細胞接種密度可能對成功培育有影響，于海微等（2009）試驗了5×108 L-1、 1×109 L-1、 5×109 L-1、 1×1010 L-1的接種密度，發(fā)覺以5×108 L-1密度接種時細胞始終無法傳代，以5×10

31、9 L-1的密度接種時細胞貼壁時間、消滅伸展時間及原代培育時間均顯著短于其他接種密度。文獻中報道的接種密度：2.2×108 L-11.5×109 L-11×106/cm21×108 L-13×106/皿， 接種若干Ø100 mm細胞培育皿3-3培育條件37 、飽和濕度、體積分數(shù)為5% CO2孵育箱內(nèi)培育3-4換液細胞生長消耗培育基的養(yǎng)分，同時產(chǎn)生代謝廢物，限制細胞生長，所以需要準時換液，但是換液太頻繁會造成鋪張，此外可以胎盤間充質(zhì)干細胞呈貼壁生長，可以利用此特性在換液時與其他雜細胞進一步分別，但在培育早期，胎盤間充質(zhì)干細胞貼壁不堅固，

32、第一次換液時間過早將損失獵取的胎盤間充質(zhì)干細胞。故需要通過實時觀看并依據(jù)實際狀況探究合適的原代培育的第一次換液時間和后續(xù)培育的換液頻率。文獻中報道的首次換液時間有2d，3d，7d全量或半量換液，棄去未貼壁細胞，以后每三四天換液1次。文獻中報道的換液時間和方式：每3 d全量換液1次培育48 h后半量換液，去除未貼壁細胞，以后每三四天換液1次7 d后首次全量換液，棄去未貼壁細胞，每三四天換液1次3 d后半量換液，1周后再次換液，此后每隔3 d換液1次57 d后全量換液，以后每3 d換液3d全量換液，以后每周換液2次3d后半量換液，連續(xù)培育2d后全量換液2d換液，以后每3 d換液1次3-5 傳代培育

33、待原代培育的細胞貼壁連生面積達70%90%后（貼壁細胞生長至 70% -90%融合時），用胰酶消化（2.5 g/L胰酶或0.25%胰酶或1.25 g/L胰蛋白酶-1 g/L乙二胺四乙酸），按1：2或1：3或14的比例傳代，或以（2.55.0）×103/cm2密度接種傳代培育。（消化時間？去除培育基后加酶消化？胰蛋白酶用PBS還是培育基溶解？每個培育瓶用多少量的酶消化？）3-6細胞形態(tài)與生長速度3-7 MSC的凍存與復(fù)蘇：凍存液中DMSO的濃度可能對細胞活力產(chǎn)生影響，叢珊等（2015）對此進行過試驗，將 3 組不同凍存液凍存的 hAMSCs 凍存 48 h后進行復(fù)蘇培育。冷凍愛護液一：

34、 5% 二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)50% 標準胎牛血清+45% DMEM/F12。冷凍愛護液二：10% DMSO50% 標準胎牛血清+40% DMEM/F12。冷凍愛護液三：20% DMSO50% 標準胎牛血清+30% DMEM/F12。結(jié)果顯示， DMSO濃度為5%時，細胞在 2 h后開頭貼壁， 4 h時幾乎全部細胞貼壁；DMSO濃度為10%和20%的兩組活力較差，細胞仍是圓形，且無貼壁現(xiàn)象。復(fù)蘇培育：解凍時從液氮罐中取出冷凍管，將其放入37 水浴鍋快速溶化約12 min（或放入37、5% CO2、 飽和濕度的培育箱中使其溶化）。將凍存管中液體加入有培育基的

35、離心管中，1500 r/min 離心5 min，去掉上清，接種到新的培育基皿中，于37、5% CO2、飽和濕度條件下培育，第2天更換培育液（叢珊等，2015）。4細胞表面抗原檢測由于培育細胞的外形不能作為鑒別細胞類型的主要特征標志，因此，通常都接受流式細胞術(shù)對細胞表面抗原分子進行鑒定。不同的爭辯人員觀看到 MSC 表達不同的表面標記，造成這種狀況的緣由有很多， 包括MSC的來源、 供者的年齡、提取的方法和擴增的條件等都會影響MSC 的表面標記（韓之波等，2012）。國際上對于 MSC 的鑒定仍具爭議，目前認可度較高的 ISCT（國際細胞治療協(xié)會）間充質(zhì)干細胞委員會制定的一系列標準。流式細胞儀分

36、析鑒定MSC應(yīng)細胞表達黏附分子和基質(zhì)細胞標記 CD73、 CD90、 CD105， 整合蛋白家族CD29，以及透亮質(zhì)酸鹽受體 CD44，不表達造血細胞標記 CD11b、 CD34、 CD45 和 HLA-DR。5生長曲線6細胞周期7分化潛能參考文獻郭亞男, 關(guān)方霞, 李國棟, 李祥生, 楊波, 杜英, 胡祥, 胡煒, 焦紅亮, 李遠. 人羊膜間充質(zhì)干細胞靜脈移植治療阿爾茨海默病APP+轉(zhuǎn)基因鼠的有效性及平安性評估J.中國組織工程爭辯與臨床康復(fù), 2009, 13(10):1811-1818.韓之波, 王有為, 王濤, 池穎, 楊舟鑫, 及月茹, 孟磊, 楊萍, 韓忠朝. 人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細

37、胞的分別及其生物學(xué)特性爭辯J. 中國試驗血液學(xué)雜志, 2013, 21（3）：754-759.韓之波, 楊舟鑫, 池穎, 王有為, 王濤, 及月茹, 楊萍, 孟磊, 韓忠朝. 人臍帶胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性比較爭辯J. 中國試驗血液學(xué)雜志, 2012, 20（3）：692-696.洪艷, 霍思維, 陸瑤, 章毅. 人胎盤不同組織分別間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性J. 中國組織工程爭辯, 2014, 18(19):3082-3087.李艷琪, 王洪一, 姚堯, 劉晶晶, 徐瀟, 張宇, 劉洋, 吳祖澤, 靳繼德. 人臍帶源間充質(zhì)干細胞分別培育方法的改進J. 中國組織工程爭辯, 2014,

38、 18(10):1609-1614.劉芳，骨髓間充質(zhì)干細胞移植聯(lián)合雌激素治療宮腔粘連的試驗爭辯D. 南方醫(yī)科高校, 2013.劉洋, 李艷琪, 王洪一, 吳曉冰, 荊永光, 徐瀟, 姚堯, 張宇, 吳祖澤, 靳繼德. 胎盤源間充質(zhì)干細胞分別提取的新方法J. 中國組織工程爭辯, 2015, 19(10):1608-1612.陸琰, 陳麗, 張洹. 人胎盤間充質(zhì)干細胞 4 種消化分別方法的效果比較J. 中國組織工程爭辯與臨床康復(fù), 2009, 13(6):10147-1020.苗宗寧, 徐秋嵐, 呂國忠, 王玲, 張學(xué)光. 間充質(zhì)干細胞在人胎盤組織中的染色定位及整體灌注分別培育J. 中國組織工程爭

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40、 郝牧, 邱錄貴. 人臍帶間充質(zhì)干細胞分別培育條件的優(yōu)化及其生物學(xué)特性J. 中國組織工程爭辯與臨床康復(fù), 2009, 13(32):6289-6294.于海微, 李佩玲, 莊如錦, 李會明. 人臍帶血和骨髓來源間充質(zhì)干細胞的體外分別、培育、分化及生物學(xué)特性比較J. 中國組織工程爭辯與臨床康復(fù), 2009, 13(6):1021-1024.附件1不同試驗室從臍帶血，臍帶和胎盤等各組織中分別MSC的方法臍帶血分娩后穿刺臍靜脈抽取50 mL 臍帶血液，4冰箱保存，12 h 內(nèi)分別，用Hanks 平衡液稀釋臍帶血，稀釋血液緩慢疊加于Ficoll上，離心，吸出乳白色云霧狀單個核細胞，洗滌離心2 次，將獲

41、得的單個核細胞分別以5×108/L密度種植入25 cm2的塑料培育瓶中，加入完全培育基吹打，混勻。置于37、含體積分數(shù)為0.05 的CO2飽和濕度培育箱中，57 d后全量換液，以后每3 d換液，并逐日觀看細胞貼壁延長時間、原代培育時間及細胞生長狀況（于海微等，2009）。距胎兒5-7cm的臍帶處進行雙結(jié)扎，剪斷臍帶，消毒母側(cè)臍帶斷端，穿刺臍靜脈抽取臍血40-120mL，加肝素抗凝，4h內(nèi)分別（管英華等，2011）。淋巴細胞分別液法: 將臍帶血與無血清DMEM/F12培育基1:1體積比混合，緩慢加至含有等體積的Ficoll ( 密度為1.077g/L ) 分別液上，1800r/min離

42、心20min，取中間白膜層，經(jīng)培育基以1000r/min離心10min洗滌2次，細胞接種密度為5*107接種至25cm2培育瓶中，置于37，5%的CO2飽和濕度孵箱中培育，細胞融合達到80%時，0.25%胰蛋白酶消化傳代（管英華等，2011）。羥乙基淀粉沉降與淋巴細胞分別液兩步分別法: 將臍帶血與6%羥乙基淀粉按4:1的體積比混合，常溫下靜置30-45min，取上清液，1000r/min離心10min，棄去上清，培育基重懸細胞將其緩慢加至含有等體積的Ficoll ( 密度1.077g/L )分別液上（管英華等，2011）。臍帶將無菌條件下取得的足月妊娠分娩胎兒臍帶，用PBS洗3 次，去掉殘留的

43、血細胞。把臍帶剪切成2.0 cm左右的片段并剔除血管（1 條臍靜脈，2條臍動脈），取出其中的凝膠狀組織，將其剪成大小約1 mm3的組織塊，然后置于培育瓶中。6 h后，加入含體積分數(shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培育基，放置在37、體積分數(shù)為5%CO2培育箱中培育。3 d 后半量換液，1 周后再次換液，此后每隔3 d 換液1 次。觀看貼壁組織四周的細胞生長狀況，當(dāng)細胞達到80%-90%融合度時，用胰酶消化傳代，并將組織轉(zhuǎn)移到一個新的培育瓶中，按上述方法連續(xù)培育，獲得其次次組織塊貼壁培育的細胞（李艷琪等，2014）。貼壁細胞培育法: 在無菌條件下

44、取出的臍帶組織，用含有青霉素和鏈霉素的無血清DMEM/F12培育基洗滌去除殘存血，去除外包膜與臍動靜脈血管，將剩余組織剪碎至1mm3大小，轉(zhuǎn)入T25細胞培育瓶，37、5%CO2飽和濕度條件下細胞培育箱中直接貼壁培育。5-7d首次換液，貼壁細胞融合接近80%時，0.25%胰蛋白酶消化傳代（管英華等，2011）。酶消化培育法: 將以上方法處理的去除外包膜與動靜脈后的臍帶組織，經(jīng)0.1%膠原酶和0.25%胰酶消化，無血清DMEM/F12培育基洗滌，以1.0*106/cm2接種到T2瓶（管英華等，2011）。人臍帶間充質(zhì)干細胞的培育：臍帶采集后在6 h內(nèi)進行處理，切除雙側(cè)帶夾痕及淤血的部分，用含雙抗的

45、PBS緩沖液充分沖洗臍帶外周以及臍靜脈內(nèi)腔，用以下3 種方法進行分別培育，3 種方法均于培育的第14天計數(shù)集落數(shù)，超過50個細胞計為集落。當(dāng)細胞達70%80% 融合時，以含1.25 g/L胰蛋白酶-1 g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以(2.55.0)×103/cm2密度接種傳代培育，計為第1 代(P1) 細胞。植塊法：沿臍靜脈內(nèi)腔縱向剪開血管，剝離臍靜脈內(nèi)膜，將剩余組織切成3.05.0 mm3小塊，貼于預(yù)先用1 mL完全培育基( 含體積分數(shù)為2%胎牛血清、40% MCDB201 、10 µg/L血小板衍生生長因子、10 µg/L 堿性成纖維細胞生長因子、10

46、µg/L表皮生長因子的DF12培育基) 潤濕的T25 培育瓶底壁，底壁朝上，置于37、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度孵箱中，過夜后翻轉(zhuǎn)。每24 h 加入1 mL上述培育基，72 h全量換液，以后每周換液2 次。觀看貼塊四周貼壁細胞爬出狀況。2 周后去貼塊。膠原酶消化法：夾閉臍靜脈一端，灌入1 g/L膠原酶3.05.0 mL ，置于含雙抗的PBS中，37 孵育0.5 h，收集酶液，并用PBS 反復(fù)灌洗，收集灌洗液，與酶液同時離心洗滌棄上清后，以完全培育基重懸，1×106/cm2接種于T25 培育瓶中，3 d后全量換液，以后每周換液2 次。觀看貼壁細胞生長。膠原酶與胰酶聯(lián)合消化

47、法：將臍帶組織切成1.02.0 mm3小塊，直接加入1 g/L膠原酶于37孵育16 h ，以PBS 洗滌后加入25 g/L 胰酶于37孵育0.5 h；加入含體積分數(shù)為20%胎牛血清的培育基中和胰酶，以100 µm的濾器過濾細胞，收集濾液；PBS 洗滌棄上清后，以完全培育基重懸，按1×106/cm2接種于T25 培育瓶中，3 d后全量換液，以后每周換液2次。觀看貼壁細胞生長（徐燕等，2009）。羊膜羊膜間充質(zhì)干細胞的分別培育：選取剖宮產(chǎn)足月胎兒的胎盤，機械剝離胎盤羊膜組織，PBS反復(fù)沖洗，將羊膜組織剪成細碎小塊，0.25%胰酶37 消化10 min，100目篩網(wǎng)過濾。PBS充

48、分清洗后收集經(jīng)胰酶消化后的組織塊，連續(xù)經(jīng)0.1%型膠原酶37消化15 min。含體積分數(shù)為10%胎牛血清的L-DMEM終止反應(yīng)后反復(fù)吹打，過100目篩網(wǎng)獲得細胞液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液。收集羊膜來源的細胞按以下培育條件進行體外培育：添加有5 g/L堿性成纖維細胞生長因子和10 g/L表皮生長因子的L-DMEM完全培育基， 置于37 、體積分數(shù)為5% CO2孵育箱內(nèi)培育。每3 d全量換液1次，12-14 d后細胞按常規(guī)方法傳代（徐彪等，2013）。hAD-MSCs的分別和培育： 無菌條件下，接受機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-PBS液反復(fù)沖洗以清除殘留血跡。剪碎羊

49、膜，加入0.5 g/L 胰蛋白酶-0.02% EDTA-2Na消化液，37 旋轉(zhuǎn)(200 r/min)消化10 min，棄上清，再加入消化液， 37 旋轉(zhuǎn)消化30 min，棄上清，按同樣的程序再重復(fù)消化2次。經(jīng)胰酶消化后剩余的組織用D-PBS液沖洗，加入0.75 g/L 型膠原酶-0.075 g/L DNase I消化液， 37 、200 r/min消化2.03.0 h，直至組織完全消化，經(jīng) 300 目 不 銹 鋼 網(wǎng) 過 濾 ， 收 集 細 胞 濾 液 ，1 500 r/min，離心10 min，棄上清，細胞沉淀懸浮于LG-DMEM培育基(含體積分數(shù)為10%的胎牛血清、 2 mmol/L L

50、-谷氨酰胺、 10 g/L非必需氨基酸、 55 mol/L 2-巰基乙醇、 1 mmol/L丙酮酸鈉、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素) 2%錐蟲藍染色檢測細胞活力，以2.2×108 L-1濃度接種于培育瓶，于37 、飽和濕度、體積分數(shù)為5%的CO2環(huán)境下培育， 3 d更換培育基。待細胞連生面積達80%90%后行傳代培育（宮黎明等，2011）。絨毛膜在產(chǎn)房無菌條件下獵取胎盤，馬上浸入胎盤儲存袋含99%低糖DMEM，1%抗生素( 雙抗即青鏈霉素) 的組織愛護液 ，在48 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至試驗室（洪艷等，2014）。剪取胎兒側(cè)的絨毛膜層組織10 mL，置于直徑10 cm 培育皿，平

51、皿中裝有2/3體積的含有抗生素的(1% 的青鏈霉素)PBS。用手術(shù)剪剪開大的組織塊，一邊將大的組織塊剪成小塊，一邊用手術(shù)鑷夾持進行漂洗，避開溢出，如此重復(fù)3 遍，至漂洗液清亮，棄漂洗液。轉(zhuǎn)移絨毛膜層組織至50 mL 體積的離心管中，做好標記，用手術(shù)剪分別將絨毛膜層組織塊剪成約5 mm3大小的碎塊。向各離心管中加入型膠原酶消化液，各加入型膠原酶10 mL ( 酶消化終濃度0.1%)，置于搖床內(nèi)37、250 r/min振蕩，約90 min 后終止消化。加PBS 至50 mL ，300r/min，5 min；收集上清，20 mL一管，加PBS 至50 mL ，2 000 r/min ，10 min棄

52、上清。用10 mL PBS, 重懸細胞混勻并一管，加PBS至50 mL，2 000 r/min，10 min。棄上清，加入10 mL完全培育基，取20L細胞懸液加入80L的紅細胞裂解液用于細胞計數(shù)。依據(jù)計數(shù)結(jié)果3×106/皿，接種若干Ø100 mm 細胞培育皿，37 體積分數(shù)5%CO2 培育。48 h 換液，以后每3 d換液1次，直至細胞可以進行傳代（洪艷等，2014）。細胞生長至80%時，每皿加入1.0-2.0 mL的0. 25%胰酶( 含EDTA) 進行消化傳代。傳代時，消化三至四分鐘，加含有血清的細胞培育液終止消化，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，并補加PBS至5

53、0 mL ，1 200 r/min ，離心5 min，棄含消化液的上清，加入細胞完全培育液吹打混勻，計數(shù)，依據(jù)約1.5×106/皿接種于細胞培育皿(100 mm)中，置于37，體積分數(shù)5%CO2培育箱中培育（洪艷等，2014）。蛻膜層將胎盤組織用無菌鹽水沖洗后，當(dāng)心分別胎盤底蛻膜組織用無菌組織剪剪成小組織塊，使用膠原酶和胰酶消化，消化后的混合液體經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后，接種于細胞培育瓶中，用含10%胎牛血清的DF12培育液于37，5%CO2培育箱中培育，待細胞生長至80%融合時，胰酶消化細胞，按1：3傳代培育（韓之波等，2013）。胎盤胎盤標本處理：無菌條件下將娩出胎盤剝除羊膜，剪除胎

54、盤母風(fēng)光2.03.0 mm組織后，剪下35個胎盤小葉，稱質(zhì)量約50 g，浸泡于含肝素的無菌PBS中。將剪下的胎盤小葉用手術(shù)剪剪碎，用生理鹽水反復(fù)沖洗血污，直至沖洗液接近無色。試驗共采集5例標本。組織消化：使用pH 7.4、含25 mmol/L HEPES的D-Hanks作為消化緩沖液，加入終濃度為2.5 g/L胰酶和300 U/mL DNase組成消化液，每個標本需消化液330 mL。沖洗后的胎盤組織分階段消化，每個階段在恒溫氣浴搖床中37 、180 r/min消化20 min。每次消化完畢后，當(dāng)心將消化上清吸出，用新生牛血清終止反應(yīng)。然后將消化上清液，在25 1 000 g 離心15 min

55、，使從組織中離解出的細胞充分沉淀，再用L-DMEM重懸。所得細胞懸液中含有較多消化后的組織碎片，用200目的不銹鋼濾網(wǎng)濾除。過濾后再次離心，調(diào)整細胞懸液體積到5 mL（沙文瓊等，2010）。人胎盤標本的留?。簾o菌條件下取足月剖宮產(chǎn)胎兒的胎盤，剝除羊膜，剪取胎兒側(cè)胎盤組織，PBS 反復(fù)沖洗至液體較清亮，用眼科剪剪碎（陸琰等，2009）。分組及干預(yù)：剪碎的胎盤組織稱取質(zhì)量，平均分為4組，每組5 份標本：膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶+羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶+ 淋巴細胞分層液分別組、膠原酶+ 氯化銨裂解紅細胞組。將第1 組置于1 g/L膠原酶中，37 消化45 min ；另外3 組置于1 g/

56、L膠原酶中，37 消化45 min。然后過細胞篩網(wǎng)，收集各組細胞懸液，分別按以下方法進行對應(yīng)分別（陸琰等，2009）。羥乙基淀粉沉淀法：將收集到的膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶+ 羥乙基淀粉沉淀組細胞懸液，分別于室溫以1 000 r/min離心5 min ，棄上清。用PBS 重懸細胞，加入60 g/L 羥乙基淀粉（體積比為4:1）充分混勻，室溫靜置45 min ，當(dāng)心吸取上清，1 000 r/min 離心5 min ，棄上清，PBS 洗滌2次。以完全培育基重懸，制成單細胞懸液，錐蟲藍染色計數(shù)活細胞數(shù)。按1.5×109L- 1密度接種于T-25 塑料培育瓶中，置于37 、體積分數(shù)0.05 的CO2飽和濕度環(huán)境下，用含體積分數(shù)為0.1胎牛血清的DMEM/F12進行培育。7 d 后首次全量換液，棄去未貼壁細胞，每三四天換液1 次。細胞達80%匯合后，用2.5 g/L胰酶消化，按12的比例傳代，連續(xù)擴增培育（陸琰等，2009）。淋巴細胞分層液分別法：將膠原酶+