生物技術(shù)制藥試驗

1、生物技術(shù)制藥實驗武漢大學藥學院 生物技術(shù)實驗室湖北·武漢目 錄實驗一 質(zhì)粒DNA的小量制備2實驗二 質(zhì)粒DNA電泳鑒定4實驗三 感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化5實驗四 目的基因的表達及表達產(chǎn)物的初步提取8實驗五 蛋白質(zhì)純化鹽析沉淀法10實驗六 凝膠過濾層析14實驗七 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗（Western Blotting）16實驗八 HRP結(jié)合物的過碘酸鈉交聯(lián)法19 實驗一 質(zhì)粒DNA的小量制備【目的】學會最常用的堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA的方法?！驹怼?根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性DNA在拓撲學上的差異來分離。在pH12.012.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性。盡

2、管在這樣的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會變性，但兩條互補鏈彼此互相盤繞，仍會緊密結(jié)合在一起。當加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復性快，而線性的染色體DNA復性緩慢，經(jīng)過離心與蛋白質(zhì)和大分子RNA等發(fā)生共沉淀下去而被去除。【器材】超凈工作臺，接種環(huán)，酒精燈，臺式離心機，旋渦混合器，微量移液器，1.5ml微量離心管，恒溫搖床，試管，雙面微量離心管架，試管架，標簽紙，磁力攪拌機?！驹噭縫ET-28a質(zhì)粒載體菌, LB培養(yǎng)基1000ml（含10mg/ml卡那霉素），葡萄糖/Tris/EDTA 溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液 （溶液 II），KAc溶液

3、（pH4.8）（溶液 III），RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）?！緦嶒灉蕚洹?1. 配制卡那霉素儲存液（無菌水配制10mg/ml，分裝后-20°C保存）。2. 配制LB培養(yǎng)基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL 雙蒸水攪拌完全溶解，用約200mL 5N NaOH調(diào)pH至7.0，加雙蒸水至1L，121°C滅菌20min）。3. 溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）。溶液可成批配制，每瓶約100ml,在高壓下蒸氣滅菌15分鐘，

4、貯存于4。溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸調(diào)pH4.8，補雙蒸水至100ml）。4. 70%乙醇（-20°C保存）。5. TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA ，pH8.0）。6. 試管洗凈并塞上棉塞，1.5ml離心管裝入滅菌盒，移液器吸頭裝入相應的吸頭盒，高壓滅菌（121°C， 30min）。【操作步驟】1. 在超凈工作臺中取5ml LB（Amp+），加入滅菌的試管中。2. 取出保存的攜帶pET-28a質(zhì)粒的菌種, 在超凈工作臺上用接種環(huán)移取少

5、量菌種至5ml無菌的LB培養(yǎng)液（含10ug/ml卡那霉素）中，37°C搖床中振蕩培養(yǎng)20h。3. 取1ml的菌液至1.5ml離心管中，12000 rpm離心1min，棄上清液（盡量棄干凈），留沉淀備用。4. 在沉淀中加入預冷的100ml 溶液I，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置5min。須確使細菌沉淀在溶液中完全分散。5. 加入200ml 溶液II，蓋緊管口，快速顛倒離心管次。應確保離心管的整個內(nèi)表面均與溶液接觸。切勿劇烈振蕩。冰浴中放置5min。6. 加入預冷的150ml 溶液III，蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，冰浴放置5min。7. 12000 rpm離心5min，小心吸

6、取400ml 上清液于另一個干凈的1.5ml離心管中，（不要將白色沉淀物帶入?。尤?00ml 95% 乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置5min。8. 12000 rpm離心10 min，小心棄掉上清液，加入500ml 70% 乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻。12000 rpm離心10 min，小心棄掉上清液，倒置盡量流盡。9. 再加入500ml 70% 乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻。12000 rpm離心10 min，小心棄掉上清液，盡量倒置棄干凈，可將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。10. 離心管倒置于37°C溫箱中（或室溫）空氣干燥10

7、分鐘。11. 加入10mLTE緩沖液，渦旋混合器上輕微振蕩混勻，離心機中瞬時離心將溶液收集于管底。用記號筆標記后放入冰箱中冷藏待電泳確認。12. 在剩余的菌液中倒入少許新潔爾滅，待溶液變清亮后隨廢液和剩余的冰塊一起倒入下水池。清理桌面，清洗儀器。13. 撰寫實驗報告?！舅伎肌坑绊懕緦嶒灲Y(jié)果的主要因素有哪些？實驗二 瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒DNA【目的】學會常用的瓊脂糖凝膠電泳法分離和鑒定DNA?！驹怼緿NA雙螺旋分子骨架兩側(cè)帶有含負電荷的磷酸根，在電場中會向正極方向移動。不同長度的DNA由于受到凝膠介質(zhì)的阻力不同，表現(xiàn)為不同的遷移率而被分開?！酒鞑摹侩娪緝x，水平凝膠電泳槽和梳子及其制膠模塊，2

8、50ml三角瓶，微波爐，臺式離心機，旋渦混合器，凝膠成像系統(tǒng)，分光光度計，微量移液取樣器，1.5ml離心管，雙面微量離心管架，試管架等。【試劑】 pET-28a，TAE電泳緩沖液，1000´溴化乙錠儲存液，電泳級瓊脂糖粉，10´加樣緩沖液（或6´加樣緩沖液），DNA分子量標準（DNA Ladder:100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500 bp）。 【實驗準備】 配制TAE電泳緩沖液（50´儲存液，pH約8.5：Tris堿 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd wate

9、r 定容至1L）；1000´溴化乙錠儲存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙錠溶于100mL 雙蒸水，4°C避光儲存）；10´加樣緩沖液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚藍）；6´加樣緩沖液；1.5ml離心管裝入滅菌盒，移液器吸頭裝入相應的吸頭盒，滅菌?！静僮鞑襟E】1. 稱取0.5g瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE電泳緩沖液(1´)，放入微波爐中加熱溶解（1min）。注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末，待完全熔化后停止微波（切不可讓膠溶液溢出到微波爐中！）。2. 戴上

10、線手套，從微波爐中取出三角瓶，置桌面上冷卻致50-60°C（手接觸瓶壁不感覺燙）。3. 把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至與模具的矮邊緣相平即可，不要把膠溶液溢到外面。靜置10-20分鐘待膠完全凝固。在水平電泳槽中加滿1´TAE電泳緩沖液。根據(jù)電泳槽的長度把電泳儀的電壓調(diào)至170V(10V/cm)，注意正負電極的位置連接正確。4. 待膠完全凝固后（15-20分鐘），小心拔出梳子。用手指捏住模具兩側(cè)的高邊緣取出模具和凝膠放入電泳槽中間的平臺上，凝膠要沒入電泳液中。凝膠上有樣品孔的一側(cè)要朝向電泳槽的負極。5. 剪1片光面紙（或封口膜），點6ml蒸餾水、

11、1ml 10´加樣緩沖液，再加入3ml質(zhì)粒DNA溶液制成10ml DNA樣品。6. 在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。用10ml的吸液頭分別將管中的樣品加入凝膠的加樣孔中（如果需要時，在相鄰的加樣孔中加入1.5-3ml DNA分子量標準物）。加樣時持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住這只手的手腕，以減少移液器的抖動?？吹剿{色的樣品吸管尖頭伸進加樣孔后（不能伸得太深，以免穿破凝膠的底部）緩緩將藍色的樣品壓入加樣孔中。切不可使藍色樣品流到孔外。7. 打開電源開關(guān)，樣品將形成一條藍色的橫帶向前移動（如果發(fā)現(xiàn)藍色向后移動，立即關(guān)閉電源，調(diào)換電極）。電泳將進行約30min。8. 當藍色的溴酚藍

12、遷移到距凝膠邊緣1cm時，關(guān)閉電源。取出模具和凝膠。9. 把凝膠小心反扣放入盛有EB的搪瓷盒中。放置約10分鐘后，取出用自來沖洗兩次。10. 清理垃圾。染有EB的凝膠要放到專用的垃圾袋中作專門處理，以免污染環(huán)境。11. 撰寫實驗報告?！舅伎肌浚?） 泳道中的質(zhì)粒DNA有幾條帶？為什么？（2） 影響本實驗結(jié)果的因素有哪些？實驗三 感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化【目的】了解和掌握感受態(tài)細胞制備與轉(zhuǎn)化的原理和操作步驟，獲得轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒pGEX-6p的轉(zhuǎn)化菌株?！驹怼哭D(zhuǎn)化作用是在一定條件下，一種特定的DNA分子（供體或稱轉(zhuǎn)化因子）轉(zhuǎn)入到一定的細菌體內(nèi)（受體菌），使其發(fā)生遺傳形狀改變的過程。在正常生長條件下，少

13、數(shù)細菌可發(fā)生轉(zhuǎn)化作用，但大多數(shù)細菌并不發(fā)生轉(zhuǎn)化，只有在一定條件作用下（如用Ca+處理細菌細胞或電刺激），細菌呈現(xiàn)感受狀態(tài)后，外源DNA才能轉(zhuǎn)化進入受菌體內(nèi)。因此，若想將外源DNA分子轉(zhuǎn)化進入一定的受菌體內(nèi)，通常需將受體菌先制備成易感受狀態(tài)。感受態(tài)通常指的是細菌具備吸收轉(zhuǎn)化因子的一種生理狀態(tài)。產(chǎn)生感受態(tài)細胞的理論機制目前除有一些假說外，并無統(tǒng)一的結(jié)論。一般說來，細菌細胞在對數(shù)生長的早中期，經(jīng)處理后，有一定的轉(zhuǎn)化能力，但在它們進入靜止生長期以后，就逐漸喪失。因此進行細菌細胞轉(zhuǎn)化時，掌握合適的細菌培養(yǎng)時機是很重要的。本實驗所用的供體DNA分子為一個重組質(zhì)粒，含有編碼日本血吸蟲谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST

14、）的基因。因此可在受體菌體內(nèi)將表達出GST。實驗中所用的受體菌為大腸桿菌BL21（DE3）選擇此菌株是因為可用乳糖替代IPTG作為目的基因表達的誘導劑，使實驗的進行更為經(jīng)濟?！酒鞑摹砍瑑艄ぷ髋_HBY恒溫搖床臺式高速離心機恒溫培養(yǎng)箱721分光光度計高壓滅菌鍋滅菌Eppendorf管 試管 微量移液槍 培養(yǎng)皿滅菌離心管 移液管 涂布棒【試劑】LB液體培養(yǎng)基： 1000ml含蛋白 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g，溶于950ml雙蒸水中，用NaOH調(diào)pH至7.0，然后定容為1000ml。15磅20分鐘高壓滅菌。需加抗菌素時，冷卻至50以下，加入相應濃度的抗菌素。LB固體培養(yǎng)基：向LB液體培

15、養(yǎng)基中加入2.0%的瓊脂粉，15磅20分鐘高壓滅菌，然后加入適量抗菌素，向每個平板中倒入15-20mlLB固體培養(yǎng)基，凝固后倒置，4保存。轉(zhuǎn)化試劑：CaCl2溶液（lM）：取54g CaCl2·6H2O溶于20ml無菌水中，15磅20分鐘滅菌后，分裝成小份于4保存。菌株與質(zhì)粒：大腸桿菌BL21（DE3）hsdSgal（cits857indlsam7ni5lacuv5-T7 genel）。質(zhì)粒pGEX-6p?！静僮鞑襟E和方法】1. 大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞的制備將一BL21（DE3）單菌落種于20mlLB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。取5ml上述菌液轉(zhuǎn)種于50ml培養(yǎng)液中

16、，37 振蕩培養(yǎng)約1小時，至0.D600值為0.4-0.5左右，停止培養(yǎng)，菌懸液于冰上冷卻10分鐘后，轉(zhuǎn)至40ml滅菌離心管中，在4，4000rpm離心10分鐘，棄上清，菌體懸于10ml預冷的無菌的0.1M CaCl2溶液中，冰浴15分鐘，然后在44000rpm離心10分鐘。棄上清，菌體重新懸于2ml預冷的無菌的0.1M CaCl2溶液中，置冰上3-4小時后即制得感受態(tài)細胞。2. 重組質(zhì)粒pGEX-6p DNA的轉(zhuǎn)化取上述感受態(tài)細胞200µ1，加重組質(zhì)粒DNA2µ 1（約10ngDNA），混勻后，冰上作用30分鐘，然后轉(zhuǎn)到42水浴 進行熱休克90秒，快速轉(zhuǎn)移樣品到冰浴，預冷

17、1-2分鐘，加0.8mlLB液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)45分鐘后取原液各0.2ml涂布Amp平板，同時將0.2ml感受態(tài)細胞涂布于Amp平板作為對照。倒置平板，37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16小時，觀察對照轉(zhuǎn)化的平板，觀察轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)的數(shù)目，計算轉(zhuǎn)化效率。所得的到的單菌落即為菌株BL21（DE3）pGEX-6p。 注：轉(zhuǎn)化效率計算公式如下： 轉(zhuǎn)化子總數(shù) 轉(zhuǎn)化頻率= DNA加入量 =轉(zhuǎn)化子/µg DNA 轉(zhuǎn)化子總數(shù)=轉(zhuǎn)化菌落數(shù)*稀釋倍數(shù)*轉(zhuǎn)化反應液體積【思考】：1. 試總結(jié)出實驗成功的關(guān)鍵步驟。2. 用乳糖作為BL21（DE3）菌株目的的基因表達的誘導劑的作用機制是什么？3. 在用氨芐青霉素作為

18、抗菌素篩選轉(zhuǎn)化子是，一般37培養(yǎng)時間不超過20小時，為什么？4. 氯化鈣轉(zhuǎn)化與電轉(zhuǎn)化相比有哪些優(yōu)點和缺點。實驗四 目的基因的表達及表達產(chǎn)物的初步提取【目的】 掌握目的基因的表達及其產(chǎn)物的提取方式，學會優(yōu)化外源基因的表達方法?！驹怼?要使目的基因的表達量達到一定規(guī)模，除了在細菌培養(yǎng)的數(shù)量上要擴大之外，還要嚴格控制最優(yōu)化表達條件，特別是控制培養(yǎng)溫度。因為我們知道，在誘導劑的誘導下，培養(yǎng)物在37情況下培養(yǎng)時，表達的目的蛋白以包涵體的形式存在，大量聚積在宿主細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，而當培養(yǎng)物在20情況下培養(yǎng)時，目的蛋白則以可溶狀態(tài)出現(xiàn)。 蛋白質(zhì)在大腸桿菌中高水平的表達，常常導致產(chǎn)生細胞質(zhì)顆粒，這些顆粒以包涵

19、體形式存在，能通過相差顯微鏡觀察到，并能通過離心的方法將其從細胞裂解物中分離出來，通過Triton X-100和EDTA或低濃度尿素的作用，即可獲得較純凈的包涵體，用8M尿素或6M鹽酸胍可以使包涵體溶解。而BL21（DE3）.pGEX-6p細菌在20被乳糖誘導時，產(chǎn)生可溶性的GST。這一可溶狀態(tài)的融合蛋白在經(jīng)過細胞裂解，除去細胞碎片，經(jīng)鹽析、脫鹽、離子交換柱層析，凝膠柱層析純化后，即可獲得較純凈的融合蛋白。鹽析、脫鹽、離子交換柱層析，凝膠柱層析純化目的蛋白將在下面實驗中詳細介紹，本實驗將只進行可溶性目的蛋白的初步提取。【器材】超凈工作臺高壓滅菌鍋恒溫搖床臺式高速離心機721分光光度計超聲波破碎

20、器蛋白質(zhì)SDS-PAGE系統(tǒng)試管 三角瓶 離心管【試劑】溶霉菌 （10mg/ml溶于10mM Tris Cl pH8.0）Triton-1000.5M/L 尿素8M/L 尿素裂解液： 50ml Tris Cl （pH8.0） 1mM EDTA 100mM NaCl含1mM ENTA的PBSPBS： NaCl 8g， KCl0.2g， Na2HPO41.44g， KH2PO4 0.24g加雙蒸水800ml，用HCl調(diào)pH到7.4，再加水到1000ml，分裝后，15磅20分鐘滅菌。100mM PMSF 母液：17.4mg/ml溶于異丙醇，-20保存?！静僮鞑襟E和方法】 1.誘導表達 將一BL21（

21、DE3）pGEX-6p的單菌落接種于50ml含Amp（100µg/ml）的LB液體培養(yǎng)基中，37，250rmp振蕩培養(yǎng)過夜。分別取10ml轉(zhuǎn)種于150ml含Amp（100µg/ml）LB液體培養(yǎng)基中， 37，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD600值為1.0，加入10%乳糖至終濃度為1%，從各自加乳糖誘導開始計時，在20，250rpm振蕩培養(yǎng)16小時。各取1ml菌液經(jīng)煮沸理裂解后進行12%SDS-PAGE檢測，將剩余的培養(yǎng)物離心收集菌體。 2.可溶性目的蛋白的提純： 將經(jīng)20誘導表達的BL21（DE3）pGEX-6p菌液小心轉(zhuǎn)入離心管中，4 ，000rpm離心收集菌體，按3ml

22、/g（濕重）加入含1mM EDTA 的PBS，加入8µl 50mM PMSF懸浮液。加入80µl溶霉菌（10mg/ml）作用30分鐘，超聲波處理菌懸液，每間隔1分鐘超聲波處理30秒，反復進行，直至細菌裂解。在4下，13，000rpm離心15分鐘，上清即為含有目的蛋白的粗提液。取100µl粗提液進行12%SDS-PAGE凝膠電泳檢測。將此粗提液經(jīng)過鹽析、脫鹽、離子交換層析，凝膠柱層析純化，即可獲得目的蛋白純化產(chǎn)品，最后的純化實驗將在以后進行?！舅伎肌?請思考溶菌酶和超聲波處理在細菌細胞裂解過程的作用有何不同？實驗五 蛋白質(zhì)純化鹽析沉淀法【目的】采用硫酸銨鹽析法將日本

23、血吸蟲谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶融合蛋白從大腸桿菌BL21（DE3）pGEX-6p細胞裂解液中分離出來，使學生學習掌握制備細胞裂解液的技術(shù)和采用鹽析法從中分離目的蛋白質(zhì)的技術(shù)。【原理】 用鹽析法從成分復雜的蛋白質(zhì)溶液（如細胞裂解液）中提取目的蛋白質(zhì)是一種傳統(tǒng)的目前仍被廣泛使用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)。此種技術(shù)的工作原理如下：蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，其溶解度會隨鹽濃度的升高而增加，此種現(xiàn)象被稱作鹽溶。但是當鹽的濃度繼續(xù)增高時，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度地下降并先后從溶液中析出，此種現(xiàn)象被稱為鹽析。上述現(xiàn)象 是由于蛋白質(zhì)分子中極性基團之間存在靜電力。在低鹽濃度下，蛋白質(zhì)分子中極性基團之間的靜電力受鹽離子的影響而被消

24、除，蛋白質(zhì)在水中的極性基團的電荷被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)分子之間相互聚集并從溶液中析出。鹽析法就是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達到彼此分離的方法。 鹽析的一般操作步驟是，選擇一定濃度范圍的鹽溶液（如0-25%飽和度的硫酸銨）使部分雜質(zhì)呈“鹽析”狀態(tài)從溶液中沉淀出來，經(jīng)離心法去除。而目的蛋白質(zhì)呈鹽溶狀態(tài)，存在于上清中。增加鹽濃度（如25-60%飽和度的NH4SO4）使目的蛋白質(zhì)呈鹽析狀態(tài)，而從溶液中分離出來。在鹽析時，蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強度的關(guān)系，可用下式表示： Slg = -Ks×I S0式中的S為蛋白質(zhì)在離子強度為I的溶解度，S0蛋白質(zhì)在

25、純水（離強度為0）中的溶解度；KS為鹽析常數(shù)。離子強度I可用下式表示：I=1/2Z2式中，M-溶液中各種離子克分子濃度 Z-各種離子所帶的電荷數(shù)在溫度恒定時，S0對于某一種蛋白質(zhì)在某一溶液中的溶解度是一個常數(shù)，lgS0也為一常數(shù)，以代替，故式（1）可以改寫為：lgS=-Ks×I （3）值主要與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，鹽離子的平均半徑以及鹽離子的電荷數(shù)有關(guān)，也受溶液中的氫離子濃度（PH值）和溫度影響。一般來說，蛋白質(zhì)在某一鹽溶液中的鹽析系數(shù)-KS越大，鹽析效果越好。由于蛋白質(zhì)含有許多親水基團，需要在較高的I植下才能從溶液中析出。由式（3）可以看出，在一定的溫度和PH值下，改變鹽的離子強度（I）可

26、以把不同的蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來。此種方法稱為“KS分段鹽析法”,常用于蛋白質(zhì)的初步提純。在一定的的I值下，改變溫度及PH值，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來，稱為“分段鹽析法”，常用蛋白質(zhì)純化過程的后期，特別是某些蛋白質(zhì)結(jié)晶析出時。蛋白質(zhì)鹽析常用硫酸銨等中性鹽。硫酸銨因其溶解度大（25時的飽和硫酸銨溶液的摩爾濃度為4.1M，即767克/升，0時為3.9M，676克/升），溫度系數(shù)小而被廣泛使用。硫酸銨價格便宜，不易引起蛋白質(zhì)變性并具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，分段效果比其他鹽類好，廢液可以作肥料，對環(huán)境無污染。其缺點是，其NH+4對用凱氏定氮測定蛋白質(zhì)含量有干擾，硫酸銨溶液的PH常在4.5-5.5之間,其緩

27、沖能力比較差。有時用硫酸鈉.。蛋白質(zhì)鹽析時,鹽的濃度一般以飽和度表示，飽和溶液的飽和度定為100%。用硫酸銨鹽析時，溶液飽和度調(diào)度方法有三種，一是當?shù)鞍踪|(zhì)溶液體積不大，需調(diào)正的濃度不高時，可以向蛋白質(zhì)溶液中添加飽和鹽溶液。另一種方法是向蛋白質(zhì)溶液中直接添加磨碎的鹽結(jié)晶粉末，此種方法用于需要的鹽濃度高，而且蛋白質(zhì)溶液體積不宜過分增加時。第三種方法是將待鹽析蛋白質(zhì)的溶液裝于透析裝內(nèi)對飽和硫酸銨進行透析，此法鹽濃度變化比較連續(xù)平穩(wěn)，不會出現(xiàn)局部過高現(xiàn)象。但是鹽析時需要測定鹽的飽和度，過程復雜，較少應用。采用方法一時，所需添加的飽和鹽溶液的體積可按下式計算： S2-S1V=V0 1-S2式中，V飽和鹽

28、溶液的體積 V0原溶液的體積 S1原溶液的飽和度 S2要達到的飽和度采用第二種方法時，可從附表一中選擇要達到某一濃度時所需添加的固體硫酸銨量。影響蛋白質(zhì)鹽析的因素：（1） 蛋白質(zhì)溶液中鹽的濃度。不同蛋白質(zhì)的鹽析要求鹽的飽和度不同。從成分復雜的蛋白質(zhì)溶液中分離蛋白質(zhì)時，鹽的飽和度應由稀到濃漸次增加。每出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀就應將其分離除去后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第二種蛋白質(zhì)沉淀出來；（2） 蛋白質(zhì)溶液的PH值。在蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最小而容易沉淀出來，因此鹽析時應將PH值調(diào)節(jié)在目的蛋白質(zhì)的等電點附近；（3） 蛋白質(zhì)濃度。在相同鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越大越易被鹽析沉淀。但是濃度太高時，

29、易使雜蛋白共沉淀；（4） 溫度。濃鹽溶液對蛋白質(zhì)有一定的保護作用，因此一般的鹽析操作可以在室溫下進行?！静牧虾推鞑摹?. 實驗材料（1） 大腸桿菌BL21（DE3）pGEX-6p細胞裂解液，由上一實驗提供（2） 分析純硫酸銨：用干凈的磁研缽研成細粉末。30%三氯乙酸,SDS-PAGE所需試劑2. 器材100ml燒杯，50ml離心管，高速冷凍離心機,微量離心管(1.5ml)10支,聚丙烯酰胺凝膠電泳儀一臺,1ml,200l,20l移液器各1把,1ml,200l和20l槍各1支,微量離心管支架,磁力攪拌器及攪拌磁棒?！静僮鞑襟E和方法】1. 鹽析曲線的測定對于一求知鹽析特性的蛋白質(zhì)來說，用鹽析作為一

30、純化步驟時，應首先用實驗確定使此種蛋白質(zhì)鹽析沉淀出來的最佳飽和度，其測定方法如下： （1）取7支微量離心管，用記號筆在管帽上標記20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%；（2）以上述離心管作容器分別稱取磨細的硫酸銨晶體末0.057克、0.088克、0.122克、0.156克、0159克、0.235克和0.281克；（3）分別向上述裝有（NH4）2SO4粉末的離心管中添加0.5ml細胞裂解液，充分振蕩使（NH4）2SO4溶解后，在室溫下靜置2小時；（4）將離心管放置于離心機中，以1000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速離心5分鐘后，傾去上清，倒立離心管，以便盡可能多地去除上清；（5）添加0.5ml蒸餾水

31、及8l30%三氯乙酸混勻,靜置10分鐘后,離心,盡量去除上清；(因此步會造成蛋白質(zhì)不溶影響后續(xù)工作，所以省略) （6）將離心管置于快速干燥器中干燥30分鐘；（7）向離心管中添加100ISDS-PAGE上樣緩沖液懸浮沉淀后，在沸水浴中煮沸3分鐘，取出置-20冰箱中備用；（8）制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠；按下列上樣順序向加樣孔中添加10l 樣品：樣孔 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10包涵體樣20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 包涵體 空白對照電泳分離后，染色、脫色、觀察目的蛋白質(zhì)出現(xiàn)在何種濃度的（NH4）2SO4鹽析樣孔中，以確定最佳的鹽析條件。2. 鹽析1. 將50m

32、l細胞裂解液置于100ml燒杯中，加入攪拌磁棒后放置在磁力攪拌器上2. 在攪拌狀態(tài)下緩緩加入研細的（NH4）2SO4末至最佳飽和度之前的一級飽和度，靜置2小時后,離心得上清3. 在攪拌下向上清中添加研細的（NH4）2SO4粉末，使終濃度達最佳飽和度，靜置2小時后離心收集目的蛋白沉淀4. 將沉淀的蛋白質(zhì)溶解于盡量小體積的磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，用Bradford試劑測定蛋白質(zhì)濃度后，置-20冰箱中保存?zhèn)溆谩！舅伎肌?1. 為提高蛋白質(zhì)鹽析分離效率，應采取哪些措施？2.為測定用硫酸銨鹽析法分離某種蛋白質(zhì)的最佳硫酸銨濃度，除采用本講義設(shè)計的操作程序之外，請你設(shè)計另一種工作程序測定鹽析目的蛋白質(zhì)的硫酸

33、銨最佳濃度，并指出兩種方法的優(yōu)缺點。a) 請你計算25時60%飽和度的硫酸銨溶液的離子強度。 實驗六 凝膠過濾層析【目的】掌握凝膠過濾層析的基本原理；學習凝膠層析的操作技術(shù)，包括凝膠材料的選擇、預處理、裝柱、上樣、洗脫、收集和樣品的檢測等；了解凝膠層析的應用如脫鹽和濃縮、分子量測定、大分子量混合物的分離純化等。【原理】凝膠層析是將樣品混合物通過一定孔徑的凝膠固定相，由于在層析過程中樣品不同的蛋白質(zhì)具有不同的洗脫，使不同的分子量的組分得以分離的層析方法。凝膠層析的分離過程是在裝有多孔物質(zhì)如交聯(lián)聚苯乙烯、多孔玻璃、多孔硅膠、交聯(lián)葡聚糖等填料的柱中進行的。填料顆粒含有許多不同大小的孔隙。這些孔隙對于

34、溶劑分子而言是很大的，他們可以自由擴散出入。對于溶質(zhì)分子而言，如果分子大小合適時，則可以不同程度地往孔隙中擴散，大分子量的溶質(zhì)分子只能占有較小的孔隙，而小分子量的溶質(zhì)分子除能占住大孔隙外，還可以占有另外一些起更小的孔隙。所以隨著溶質(zhì)分子尺寸的減小，其占有孔隙體積迅速增加。當具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過時，由于溶質(zhì)分子在孔隙中溶劑與顆粒溶劑之間進行擴散分配的差異造成較小的分子在柱中停留的時間比大分子停留的時間要長，所以整個樣品按分子大小順序而分開，最先洗脫出來是最大的分子。其定量關(guān)系符合以下公式：Ve=Vo+KV1Ve：某一溶質(zhì)的洗脫體積Vo：層析柱的外水體積Vi：層析柱的內(nèi)水體積K

35、：某一溶質(zhì)的分配系數(shù)【試劑】(1) Sephadex G-75(2) 0.005M PBS(3) 蘭色葡聚糖(4) 樣品溶液【器材】 （1）帶夾套層析柱：h=1:24（2）加樣器 （3）分部收集器 （4）核酸蛋白檢測儀 （5）小玻棒【操作步驟】（1）凝膠的選擇和預處理本實驗樣品中含有分子量差異不大的多中組分，其中目的物為分子量60kd 的可溶性蛋白質(zhì)，因此屬大分子化合物的分離純化，故選用SephadexG-75。對球形蛋白質(zhì)而言，其排阻限為3000-70000。稱取40g SephadexG-75，加入10倍以上吸液量的蒸餾水浸泡，在水浴加熱時充分膨脹。（2）層析柱的選擇對于大分子量化合物的分

36、級分離，要求柱床體積大于樣品體積25倍以上，最高可達100倍，層析柱的徑高比也在25-100之間。為了減少溫度對分離蛋白質(zhì)活性的影響，層析柱外加夾套，通入低溫循環(huán)水，以保持低溫。（3）凝膠柱的裝填和凝膠床的檢查將層析柱垂直固定，層析柱預裝1/5的平衡溶液，再將適當濃度的凝膠懸液緩慢灌入層析柱中。灌膠前應打開柱端閥門，保持一定流速。灌裝過程中，為防止管壁效應，邊灌裝邊攪拌，使凝膠顆粒均勻沉降。對于裝好的層析柱，先察看有無凝膠分層、溝流、氣泡等現(xiàn)象。如果沒有這些現(xiàn)象，就用2倍以上的柱床體積的洗脫液按正常操作流速過柱，以穩(wěn)定柱床。加液前最好在床面上加上快速濾紙片，防止加液時沖動床面，破壞床面平整。為

37、了進一步檢查凝膠柱的質(zhì)量，通常用大分子有色物質(zhì)溶液過柱，觀察柱床有無斷層、溝流，色帶是否平整。常用0.2%-0.3%的蘭色葡聚糖溶液（蘭色葡聚糖分子量為2000kd），加入量為每平方厘米床面0.5-1.0毫升。同時也可測定層析柱的外水體積。蘭色葡聚糖在260nm及610nm處各有一個吸收峰。（4）樣品預處理及加樣蛋白質(zhì)樣品濃度一般以不大于4%為宜，溶劑為洗脫液。如樣品渾濁，應先過濾或離心除去顆粒后再上柱。將床面多余的洗脫液除掉，吸至離層析床面2厘米處為止。將出口打開，使床面的洗脫液流至1毫米，關(guān)閉出口。用加樣器將樣品加入床表面1厘米左右，再打開出口，使樣品滲入凝膠內(nèi)。樣品加完后，用盡量少的洗脫

38、液洗滌表面1-2次。當樣品完全滲入凝膠內(nèi)后，再仔細加入洗脫液至離床面3-4厘米處，即可接上洗脫瓶進行層析。（5）洗脫與收集為了防止柱床體積的變化，造成流速降低及重復性下降，整個洗脫過程應始終保持一定的操作壓。流速不能過快且要穩(wěn)定。洗脫液的成分不應改變。洗脫液采用分部收集器收集，以核酸蛋白檢測器檢測洗脫峰。（6）層析柱再生層析柱在合理使用情況下一般無需再生即可多次重復使用。如長期使用會造成層析柱板結(jié)，不溶物污染及嚴重吸附等，影響流速或分離效果，因此需要再生。最簡單的方法是用水反沖。（7） 目的蛋白檢測【思考】1 制備型凝膠柱層析洗脫液檢測與收集經(jīng)常分流，為什么？2 SephadexG-75凝膠柱

39、操作壓與流速控制在多大范圍比較適宜？ 實驗七 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗（Western Blotting）【目的】了解蛋白質(zhì)免疫印跡實驗的基本原理，學會操作步驟，并能自行設(shè)計檢測蛋白質(zhì)的實驗?！驹怼?Western Blotting 是相對于核酸檢測方法Southern Blotting、Northern Blotting 而命名得來的，它是用來檢測蛋白質(zhì)的一種技術(shù)。在這個技術(shù)中，首先將含有待測蛋白的蛋白質(zhì)混合物進行凝膠電泳分離，然后將已經(jīng)分離的蛋白質(zhì)通過電泳技術(shù)從凝膠轉(zhuǎn)移到固體支持物上，這一固體支持物目前常為硝酸纖維素薄膜。隨后以待測蛋白質(zhì)上抗原決定簇特異性的抗體（稱為第一抗體）為探針，與固體支

40、持物上的蛋白質(zhì)進行免疫反應，最后用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶的抗第一抗體的抗體（第二抗體）與第一抗體進行免疫反應，只有與第一抗體特異性結(jié)合的待測蛋白才能與第二抗體發(fā)生免疫反應。在有辣根過氧化物酶的底物用顯色劑存在時就會出現(xiàn)顏色反應，結(jié)合有第一抗體、第二抗體的待測蛋白，通過顏色反應即能顯現(xiàn)出來。電泳將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固體支持物上是通過電轉(zhuǎn)移儀器完成的。它是將固體支持物面對陽極、凝膠面對陰極，二者結(jié)合在一起，然后將外面二側(cè)用Whatman 3MM濾紙結(jié)合，形成“三明治”結(jié)構(gòu)，放入電轉(zhuǎn)移儀器上，加入電泳緩沖液，通上電源后，蛋白質(zhì)即可從凝膠上轉(zhuǎn)移到固體支持物上。上面簡要介紹了蛋白質(zhì)免疫印跡實

41、驗的基本原理。具體到本實驗是為了前面實驗所表達的GST-NS53 融合蛋白，所以本實驗第一抗體為兔抗GST 蛋白質(zhì)抗體，第二抗體為偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的羊抗兔免疫球蛋白抗體。【器材】電轉(zhuǎn)移儀器恒溫搖床硝酸纖維素薄膜Whatman 3MM濾紙電泳儀 裁紙刀 手表25cm培養(yǎng)皿 玻璃棒【試劑】電轉(zhuǎn)移緩沖液 pH8.339mM甘氨酸4.8mM Tris堿0.037% SDS20% 甲醇混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲醇，定容到1000ml.封閉緩沖液：5%（W/V）脫脂奶粉溶于PBS中PBS: NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2

42、PO4 0.24g 加雙蒸水800ml,用HCl調(diào)pH到pH7.4,再加水到1000ml,分裝后，15磅20分鐘滅菌。4-氯萘酚顯色液：用30mg 4-氯萘酚（簡稱4-CN）溶于1ml無水乙醇中制成母液。將5014-CN對母液和5130%的H2O2加入到5ml 0.05M/L Tris-Cl(pH7.6)中。 氨基黑染色液：0.1%氨基黑10-B、45%甲醇、10%冰乙酸氨基黑脫色液：90%甲醇、2%冰乙酸、8%水【操作步驟和方法】1. 蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移戴上手套，取下SDS-PAGE凝膠，小心剝離凝膠。裁剪與凝膠同樣大的硝酸纖維素薄膜和六層Whatman 3MM濾紙，在硝酸纖維素薄膜左下角剪去一角

43、作為標記。將硝酸纖維素薄膜漂浮于去離子水的表面，使水從膜的下部浸透以去除其間氣泡，將Whatman 3MM濾紙在電轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕，用蒸餾水淋洗石墨電極，先將三層浸濕的濾紙放在陽極上，在濾紙表面滾動玻璃棒以除去其間的氣泡，再將浸濕的硝酸纖維素薄膜小心平鋪在濾紙上，用玻璃棒小心去除氣泡。隨后將12%SDS-PAGE凝膠舒展平鋪在硝酸纖維素薄膜上，用玻璃棒小心去除氣泡，再將三層浸濕的濾紙平鋪在凝膠上，沁心去除氣泡，最后加上石墨電極板，接通電源進行電轉(zhuǎn)移，電流的大小由凝膠的大小決定，為0.65mA/平方厘米。電轉(zhuǎn)移2小時后，停止通電，卸掉電轉(zhuǎn)移裝置，取下凝膠進行考馬斯亮蘭染色，以檢測電轉(zhuǎn)移是否完全。

44、小心取下硝酸纖維素薄膜，放在一張干濾紙上，吸干30-60分鐘后，開始進顯色反應。2. 顯色反應首先進行分子量標記的氨基黑染色。切下轉(zhuǎn)有分子量標記的硝酸纖維素薄膜，用含有0.3%吐溫20的PBS緩沖液漂洗三次后（每次15分鐘），再將其浸入氨基黑染液中，室溫染色5分鐘，然后置于氨基黑脫色液中脫去背景，水中漂洗后景干備用。轉(zhuǎn)有樣品的硝酸纖維素薄膜用含有5%脫脂牛奶的PBS緩沖液在室溫下封閉2小時，同時1：100加入兔抗GST第一抗體，平緩搖動，室溫保溫1小時。然后用PBS緩沖液將硝酸纖維素薄膜漂洗4次，每次 30分鐘。將辣根過氧分物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白第二抗 體用封閉液稀釋50倍后，加入吐溫20至終濃度為0.05%，然后與上述漂洗的硝酸纖維素薄膜進行反應，將膜浸于其中，平放在平緩搖動的搖床平臺上，室溫溫育 1小時后，用PBS緩沖液將硝酸纖維素薄膜漂洗4次，每次5分鐘，再加入4-氯萘酚顯色液，加入 51 的30%H2O2，將硝酸纖維素薄膜置于其中緩慢搖動，待所檢測的蛋白帶顯色達到最深程度后，將硝酸纖維素薄膜轉(zhuǎn)