艱難梭菌細(xì)胞毒素B功能區(qū)的表達(dá)

1、艱難梭菌細(xì)胞毒素B功能區(qū)的表達(dá)作者：時間：2007-11-22 11:38:00 作者：劉紅升，張清華，姜泊，蔣知新【關(guān)鍵詞】 艱難梭菌,細(xì)胞毒素B；克隆,分子；基因表達(dá)【關(guān)鍵詞】 艱難梭菌，細(xì)胞毒素B；克隆，分子；基因表達(dá)1材料和方法1.1材料限制性核酸內(nèi)切酶，T4DNAligase購自New England Biolab公司. 厭氧發(fā)生劑、腦心浸液(干粉)購自生物梅里埃公司(bioMerieux). 其他試劑為國產(chǎn)分析純. 艱難梭菌（clostridium difficile, C.d VPI10463）從蘭州生物制品研究所購買. 大腸桿菌菌株BL21(DE3)及質(zhì)粒PET22b(+)系南

2、方醫(yī)科大學(xué)消化研究所存. 1.2方法2結(jié)果2.1PCR擴(kuò)增的目的基因電泳分析發(fā)現(xiàn)在1800 bp左右有一條帶，大小與預(yù)計相符(圖1). 圖1瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物 略2.2重組質(zhì)粒的鑒定將獲得重組質(zhì)粒命名為PET22b(+)CDB3，電泳初步鑒定結(jié)果與預(yù)期相符（圖2）. 直接以PET22b(+)CDB3為模板進(jìn)行測序,得到的序列，與Gene bank記錄的C.d VPI10463的ToxinB3基因序列的同源性為99%. 圖2目的基因的PCR產(chǎn)物、重組質(zhì)粒和PET22b（+）載體用EcoRI單酶切的圖譜略2.3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,120 g/L SDS PAGE分析表明,含有P

3、ET22b(+)CDB3宿主菌表達(dá)出Mr約為71.3103，與預(yù)期的蛋白大小相符，含質(zhì)粒pET 22b(+)及無質(zhì)粒的細(xì)菌則無此特異條帶. 在A600 nm值為0.8，IPTG終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)4 h時，重組蛋白的表達(dá)量最大，以可溶性蛋白為主，便于純化. 凝膠自動掃描分析,其PET22b(+)CDB3重組蛋白占細(xì)菌周質(zhì)總蛋白的34%,可溶性表達(dá)占上清的22.7%，包涵體占沉淀的25.7% (圖3). 圖3CDB3基因誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE分析略3討論C.d是腸道感染中僅次于彎曲桿菌的常見致病菌，產(chǎn)生的毒素A與毒素B對人體造成危害，被公認(rèn)為發(fā)達(dá)國家中最重要的院內(nèi)感染源之一1.

4、雖然口服甲硝唑或萬古霉素治療可取得較好的療效，但目前已存在耐藥及停藥后復(fù)發(fā)等問題. 疫苗接種可使高危人群獲得持久和較強(qiáng)的免疫力，是預(yù)防與控制感染的有效措施2. C.d重組抗原的研究已見較多的報道，但多數(shù)是集中在毒素A上3，而對毒素B的研究則相對較少. Genth等4的研究將毒素B分成3個氨基酸片段：CDB1（氨基酸1546），CDB2（氨基酸 9011750），CDB3（氨基酸17512366），發(fā)現(xiàn)抗毒素B抗體與CDB3可以發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，抗C.d抗體既與CDB1又能與CDB3 反應(yīng)，CDB2則與兩抗體均不反應(yīng). 說明CDB3是良好的抗原. 進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，只有抗CDB3抗體才能保護(hù)完整細(xì)胞免

5、受毒素B的細(xì)胞毒性，而抗CDB1抗體只有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能起保護(hù)作用 . 說明該段很有可能成為制備疫苗和診斷抗原的重要候選蛋白. 故選取了毒素B羧基末端CDB3 (氨基酸17512366)進(jìn)行表達(dá)，為以后的疫苗和抗原鑒定的研究建立基礎(chǔ). 本研究參考C.d國際標(biāo)準(zhǔn)株VPI 10463基因序列，用自行設(shè)計的CDB3引物在PCR反應(yīng)中表現(xiàn)出較高的特異性，為理想的引物序列. 在上、下游引物中分別加入EcoRI與XhoI酶切位點，保證了讀碼方向的正確性. 為便于下一步的表達(dá)和純化工作又將其裝入了末端帶有His標(biāo)簽的融合表達(dá)載體，酶切鑒定和測序結(jié)果顯示獲得了帶有特異的CDB3基因. 蛋白電泳分析表明獲得了高效

6、表達(dá)的C.d ToxinB3克隆株，本實驗所表達(dá)的蛋白，與該基因編碼的蛋白的分子質(zhì)量大小是一致的，更進(jìn)一步驗證了克隆的目的基因的正確性. 因此,本研究為研制C.d重組疫苗及制備診斷試劑奠定了一定的基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】1Bartlett JG. Clinical practice. Antibioticassociated diarrheaJ. N Engl J Med, 2002,346(5):334-339.2SougiltzisS, KyneL, DrudyD, et al. Clostridium difficile toxoid vaccine in recurrent C.diffic

7、ile associated diarrheaJ.Gastroeterology,2005,128(3):764-770.3Ward SJ, Douce G, Figueiredo D, et al. Immunogenicity of a salmonella typhimurium aroA aroD vaccine expressing a nontoxic domain of Clostridium difficile toxin AJ. Infect Immun, 1999, 67(5):2145-2152. 4Genth H, Selzer J, Busch C, et al. New method to generate enzymaticall