發(fā)酵染菌原因分析

1、發(fā)酵染菌原因分析第一局部：根底知識(shí)1雜菌的類型 空氣中的微生物大多數(shù)是細(xì)菌和芽孢 ,還有一定數(shù)量的霉菌、 酵母和病毒。 細(xì) 菌的大小有 零點(diǎn)幾微米至幾個(gè)微米 .根據(jù)以上特點(diǎn)我們應(yīng)得出如下結(jié)論：A ：這些微生物在空氣中極少單獨(dú)游離存在 , 根本上是附著于灰塵、液滴等微粒的外表上。B: 介質(zhì)過濾除菌就是把空氣中的各種微粒和極少量的游離微生物捕集起來予以除掉。因此我們通常所用的空氣過濾器為什么 0.3u 可以保證無菌發(fā)酵生產(chǎn)的原因。2無菌檢查與染菌的處理在抗生素生產(chǎn)過程中 ,為了及早發(fā)現(xiàn)染菌并進(jìn)行恰當(dāng)處理,保證生產(chǎn)正常進(jìn)行 , 對(duì)菌種制 備、種子罐、發(fā)酵罐的接種前后和培養(yǎng)過程中,須要按工藝規(guī)程要求按

2、時(shí)取樣，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。A : 無菌檢查 培養(yǎng)液是否污染雜菌可從三個(gè)方面進(jìn)行分析 :a:無菌試驗(yàn)b: 培養(yǎng)液的顯微鏡拉查c :培養(yǎng)液的生化指標(biāo)變化情況。其中無菌試驗(yàn)是判斷染菌的主要依據(jù)。無菌試驗(yàn) 現(xiàn)在采用的無菌試驗(yàn)方法有肉湯培養(yǎng)法、雙碟培養(yǎng)法、斜面培養(yǎng)法。其中以酚紅肉湯 培 養(yǎng)法和雙碟培養(yǎng)法結(jié)合起來進(jìn)行無菌檢查用的較多。1肉湯培養(yǎng)法 直接用裝有酚紅肉湯的無菌試管取樣 ，然后放入 37C 恒溫室箱內(nèi)培 養(yǎng)。定時(shí)觀察試管內(nèi)肉湯培養(yǎng)基的顏色變化,同時(shí)進(jìn)行顯微鏡觀察。2 斜面培養(yǎng)法先用空白無菌試管取樣 ,然后在無菌條件下接種于斜面培養(yǎng)基上,置于 37C恒溫室 箱內(nèi)培養(yǎng)。定時(shí)觀察有無雜菌菌落生長。3 雙碟

3、培養(yǎng)法種子罐樣品先取入肉湯培養(yǎng)基中,然后在無茵條件下在雙碟培養(yǎng)基上面劃線,剩下的肉湯培養(yǎng)物在恒溫室 箱內(nèi)培養(yǎng) 6 小時(shí)后復(fù)劃線一次 ,發(fā)酵罐培養(yǎng)液直接取入空 白無 菌試管中 ,于 37C 下培養(yǎng) 6 小時(shí)后在雙碟培養(yǎng)基上劃線。 24 小時(shí)內(nèi)的雙碟定時(shí)在燈光下 檢查有無雜 菌生長。 24 小時(shí)48 小時(shí)的雙碟 1 天檢查一次 ,以防生長緩慢的雜菌漏檢。正常生產(chǎn)過程中 ,種子罐和發(fā)酵罐每隔 8 小時(shí)取樣一次 ,進(jìn)行無菌檢查。該方法經(jīng)常用于單菌落挑選，可以從染有雜菌的培養(yǎng)液中經(jīng)屢次劃線挑取單菌落進(jìn)行別離培養(yǎng)， 得到純種的種子。無菌試驗(yàn)的結(jié)果一般需要 812 小時(shí)才能作出判斷。為了縮短判斷時(shí)間,有時(shí)向

4、培養(yǎng)基中 參加赤霉素、對(duì)氨基苯甲酸等生長激素以促進(jìn)雜菌的生長。B: 染菌的判斷培養(yǎng)基的染菌判斷是錯(cuò)綜復(fù)雜的工作 ,又是一種細(xì)微觀察、 認(rèn)真分析的王作 染菌罐的判斷方法： 以無菌試驗(yàn)中的酚紅肉湯培養(yǎng)和雙碟培養(yǎng)的反響為主 ,以鏡檢為輔。 每個(gè)無菌樣品的無菌 試驗(yàn)， 至少用 2 只酚紅肉湯或斜面同時(shí)取樣培養(yǎng)。要定量或用接種環(huán)蘸取法取樣，公司現(xiàn)階 段根本都直接 從發(fā)酵罐直接取樣。因取樣量不同 ,影響顏色反響和渾濁程度的觀察。如果連續(xù) 3 個(gè)時(shí)間的酚紅肉湯 無菌樣發(fā)生顏色變化或產(chǎn)生渾濁 ,或斜面連續(xù) 3 個(gè)時(shí)間樣品長出雜菌即判 斷為染菌。有時(shí)酚紅肉湯 反響不明顯 ,要結(jié)合鏡檢確認(rèn)連續(xù) 3 個(gè)時(shí)間樣品染菌

5、，即判為染菌。 各級(jí)種子罐的染菌判斷亦參照 上述規(guī)定。對(duì)肉湯和無菌斜面的觀察及保存期的規(guī)定 ,發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后應(yīng)取無菌樣，以后每隔 8 小 時(shí)取 無菌樣一次，直至放罐。無菌試驗(yàn)的肉湯和雙碟應(yīng)保存并觀察至本罐批放罐后 12 小時(shí)， 確認(rèn)無雜菌污染前方可棄去。無菌檢查時(shí)間應(yīng)每 6 小時(shí)觀察一次無菌試驗(yàn)樣品，以便能及早 發(fā)現(xiàn)染 菌。2、染茵率的統(tǒng)計(jì)以發(fā)酵罐染菌罐批 次為基準(zhǔn), 染菌罐批 次應(yīng)包括染菌重消后的重復(fù)染菌的灌批次 在內(nèi)。發(fā)酵總過程 全周期 無論前期或后期染菌 ,均作“染菌論處。發(fā)酵罐染菌罐批 次 染菌率% = X100%總投罐批 次3染菌 包括染噬菌體 的處理一污染雜菌的處理發(fā)酵罐污染雜菌

6、后 ,依據(jù)染菌時(shí)間、所染雜菌的危害性及時(shí)進(jìn)行處理 ,同時(shí)對(duì)所涉及的設(shè)備 也 要及時(shí)處理。a. 種子罐染菌的處理種子罐染菌后都不能往下道工序移種 ,要及時(shí)用高壓蒸汽直接滅菌后經(jīng)過濾處理放下水。b. 發(fā)酵罐染菌的處理發(fā)酵罐前期染菌 ,污染的雜菌對(duì)產(chǎn)生菌的危害性大 ,采用蒸汽滅菌經(jīng)過濾處理后放掉 ;如果 危害 性不大 ,可用重新滅菌、重新接種的方式處理 ,如營養(yǎng)成分消耗較多 ,可放掉局部培養(yǎng)液補(bǔ) 入局部新 培養(yǎng)基后進(jìn)行滅菌 ,重新接種；如污染的雜菌量少且生長緩慢 ,可以繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)下去 ,但 要時(shí)刻注意雜 菌數(shù)量和代謝的變化。 在發(fā)酵的中后期染菌 ,一是參加適量的殺菌劑 ,如呋喃西林 或某些抗生素 ,

7、抑制雜菌的生長。二是降低培養(yǎng)溫度或控制補(bǔ)料量來控制雜菌的生長速度。如 果采用上述兩種措施 仍不見效 ,就要考慮提前放罐。C、染菌后的設(shè)備處理. 染菌后的罐體用甲醛等化學(xué)物質(zhì)處理 ,再用蒸汽滅菌包括各種附屬設(shè)備 。在再次投料 之前 , 要徹底清洗罐體、附件 ,同時(shí)進(jìn)行嚴(yán)密程度檢查 ,以防滲漏。染菌后的處理尤為重要，很 多大面積染菌都是由于處理不徹底而造成的系統(tǒng)污染，造成無法及時(shí)處理好各個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)連 續(xù)污染。 二 污染噬菌體的處理 抗生素等產(chǎn)品發(fā)酵過程中有時(shí)出現(xiàn)噬菌體污染 ,輕者造成生產(chǎn)能力 大幅度下降 ,重者造成 停產(chǎn)。一般噬菌體污染后往往出現(xiàn)發(fā)酵液突然轉(zhuǎn)稀 ,泡沫增多 ,早期鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體染色不

8、均勻， 在 較 短時(shí)間內(nèi)菌體大量自溶 ,最后僅殘留菌絲斷片 ,平皿培養(yǎng)出現(xiàn)典型的噬菌斑 ,溶氧濃度上升提 前 ,營養(yǎng) 成分很少消耗 ,產(chǎn)物合成停止等現(xiàn)象。發(fā)酵過程中污染噬菌體后，一般做如下處理：1.發(fā)酵液用高壓蒸汽滅菌后放掉 ,嚴(yán)防發(fā)酵 液任意流失； 2.全部停產(chǎn) ,對(duì)環(huán)境進(jìn)行全面的清洗和消毒 ,斷絕噬菌體的寄生根底； 3.更換生產(chǎn) 菌種 , 不斷篩選抗噬菌體菌種 ,防止噬菌體的重復(fù)污染。污染烈性噬菌體時(shí)出現(xiàn)上述現(xiàn)象。 如果污染溫和噬菌體時(shí) ,其反響溫和 ,平皿培養(yǎng)不出現(xiàn)明 顯 的噬菌斑 ,只出現(xiàn)局部菌體自溶 ,生化指標(biāo)變化不顯著 ,生產(chǎn)能力降低 ,對(duì)生產(chǎn)的危害亦是嚴(yán)重 的,但 不易被發(fā)現(xiàn)。防

9、止溫和噬菌體污染的方法同上所述。第二局部：染菌原因分析染菌是發(fā)酵工業(yè)的大敵 ,不制服染菌就不能實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中造成發(fā)酵染菌的原因很多，分析染菌的原因是很困難的。但在眾多的原因分析中，從人、機(jī)、料、法、 環(huán)各個(gè)環(huán) 節(jié)進(jìn)行細(xì)致的分析 .從多方面查找原因 ,查出雜菌的來源 ,采取相應(yīng)措施予以制服。一、染菌原因的分析。染菌的途徑多 ,表現(xiàn)的現(xiàn)象多樣。 因而追查雜菌的來源是困難的 ,從現(xiàn)有的經(jīng)驗(yàn)可從下述幾 千 方面進(jìn)行分析。一 從染菌的規(guī)模和時(shí)間分析在發(fā)酵過程中 ,如果是種子罐和發(fā)酵罐同時(shí)大面積染菌 ,雜菌的主要來源可能是空氣凈化 系統(tǒng) , 如空氣過濾器失效或空氣管道滲漏造成的。其次考慮

10、種子制備工序。如果只是發(fā)酵罐大 面積染菌 , 除考慮空氣凈化系統(tǒng)帶菌外 ,還要重點(diǎn)考查接種管道、 補(bǔ)料系統(tǒng)。 發(fā)酵培養(yǎng)基采用連 續(xù)滅菌工藝 時(shí) , 還要嚴(yán)格檢查連消系統(tǒng)是否帶入雜菌。如果是局部發(fā)酵罐在發(fā)酵早期染菌 ,可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底 ,或種子罐帶菌 ,或接種管道 滅菌 不徹底造成的。如果是發(fā)酵的中后期染菌,重點(diǎn)分析補(bǔ)料系統(tǒng)和加消沫劑系統(tǒng)，個(gè)別發(fā)酵罐連續(xù)染菌 , 就從單個(gè)罐體查找雜菌來源 , 如罐內(nèi)是否有“死角或冷卻系統(tǒng)有滲漏。當(dāng)然還要檢查附件 ,個(gè)別罐批的散在性染菌 ,其原因很難追查 ,要具體情況具體分析。二 從雜菌類型分析 發(fā)酵過程染菌 ,多種菌型出現(xiàn)的機(jī)率多 ,單菌型機(jī)率較少。染的是

11、耐熱芽孢桿菌時(shí) ,這與培 養(yǎng)基 滅菌不徹底或設(shè)備內(nèi)部有“死角關(guān)系甚大?？諝庵幸泊嬖谘挎邨U菌,污染的雜茵是不耐熱的球菌或桿菌時(shí),可從空氣凈化系統(tǒng)和冷卻系統(tǒng)進(jìn)行追查。二、制服染菌的要點(diǎn)從表5-4的抗生素發(fā)酵染菌原因分析的統(tǒng)計(jì)資料看，空氣凈化系統(tǒng)帶菌是導(dǎo)致染菌的主 要因素 但仔細(xì)分析，設(shè)備穿孔和滲漏等造成的染菌占33.85%,占第1位。表5-4染菌原因的系統(tǒng)分析染菌原因所占百分比，染菌原因所占百分比，%1?種子帶菌或疑心種子帶菌9.648.接種管穿孔。0.292?接種時(shí)罐壓降至大氣壓力0.199.閥門泄漏1.453.精養(yǎng)基消毒不透0.79110.攪拌軸圭寸的泄漏2.094?總空氣系統(tǒng)帶菌1 11.罐

12、蓋泄漏1.545?泡沫升至罐頂0.4812.其它設(shè)備泄漏10.13.?6?央套穿孔12.3613.操作問題10.157?蛇管穿孔5.8914.原因不明24.91據(jù)已有的制服染菌經(jīng)驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵過程中涉及的空氣凈化系統(tǒng)、設(shè)備系統(tǒng)、蒸汽質(zhì)量、工藝操作提出下述要求。1對(duì)空氣凈化系統(tǒng)的要求防止空氣凈化系統(tǒng)帶菌的主要措施有提高空氣進(jìn)口的空氣潔凈度；除盡壓縮空氣中夾帶的油和水，保持過濾介質(zhì)的除菌效率。現(xiàn)在公空氣系統(tǒng)應(yīng)該有了很大的進(jìn)步，不存在油的問題，但在夏秋兩季，由于空氣濕度較大可能出現(xiàn)預(yù)過濾器放出水的現(xiàn)象，因此各個(gè)車間應(yīng)根據(jù)車 間情況，定時(shí)放水。另外，在過濾器滅菌時(shí)要防止過濾介質(zhì)被沖翻或燒灼，還要防止發(fā)酵液

13、倒流入空氣過濾器內(nèi)。2對(duì)蒸氣的要求首先要重視蒸汽質(zhì)量，一般采用飽和蒸汽，嚴(yán)格控制蒸汽中的含水量，按照不同滅茵工藝要 求 提供穩(wěn)定的蒸汽壓力，滅菌過程中蒸汽壓力不可以大幅度的波動(dòng)，以保證滅菌質(zhì)量，我公司蒸 汽情 況是過熱蒸汽，希望熱電車間在處理蒸汽的時(shí)候保證蒸汽噴水的均勻性。3. 對(duì)設(shè)備的要求發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備應(yīng)做到無“滲漏 ,無“死角。凡與物料、空氣、下水道連接的管件閥門應(yīng)保證嚴(yán)密不漏 ,蛇管和夾層應(yīng)定期試漏。連續(xù)滅菌設(shè)備要定時(shí)拆卸清洗。無菌操作室和菌種培養(yǎng)間定期消毒 ,以保持無菌狀態(tài)。4. 對(duì)工藝操作的要求發(fā)酵罐放罐之后 ,對(duì)罐體和附屬設(shè)備進(jìn)行全面清洗和檢查 ,去除罐內(nèi)的殘?jiān)?,除盡罐壁上的

14、污垢, 去除罐內(nèi)附件處的堆積物。配制培養(yǎng)基時(shí)要防止物料結(jié)塊或帶入異物 ,配料罐和輸送料液系統(tǒng)要定時(shí)清洗消毒。在實(shí)罐滅菌、空罐滅菌、培養(yǎng)基連續(xù)滅菌、各種管道的滅菌等的操作過程中,要嚴(yán)格執(zhí)行工藝規(guī)程要求。滅菌中要保證蒸汽暢通 ,保證蒸汽壓力與溫度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。這里重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)一下關(guān)于假壓力的問題，保證空氣排盡，注意分配主進(jìn)汽，付進(jìn)汽。菌種組的工作人員要嚴(yán)格按工藝規(guī)程制備生產(chǎn)種子。 對(duì)進(jìn)入無菌室的全部物料、器械實(shí)行滅菌。 堅(jiān)持無菌間和無菌操作人員的菌落檢測(cè)制度。發(fā)酵過程的無菌檢查工作 ,要嚴(yán)密取樣操作 ,力求減少取樣和平皿劃線時(shí)的操作誤差。 嚴(yán)格鏡 檢崗位的操作要求 ,降低無菌檢查中的錯(cuò)判與誤判。 發(fā)酵染

15、菌罐批，及時(shí)查明雜菌來源 ,并采取相 應(yīng)措施予以處理， 對(duì)空氣凈化系統(tǒng)、補(bǔ)料系統(tǒng)、轉(zhuǎn)種系統(tǒng)等要嚴(yán)格管理,加強(qiáng)無菌檢查。第三局部：滅菌的對(duì)數(shù)殘留定律1實(shí)消滅菌的時(shí)間計(jì)算： t=2.303/klogN 0/Nst 滅菌時(shí)間秒k - 速度常數(shù)， 1/秒與滅菌采用的溫度和菌的種類有關(guān)N0 - 開始滅菌時(shí)原有菌個(gè)數(shù)Ns - 結(jié)束滅菌時(shí)菌個(gè)數(shù)2 2連續(xù)滅菌的時(shí)間計(jì)算： t=2.303/klogC 0/Cst 滅菌時(shí)間秒k - 速度常數(shù)， 1/秒與滅菌采用的溫度和菌的種類有關(guān)C0 - 開始滅菌時(shí)每毫升原有菌個(gè)數(shù)Cs - 結(jié)束滅菌時(shí)每毫升菌個(gè)數(shù) 第四局部：空氣過濾器膜的介紹別離機(jī)理：氣體一阻留、沉積、擴(kuò)散、攔

16、截、靜電膜材料：醋纖一三醋纖、磺化聚砜、磺化聚醚砜、芳香聚酰胺、陶瓷供給廠商：PAUL DH MILIPOR 上海過濾器廠 上海一鳴MF分類一膜材料金屬膜，金屬合金膜，高分子膜，高分子合金膜，陶瓷膜型式板狀膜，管狀膜一毛細(xì)管狀、多通道管狀、圓管狀制法相轉(zhuǎn)化，膨化拉伸，燒結(jié)，核跡一刻蝕，溶膠一凝膠特性親水膜，疏水膜，耐腐蝕膜，耐高溫膜，高強(qiáng)度膜效率絕對(duì)過濾膜，公稱過濾膜，預(yù)過濾膜孔型絕對(duì)過濾膜，公稱過濾膜，預(yù)過濾膜25膜過濾一一微濾MF MF評(píng)價(jià)膜評(píng)價(jià)內(nèi)因孔結(jié)構(gòu)，孔徑及其分布，孔隙率外因T耐熱性，耐化學(xué)品腐蝕性，機(jī)械強(qiáng)度器評(píng)價(jià)可靠性精度，效率，耐溫性，耐化學(xué)品腐蝕性，親疏水性，機(jī)械強(qiáng)度經(jīng)濟(jì)性通量

17、，購置本錢，更換頻率內(nèi)因與精度、效率、通量關(guān)聯(lián)，外因與使用環(huán)境關(guān)聯(lián)。技術(shù)關(guān)鍵：1膜無缺陷制作工藝，2器無損傷制作工藝，3正確的評(píng)價(jià)方法。MF膜評(píng)價(jià)一孔徑及其分布方法*氣泡點(diǎn)法，汞壓入法，流速法原理:毛細(xì)管模型常規(guī)孔板模型YM專有技術(shù)模型算式r =4k 6 cos 0 /pr =4k 6 cos 0 /5pr-孔徑，k修正系數(shù)，6測(cè)試液外表張力，0 膜材料與測(cè)試液接觸角，p 起泡點(diǎn)壓力分布類型左傾斜，對(duì)稱正態(tài)分布，右傾斜28MF膜評(píng)價(jià)一耐熱性膜材質(zhì)PTFEPVDFPESN6CA-CNNiSS長期使用最高溫度80801807060250400短期蒸汽消毒溫度14213813012112135060

18、0MF膜評(píng)價(jià)一耐化學(xué)品腐蝕性實(shí)驗(yàn)法：溶劑中浸泡24hr，其泡點(diǎn)下降v 10%通量下降V 20%那么可定義為膜能耐該種溶 劑MF組件評(píng)價(jià)一過濾精度與效率試驗(yàn)方法完整性試驗(yàn)：破壞性實(shí)驗(yàn)，非破壞性實(shí)驗(yàn)破壞性實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌實(shí)體試驗(yàn)，雜質(zhì)實(shí)體試驗(yàn)非破壞性實(shí)驗(yàn)：流量擴(kuò)散試驗(yàn)，氣泡點(diǎn)試驗(yàn)，壓力保持試驗(yàn)，油霧實(shí)體試驗(yàn)MF組件評(píng)價(jià)一常見評(píng)價(jià)法方法擴(kuò)散流法壓力衰減法油霧法泡點(diǎn)法原理:Fick定律道爾頓定律類比原理You ng方程類型間接間接直接間接研究對(duì) 象以流經(jīng)膜的氣體量 為考查對(duì)象，來評(píng) 價(jià)膜孔大小,推算 過濾精度、效率以膜前氣體壓力的 變化為考查對(duì)象， 來評(píng)價(jià)膜孔大小， 推算過濾精度、效 率以油霧粒子在過濾 前

19、后數(shù)量重量 變化為考查對(duì)象， 來計(jì)算過濾精度、 效率以膜濕潤后冒出氣泡 時(shí)的壓力為考查對(duì) 象，來評(píng)價(jià)膜孔 大小， 推算過濾精度、效率局限性不完全適用于氣體不完全適用于氣體不完全適用于液體不完全適用于組件MF過濾機(jī)理一氣體機(jī)理意義直接阻留膜使所有比膜孔徑大的粒子全部阻留在截留表層上慣性沉積微粒有足夠的慣性力，使它不能隨流線繞過膜而被阻留扌二集截留微粒慣性較小時(shí)，雖能隨流線運(yùn)動(dòng)，但幾乎完全漂浮在環(huán)繞膜體的粘性流中，由于粘性流足夠的慢而使顆粒被留下擴(kuò)散截留微粒由于布朗運(yùn)動(dòng)而從流線中游離出來，經(jīng)碰撞膜體而被阻留靜電截留依靠微粒與膜體間實(shí)有的或誘導(dǎo)的靜電力，使微粒撞擊到膜體上被捕集圖片:嚴(yán)品名稱：1屎偏

20、範(fàn)乙烯微孔濾膜PVDF卜品特點(diǎn)：1卜雙而成膜雙重過濾*右很|鮭負(fù)電性 *孔.|卜d參數(shù):1靶寸280Xoomm F-卜品型號(hào)：1FA D|質(zhì)結(jié)構(gòu)：麻偏氟乙烯卞DF ,聚貳|權(quán)用說明：1產(chǎn)品名稱：玻纖披覆氟聚物微孔濾膜(HFGF)產(chǎn)品特點(diǎn)：*纖維外表經(jīng)氟聚物處理*集纖維與膜的過產(chǎn)品參數(shù)：尺寸：280Xx mm F-產(chǎn)品型號(hào)：F-B、E材質(zhì)結(jié)構(gòu)：氟聚物(HF)，玻璃纖維(GF)使用說明：請(qǐng)垂詢一鳴公司第五局部：查找染菌原因的深層次分析案例大觀霉素發(fā)酵生產(chǎn)的染菌率較低。個(gè)別發(fā)酵罐染菌后，生長代謝所受影響也較小，大多能正常周期放罐，發(fā)酵單位所受損失也不大。99年出現(xiàn)的幾批染菌罐卻表現(xiàn)出了很大異常：確定

21、染菌后，發(fā)酵罐PH開始急劇下降，糖耗快，氨氮降低，發(fā)酵單位開始下滑，只能提前放罐。嚴(yán)重影響正常。本文從染菌原因分析，給制服無菌提供了一個(gè)新思路，為國內(nèi)抗生素生產(chǎn)廠家對(duì)制服染菌有借鑒作用。為找清染菌原因，從染菌罐別離出雜菌，考察其培養(yǎng)特性，做耐熱實(shí)驗(yàn)。然后根據(jù)這種菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長速度，推算出雜菌進(jìn)入發(fā)酵罐的時(shí)間，最終確定了染菌原因，并采取了相應(yīng)的措施，制服了這次染菌?，F(xiàn)將這次染菌的原因分析及相應(yīng)的對(duì)策介紹如下。一：染菌特征1發(fā)酵罐培養(yǎng)至50小時(shí)左右，33小時(shí)后的無菌肉湯跟蹤樣開始變色，確認(rèn)染菌。此后，發(fā)酵罐PH開始急劇下滑，糖耗快，氨氮下降，發(fā)酵單位停止增長，60小時(shí)左右提前放罐。2:變色

22、肉湯涂片鏡檢：短桿菌。3:發(fā)酵液(周期60小時(shí)左右)涂片鏡檢：桿菌，已經(jīng)形成芽抱。二：雜菌別離、培養(yǎng)1把變色肉湯接入無菌紅色肉湯，37C恒溫培養(yǎng)。24小時(shí)后肉湯變黃，說明這種菌代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)。2 :向變色肉湯中參加2滴5M的NaOH溶液，搖勻PH為10,放置10分鐘。把該 肉湯接 入無菌肉湯，37C恒溫培養(yǎng)48小時(shí)，肉湯仍不變色。說明這種雜菌對(duì)堿性環(huán)境 的耐受性較差。3:用細(xì)菌培養(yǎng)基對(duì)這種雜菌進(jìn)行平板別離，雜菌菌落具有細(xì)菌菌落的典型特征。挑取 單菌落接 入肉湯，培養(yǎng)特征與直接從染菌罐接入的肉湯中的雜菌一致。鏡檢，雜菌呈 短桿狀，可觀察到 局部菌體進(jìn)行二分裂繁殖。4:把雜菌接入菌種效價(jià)跟蹤用的

23、發(fā)酵瓶，培養(yǎng)情況與發(fā)酵罐的代謝情況類似。5:把雜菌接入空白發(fā)酵瓶，培養(yǎng) 24小時(shí)后進(jìn)行平板別離及肉湯檢測(cè)，結(jié)果證明這種 菌能在發(fā) 酵瓶中存活、生長繁殖。由于發(fā)酵瓶和發(fā)酵罐的營養(yǎng)成分、培養(yǎng)條件一致，因此可以用發(fā)酵瓶來模擬雜菌在發(fā)酵罐中的生長情況。三：雜菌耐熱性實(shí)驗(yàn)用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)這種菌，吸取定量體積的菌液分別接入 11支無菌肉湯。 取1支作對(duì)照，另10支每2支為1組，分別在100C沸水浴中加熱5分鐘，10分鐘，15分鐘， 20分鐘，25分鐘。37C恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，只有加熱25分鐘的兩支 肉湯不變色。說明這種菌 的耐熱性較強(qiáng)。四：染菌時(shí)間判斷把雜菌接入空白發(fā)酵瓶，在不同培養(yǎng)時(shí)間取樣，

24、進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算出發(fā)酵瓶內(nèi)的菌體數(shù)。該菌的繁殖方式為二分裂，根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間和菌體數(shù)目的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可以計(jì)算出該菌在發(fā)酵瓶內(nèi)繁殖一代所需的時(shí)間代時(shí)。1 :制備菌體稀釋液濃度約每毫升幾百個(gè)從平板上挑取單菌落，按梯度稀釋法制得菌體稀釋液約520個(gè)/毫升。2:代時(shí)確實(shí)定吸取1毫升稀釋液接入空白發(fā)酵瓶30毫升培養(yǎng)基，發(fā)酵瓶培養(yǎng)條件與發(fā)酵罐培養(yǎng)條件保持一致。在不同時(shí)間取樣，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。計(jì)算出對(duì)應(yīng)的菌濃和菌體數(shù)，如下表培養(yǎng)時(shí)間取樣量菌落數(shù)菌濃菌體數(shù)小時(shí)毫升個(gè)個(gè)/毫升個(gè)00.516329601.50.5408024003.00.24924573504.50.2122610183006.00.1172172051600根據(jù)公式XA=Xx 2t2?ti/T, t “=3.322 X Tx Ig XVX、和上表數(shù)據(jù)，計(jì)算得到代時(shí)T約為1.1小時(shí)。 其中，X為時(shí)間1i時(shí)的菌體數(shù)量，X2為時(shí)間t 2時(shí)的菌體數(shù)量