雞卵類黏蛋白的分離純化

1、雞卵類黏蛋白的分離純化、活性及分子量測定唐靈杰 楊榮燕 曹雪文 唐威風(fēng)河北大學(xué)生 命科學(xué)學(xué)院 2013生物工程2班摘要：本實(shí)驗(yàn)的主要目的是掌握雞卵類黏蛋白（CHOM）的性質(zhì)及活性測定方法，了解其應(yīng)用。掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，掌握電泳儀的使用。掌握離心機(jī)、分光光度計(jì)的使用。雞卵類粘蛋白是一種專一性很強(qiáng)的胰蛋白酶抑制劑，胰蛋白酶能水解酯鍵,酰胺鍵和肽鍵,利用這一性質(zhì)用人工合成的底物或天然的蛋白質(zhì)可以測定胰蛋白酶的活力,由此可計(jì)算類粘蛋白的活力。先通過三氯乙酸-丙酮除去蛋清中的雜蛋白，后經(jīng)等電點(diǎn)沉淀得到類粘蛋白的粗品；然后經(jīng)過DEAE纖維素柱層析純化得到純品；用Folin-酚法測定粗品和純品中蛋

2、白質(zhì)含量，紫外分光光度計(jì)測定其抑制活力；最后，通過SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測類粘蛋白的純度及分子量。關(guān)鍵詞：雞卵類粘蛋白 純化 層析 抑制活力 分子量Abstract:The main purpose of this experiment is to grasp the nature and activity of chicken ovomucoid CHOM, and to understand its application. Master polyacrylamide gel electrophoresis technology, master the use of elec

3、trophoresis. Master centrifuge, spectrophotometer use.Chicken ovomucoid is a kind of specificity strong trypsin inhibitors, can hydrolyze ester keys, amides keys and peptide bond. Use this nature and synthetic substrate or natural protein can determine the vitality of trypsin, so can calculating the

4、 vitality of chicken ovomucoid.First, remove the miscellaneous protein in egg white by TCA acetone, then get the rough protein by isoelectric precipitation.Then after chromatography column packing column, balance, Sample , elution, rebalance etc to achieve the purification of chicken ovomucoid.then

5、we can get the eligibility product from DEAE cellulose column chromatography at last.The contents of protein in crude and pure products were determined by Folin- phenol method, and the inhibition activity was determined by ultraviolet spectrophotometry.Finally, through SDS-page polyacrylamide gel el

6、ectrophoresis to determine the purity and molecular weight of chicken ovomucoid.Key words：Chicken ovomucoid Purification Chromatogram inhibitory activity molecular weight1前言雞卵類黏蛋白（ Chicken Ovomucoid, CHOM）是從雞卵清中分離的糖蛋白，具有強(qiáng)烈抑制胰蛋白酶的的作用，是典型的胰蛋白酶抑制劑，常用于胰蛋白酶及類胰蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)研究。CHOM在pH7.8-8.0的堿性條件下，具有很強(qiáng)的結(jié)合胰蛋白酶的活

7、性，而且這種結(jié)合是可逆的，因此，可以制成親和吸附劑，用以純化胰蛋白酶。雞卵類黏蛋白為糖蛋白，在糖蛋白的糖鏈部分（主要是D甘露糖、D半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸）的含量上有差別，所以，在電泳行為上常呈現(xiàn)不均一性，經(jīng)常表現(xiàn)為彌散性條帶。目前至少已獲得四種不同組分，它們在抑制胰蛋白酶性能上及氨基酸組成上沒有多大的區(qū)別。雞卵類黏蛋白的等電點(diǎn)有一定的范圍：大致在pH3.94.5，分子量在28000Da。其抑制胰蛋白酶的摩爾比為1：1，1g高純度的卵類黏蛋白能抑制相當(dāng)于0.86 g的胰蛋白酶（比活力為12000BAEE U/mg）。不同來源的卵類黏蛋白的N-末端殘基有很大差異，雞卵類黏蛋白的N-末端為Ala，

8、C-末端為Phe。卵類黏蛋白在中性或酸性溶液中對(duì)熱和高濃度的尿素很穩(wěn)定，在堿性溶液中比較不穩(wěn)定，尤其當(dāng)溫度較高時(shí)易迅速失活。雞卵類黏蛋白對(duì)豬、牛的胰蛋白酶強(qiáng)烈抑制，對(duì)枯草桿菌蛋白酶有一定程度的抑制，但對(duì)人的胰蛋白酶無明顯的抑制作用，對(duì)胰凝乳蛋白酶也無抑制作用。2材料與方法2.1 材料新鮮雞蛋、0.05mol/L三氯乙酸溶液（TCA）、丙酮溶液、DEAE-纖維素、 0.2 mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液、0.02 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液、0.3mol氯化鈉-0.02mol PH6.5磷酸鹽緩沖液、0.5 mol/L氯化鈉-0.02 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液、3.0

9、mL BAEE- 0.05 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液、0. 5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液、0.0 5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液胰蛋白酶、Folin-酚試劑：試劑甲：4%碳酸鈉溶液；0.2mol/L氫氧化鈉溶液1%硫酸銅溶液；2%酒石酸鉀鈉溶液。先將等體積混合，再將等體積混合，再將這兩種混合液按50：1的比例混合，試劑乙、 30% 膠母液、pH 8.9 Tris-HCl緩沖液（含TEMED）、10% APs、pH 6.7 Tris-HCl緩沖液（含TEMED）、pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液、BSA、Marker、考馬斯

10、亮藍(lán)染色液、脫色液。2.2 儀器離心機(jī)、恒溫水浴鍋、冰箱、紫外分光光度計(jì)、電泳儀、搖床、核酸蛋白檢測儀、漏斗、透析袋、 離心管 （1.5mL）、 燒杯（250mL、500mL、1000mL） 、吸量管（0.5 mL、1 mL、5 mL）、層析柱、鐵架臺(tái)、石英比色皿 、微量進(jìn)樣器、十齒樣品梳（厚度1mm）、細(xì)長頭滴管 離心管（1.5mL） 、 培養(yǎng)皿、 成套玻璃板 。2.3 方法2.3.1 有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀CHOM粗品2.3.1.1 去除雜蛋白兩人一組，量取25mL新鮮雞蛋清，盛于250mL燒杯內(nèi)，燒杯置于2530恒溫水浴鍋內(nèi)，邊攪拌邊緩慢加入等體積4預(yù)冷的三氯乙酸（TCA）丙酮溶液（1:4體積

11、比），出現(xiàn)大量白色沉淀，為雜蛋白，此時(shí)溶液的pH約為67，保溫30min。用大約78 mL 0.5mol/L TCA調(diào)節(jié)至pH3.5，使雜蛋白沉淀完全，在4下放置1h, 4000 r/min離心20 min，輕輕將黃綠色上清液倒出，每2個(gè)人量取20mL（剩余的上清液扔掉），4個(gè)人合并為1組，共40mL，倒入250mL三角瓶中，用紙封口、貼標(biāo)簽放入冰箱中冷藏。2.3.1.2 沉淀粗品4倍于上清液體積的-20預(yù)冷的丙酮 （ 160mL ）， 邊攪拌邊加入黃綠色上清液中，可見白色沉淀產(chǎn)生，在4冰箱中放置12 h。（課程安排在上午的，前一天下午沉淀，第二天上午上課時(shí)再離心）。從冰箱中輕輕（不要將沉淀晃

12、起?。┤〕鋈瞧?，將上清液緩慢倒出，盡量少留上清液，總體積最多不超過40mL。兩兩配平，4000 r/min離心20 min，棄上清液，得CHOM沉淀，加入4mL無離子水溶解。2.3.1.3 粗品獲得透析操作需戴上一次性手套或膠皮指套，以防手上的汗液等污染透析袋。將透析袋用無離子水煮沸10min，再用無離子水清洗干凈，一端用橡皮筋綁緊，用無離子水試漏，若不漏，再將4mL 粗酶液裝入透析袋，趕出透析袋中的氣泡，留出約0.5cm富余，綁緊另一端，對(duì)無離子水透析，更換數(shù)次無離子水，以除去殘留的TCA和丙酮，透析后可見少量沉淀（為變性蛋白），需離心去除。透析過程至少需要2.0h，隔1h更換一次無離子水

13、。用滴管取出透析袋中的黏蛋白溶液（及時(shí)將透析袋用無離子水清洗干凈），放入7mL離心管 8000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液倒入另一7 mL離心管，貼好標(biāo)簽，放入冰箱冷凍。2.3.2 DEAE-Cellulose純化CHOM2.3.2.2 DEAE-纖維素的處理及再生新纖維素的處理：取50g DEAE-纖維素-32或DEAE-52，用少量水溶脹1 h，用0.5mol/L氯化鈉-0.5mol/L氫氧化鈉溶液攪拌處理20min，用大量的蒸餾水洗至中性，再用0.5mol/L鹽酸與0.5mol/L氯化鈉溶液攪拌處理20 min，用大量的蒸餾水洗至中性，再用0.5mol/L氯化鈉溶液-0.

14、5mol/L氫氧化鈉溶液處理一次，最后用大量的蒸餾水洗至中性，放置冰箱中保存。舊纖維素的再生：省去酸處理一步，只用0.5mol/L氯化鈉溶液-0.5mol/L氫氧化鈉溶液處理一次，用大量的蒸餾水洗至中性，置4冰箱中保存。2.3.2.3 裝柱取一支層析柱，檢查上下端的螺口，用洗耳球吹硅膠管，使之通氣。下端螺口旋緊，用水止夾緊軟硅膠管。將層析柱垂直安裝在鐵架臺(tái)上，先加入1/31/2柱體積的水，在柱的上端插一合適大小的玻璃漏斗，使漏斗頸的外徑與層析柱的內(nèi)徑吻合，以防層析柱中的水或緩沖液滲出。將處理好的DEAE-纖維素調(diào)成漿糊狀，倒入漏斗，不斷攪拌，使之自然沉降到1cm左右的高度。打開柱下端的水止，繼

15、續(xù)攪拌漏斗內(nèi)的纖維素，使之沉降至3/4柱高。計(jì)算柱體積：量測柱床的高度，柱內(nèi)徑為1cm，底面積乘以高位柱床體積。將柱下端的硅膠管連接在核酸蛋白檢測儀樣品池的入口，打開核酸蛋白檢測儀電源，將波長置于280nm處，預(yù)熱至少30min，準(zhǔn)備一個(gè)燒杯，收集樣品池出口的流出液。2.3.2.4 平衡用3倍柱體積的0.02 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液（起始液）平衡層析柱。始終保持柱床上邊最少有2cm高度的緩沖液。平衡過程中要做3件事情：1、調(diào)節(jié)流速，使之在11.5m L/min之間；2、調(diào)試核酸蛋白檢測儀：調(diào)透光率為100，吸光度為0。首先將旋鈕撥到T100%(指透光率)，調(diào)“光量”到顯示100。

16、再將旋鈕撥到 A（吸光度）（A有不同靈敏度，一般選擇0.5A），調(diào)節(jié)“調(diào)零”到顯示0（圖6）。繼續(xù)平衡，如數(shù)字有波動(dòng)，反復(fù)調(diào)節(jié)幾次，使A值保持為0；3、粗品的處理：首先用10 mL量筒測量上周離心后的粗品體積，記錄體積！記為Vcrude。取1支7mL離心管，加入0.20mL 0.2 mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液，搖勻，1.8mL粗品，混合，鹽終濃度為0.02 mol/L，用于本次純化實(shí)驗(yàn)。 剩余粗品都裝入原來的7mL離心管，用于蛋白質(zhì)濃度測定、活性測定和電泳。2.3.2.5 上樣待平衡緩沖液即將全部流入柱床時(shí)，立即貼壁加2.0mL粗提樣品，使樣品全部緩慢流入層析柱床內(nèi)，立即加起始液到柱床

17、上邊保持2cm高度（圖7）。記錄上樣時(shí)間，幾點(diǎn)幾分。2.3.2.6 洗脫起始液洗脫首先以3倍柱體積的起始液洗脫，保持流速不變，觀察核酸蛋白檢測儀的A值變化情況。當(dāng)A值上升時(shí)，開始計(jì)時(shí)，并記錄A值，當(dāng)A值上升到最高值時(shí)，計(jì)時(shí)，并記錄A值， A值下降到數(shù)值穩(wěn)定時(shí)，計(jì)時(shí)，并記錄A值。若有蛋白流出，一般為溶菌酶、胰凝乳蛋白酶抑制劑等雜蛋白。0.3 mol/L氯化鈉-0.02 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液洗脫改用0.3 mol/L氯化鈉-0.02 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫。當(dāng)A值急劇上升時(shí)收集，并計(jì)時(shí)，觀察A的變化并記錄A值和時(shí)間點(diǎn)。當(dāng)A值上升到最高值時(shí)，計(jì)時(shí)，并記錄A值，下

18、降到數(shù)值穩(wěn)定時(shí)，計(jì)時(shí)，并記錄A值。（將洗脫峰的情況記錄下來）每管收集2mL。準(zhǔn)備更換另一種洗脫液。若收集的洗脫液體積較?。ㄐ∮?mL），則不需要濃縮！若洗脫體積過大，純品濃度較低，不能直接用于活性和蛋白質(zhì)濃度測定，需要進(jìn)行反透析。先合并對(duì)應(yīng)A值較高的收集液試管，如果透析袋裝滿，A值較低的收集液 棄去不用。 如果透析袋未裝滿，則合并 A值較低的收集液 。每組裝滿一根透析袋，上面加蔗糖晶體，利用蔗糖吸水性質(zhì)，將透析袋里邊的水吸出，最后，透析袋內(nèi)的溶液濃縮到23mL之間。將干癟的透析袋一端的橡皮筋解開，將濃縮的純品溶液（較粘）集中在一端，重新綁好皮筋（注意不要留空隙！）。透析袋再對(duì)無離子水透析（透析

19、好的純品，圖10）， 測定純化后雞卵類黏蛋白的總體積，記為Vpurified， 最大體積不要超過5mL。0.5 mol/L氯化鈉-0.02 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液洗脫 繼續(xù)用0.5 mol/L氯化鈉-0.02 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液洗脫，觀察是否有蛋白峰出現(xiàn)，如有蛋白峰，繼續(xù)收集。一般情況下不再有蛋白峰出現(xiàn)。洗脫1個(gè)柱體積的溶液即可。起始液平衡用1倍柱體積起始液繼續(xù)平衡柱子。用吸耳球?qū)⒅觾?nèi)的纖維素吹到回收瓶回收。清洗核酸蛋白檢測儀的樣品池 以10mL無離子水清洗核酸蛋白檢測儀樣品池，從進(jìn)樣口注射無離子水，至出樣口流出。2.3.3 粗品及純品蛋白質(zhì)濃度測定2.3.3

20、.1 樣品準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)三得到的CHOM純品測量體積，記為Vpurified ，裝入7mL離心管中。取1mL純品稀釋：柱層析洗脫峰最大值在100以內(nèi)的，先稀釋5倍1。柱層析洗脫峰最大值大于100以的，直接稀釋10倍。再取1mL用于本實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)濃度測定。若A值超出標(biāo)曲范圍，在原來基礎(chǔ)上再進(jìn)行稀釋。從剩余粗品（稀釋50、100倍），用于本實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)濃度測定。2.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品的測定試劑管號(hào)及加量12345678910BSA溶液/mL00.20.40.60.81.00000無離子水/mL1.00.80.60.40.200000蛋白質(zhì)濃度/(ug/mL)050100150200250-待測

21、試樣品/mL0000001.01.01.01.0混勻，于20-25放置10minFolin-酚試劑甲/mL5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0Folin-酚試劑乙/mL0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5迅速混勻，于30水浴保溫30min，以1號(hào)管反應(yīng)液為空白，測A640A6400注：7號(hào)：粗品稀釋100倍 8號(hào)：粗品稀釋100倍 9號(hào)：純品稀釋20倍 10號(hào)：純品稀釋20倍保溫30min后，在722分光光度計(jì)上640nm處比色，以1號(hào)管溶液凋零，記錄各試管的A640 。 計(jì)算CHOM粗品、純品的蛋白質(zhì)濃度（單位：mg/mL）；查閱記錄的Vcru

22、de 和Vpurified，計(jì)算粗品和純品的總蛋白質(zhì)含量（mg）。2.3.4 BAEE法測定CHOM活性2.3.4.1 胰蛋白酶活性測定本實(shí)驗(yàn)采用10mg/mL胰蛋白酶溶液，加量為50L。取一只石英比色皿（帶蓋，光程為1cm），加入25預(yù)熱的BAEE 3.0 mL ，在紫外分光光度計(jì)的動(dòng)力學(xué)模式下，測定A253，以此為空白，校正100%T/0Abs 。取出比色皿，加入50 L胰蛋白酶液（酶濃度10mg/mL)，立即混勻，測定A253的增加，每隔30秒讀一次數(shù)，測定185秒。一般情況下，此濃度酶液催化底物顯色，A值呈線性增加.計(jì)算胰蛋白酶活性和比活力：根據(jù)時(shí)間光密度關(guān)系曲線中的直線部分，任選一時(shí)

23、間間隔(t)與相應(yīng)吸光度值變化（A），按以下公式計(jì)算胰蛋白酶的活力單位和比活力。胰蛋白酶活力單位（BAEE單位）=A /t×0.001；比活力=酶活力單位/毫克蛋白質(zhì)=（A /t×0.001）÷M測；（式中:A/t為每min 吸光度值的增加）M測指測定時(shí)所加胰蛋白酶的量，單位為mg；（M測=50L×10mg/mL=500g=0.5mg）0.001為吸光度值增加0.001單位定為1個(gè)BAEE活力單位的常數(shù)。2.3.4.2 黏蛋白粗品的抑制活力（1）調(diào)節(jié)粗品pH至8.0，濃度至0.05mol/L ：從剩余粗品管中，取0.9 mL，加入0.10 mL的0. 5

24、 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，混勻，使緩沖液為0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl，供本次實(shí)驗(yàn)BAEE法測定黏蛋白對(duì)胰蛋白酶的抑制活性之用。剩下的依舊放冰箱冷凍保存。粗品的稀釋：從調(diào)節(jié)好pH的1mL粗品溶液中，取10L粗品，加90L 0.0 5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，混勻（即稀釋10倍）。（3）粗品對(duì)胰蛋白酶的抑制作用取20L 稀釋的粗品與100L胰蛋白酶溶液混合、混勻（卵類蛋白量不能超過胰蛋白酶量，一般以抑制50%較為合適，具體視卵類黏蛋白的純度而異），在25保溫10min，使酶與抑制劑充分結(jié)合。（4）粗品抑制后剩余活力測定取一

25、只石英比色皿，加入25預(yù)熱的3 mL BAEE ，動(dòng)力學(xué)模式下測定A253，以此空白校準(zhǔn)。將黏蛋白粗品抑制后的60 uL混合液，加入比色皿中，迅速混勻（蓋蓋，顛倒混勻?。瑒?dòng)力學(xué)模式下測定A253變化， 每隔30秒讀一次數(shù)，測定185秒。記錄每30秒的測定數(shù)據(jù)。測定一個(gè)樣品之后，一定要按“Esc”退出。倒掉石英比色皿中的液體，清洗干凈！測定下一個(gè)樣品，重新裝入3mL BAEE，一定要重新按“100%T/0Abs”校準(zhǔn)。根據(jù)時(shí)間光密度關(guān)系曲線中的直線部分，任選一時(shí)間間隔(t)與相應(yīng)吸光度值變化（OD），按前述公式計(jì)算粗品抑制后的胰蛋白酶剩余活力。 胰蛋白酶活力(U)粗品抑制后的剩余活力(U)=黏

26、蛋白粗品的抑制活力(U)。 計(jì)算出每mL粗品的抑制活力，再乘以粗品體積，計(jì)算出黏蛋白粗品的總抑制活力。2.3.4.3 黏蛋白純品的抑制活力（1）調(diào)節(jié)純品的pH至8.0，濃度至0.05mol/L從剩余的純品管中，取0.9mL純品 ，加入0.10mL 0.5 mol/L pH 8.0 Tris-HCI緩沖液，使緩沖液為0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl， 供本次實(shí)驗(yàn)BAEE法測定純品對(duì)胰蛋白酶的抑制活性.剩下的依舊放冰箱冷凍保存。（2）純品對(duì)胰蛋白酶的抑制作用取20L 純品與100L胰蛋白酶溶液混合（卵類蛋白量不能超過胰蛋白酶量，一般以抑制50%較適合，具體視卵類黏蛋白的純度而異）

27、，在25保溫10min左右，使酶與抑制劑充分結(jié)合。（3）純品抑制后的剩余活力測定：在一只石英比色皿中，加入25預(yù)熱的3mL BAEE，動(dòng)力學(xué)模式下測定A253 ，以此調(diào)零。將黏蛋白純品抑制后的60uL混合液，加入比色皿中，混勻 （蓋蓋，顛倒混勻！）， 動(dòng)力學(xué)模式下測定A253變化，每隔30秒測定一次，記錄數(shù)據(jù)，測定35min。根據(jù)時(shí)間光密度關(guān)系曲線中的直線部分，任選一時(shí)間間隔(t)與相應(yīng)光密度值變化（OD），按前述公式計(jì)算抑制后的胰蛋白酶剩余活力。胰蛋白酶活力(U)純品抑制后的剩余活力(U)=黏蛋白純品的抑制活力(U)。計(jì)算出每mL粗品的抑制活力，再乘以粗品體積，計(jì)算出黏蛋白粗品的總抑制活力。

28、2.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）檢測 CHOM純度及相對(duì)分子質(zhì)量2.3.5.1 配制分離膠和灌膠1、分離膠制備及灌膠：按下表配制分離膠表2 SDS-PAGE分離膠的配制方法試劑加量30% 膠母液/mL2.8pH 8.9 Tris-HCl緩沖液/Ml（含TEMED）1.8蒸餾水定容至/mL7混勻后加入10% APS/ uL50灌分離膠：先將配制的分離膠加在玻璃板之間，7mL膠液幾乎全部灌入，至高出灰色橫梁2mm。在加入過硫酸銨之后，應(yīng)在5min內(nèi)灌膠。再取100微升水，輕輕加在膠面上。2、濃縮膠制備及灌膠：按下表配制濃縮膠表3 SDS-PAGE 濃縮膠的配制方法試劑加量30%

29、膠母液/mL0.4pH 6.7 Tris-HCl緩沖液/Ml（含TEMED）0.2蒸餾水定容至/mL3混勻后加入10% APS/ uL40灌濃縮膠：一定要待分離膠聚合以后（大約20-30min），可見水與凝固的膠面之間有折射率不同的界線，倒去上層水，再用濾紙條吸去膠面上多余的水，注意不要碰到膠面。灌濃縮膠，插上樣品梳（注意：梳子的平面對(duì)準(zhǔn)高玻璃板）濃縮膠大約20min聚合。2.3.5.2 加入電極緩沖液在電泳槽中加入pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液（舊），使之沒過電極絲即可；在矮板之間加入pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液（新），使之沒過矮板。2.3.5.3 點(diǎn)樣樣品的制備低分子量Marke

30、r由指導(dǎo)教師準(zhǔn)備，每組用一支Marker。牛血清白蛋白（BSA）：取0.5mL離心管，加25L BSA （0.5mg/mL）和25L樣品緩沖液，混勻，由指導(dǎo)教師準(zhǔn)備；粗品CHOM：取1.5mL離心管，加100L粗品 和 100L 2×樣品緩沖液，混勻；純品CHOM: 取1.5mL離心管，加100L純品和100L 2×樣品液，混勻；4支離心管置海綿托上沸水浴加熱3 min；制樣之后，將純品和粗品管放回塑料袋，冷凍保存。2.3.5.4 點(diǎn)樣按下表點(diǎn)樣：表4 SDS-PAGE 上樣表泳道12345678910樣品粗品粗品粗品粗品BSAMarker純品純品純品純品點(diǎn)樣量（ul)10

31、1520301020101520302.3.5.4 電泳A：在電泳槽的正極槽加電泳緩沖液，沒過電極絲即可；負(fù)極槽加緩沖液，一定要沒過矮玻璃板。 B：插好電泳儀電源，連接電泳儀和電泳槽之間的電極線。樣品在濃縮膠里，調(diào)節(jié)電壓：150V。樣品在分離膠里，調(diào)節(jié)電壓：200V。當(dāng)指示劑染料距離凝膠底部約1cm時(shí)，停止電泳，記錄電泳時(shí)間。2.3.5.5 剝膠A:棄去電泳槽正極緩沖液，回收負(fù)極緩沖液。B:取出玻璃板，小心撬開玻璃，在1#上樣井對(duì)應(yīng)的膠底部切下一個(gè)小三角做標(biāo)記。小心將膠剝?nèi)氪笈囵B(yǎng)皿中（大培養(yǎng)皿底的邊上貼好各組的標(biāo)簽）。2.3.5.6 染色、脫色A:在大培養(yǎng)品皿中加入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液，

32、以沒過凝膠能使凝膠懸浮為宜。搖床上染色10min，將染液回收到原來的試劑瓶。B:用自來水將凝膠表面的浮色洗去，加入脫色液，搖床脫色至條帶清晰。隔周觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。測量Marker各條帶的遷移距離，并計(jì)算遷移率。觀察粗品和純品的電泳效果。測量樣品中CHOM的遷移距離。3 結(jié)果與分析3.1 雞卵類黏蛋白的粗品制備雞蛋清的體積為：25ml3.2 粗品的處理洗脫柱體積為 13ml 流速v=1.2ml/min 上樣時(shí)間9：473.3 雞卵類黏蛋白的分離純化洗脫體積及對(duì)應(yīng)A280如下三倍柱體積洗脫：時(shí)間9:479:569:5810:0510:09A280123430.3 mol/L氯化鈉-0.02 mol/

33、L pH 6.5磷酸鹽緩沖液洗脫時(shí)間10:2010:2810:2810:2810:2910:2910:2910:2910:2910:31A280457133134135136133131116時(shí)間10:3410:3510:3610:3610:3710:3710:3810:3910:40A280605132282512987A280值變化情況：用0.02 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液平衡時(shí)，A280值18min后上升到最高值4，又4min后下降到穩(wěn)定數(shù)值。 改用0.3 mol/L氯化鈉-0.02 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫時(shí)，經(jīng)歷8min后，A值急劇上升到最高值133，之后在20min內(nèi)又下降到7。用0.5 mol/L氯化鈉-0.02 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液洗脫時(shí)，沒有出現(xiàn)峰值。洗脫圖如下：收集純品Vpurified=12ml3.4 Folin-酚法測定蛋白質(zhì)濃度Vcrude=1.8mlVpurified=5.3ml測定結(jié)果如下表：試管號(hào)12345678910A64000.2220.2830.4180.5380.6820.4040.4920.3690.374蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：粗品濃度（按照稀釋100倍算）：16 mg/ml純品濃度(按照稀釋20倍算)：2.65 mg/ml粗品含量：28.8 mg 純品含量：13.