玉米粉淀粉含量近紅外模型建立與優(yōu)化

1、玉米粉淀粉含量近紅外模型建立與優(yōu)化韓潔楠1，王美娟1，趙訓超1,2，魯鑫1，周志強1，李明順1，張德貴1，郝轉(zhuǎn)芳1，翁建峰1，雍洪軍1，李新海1（1中國農(nóng)業(yè)科學院，作物科學研究所，北京 100081；2黑龍江八一農(nóng)墾大學，農(nóng)學院，黑龍江 大慶，163319）摘要淀粉是玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的重要性狀，在群體水平準確測定淀粉含量是研究淀粉遺傳與生理的重要基礎(chǔ)。本文以230份玉米自交系為樣本，采用旋光法與一階導(dǎo)數(shù)及去一條直線的光譜預(yù)處理法，構(gòu)建玉米粉樣淀粉含量的近紅外分析（NIRS）模型，可顯著提高籽粒淀粉含量預(yù)測的準確性。該模型的定標標準偏差（RMSEE）、交叉驗證標準偏差（RMSECV）、外部驗證標準

2、偏差（RMSEP）、定標相關(guān)系數(shù)（R2cal）、交叉驗證相關(guān)系數(shù)（R2cv）、外部驗證相關(guān)系數(shù)（R2cv）分別為0.609、0.722、0.738、0.909、0.864和0.854。建立的玉米粉樣NIRS模型可將預(yù)測值與化學值偏差控制在1.7%內(nèi)，能夠準確定量分析玉米籽粒淀粉含量，應(yīng)用于育種材料早期篩選及群體水平粗淀粉分析。關(guān)鍵詞：玉米粉；淀粉含量；近紅外分析模型；準確度Establishment and Optimization of a Near-Infrared Model of Maize Starch ContentJienan HAN, Meijuan WANG, Xunchao

3、 ZHAO, Xin LU, Zhiqiang ZHOU, Mingshun LI, Degui ZHANG, Zhuanfang HAO, Jianfeng WENG, Hongjun YONG, Xinhai LIAbstract Starch content is an important trait of maize (Zea mays L.) kernels as it accounts for the seed yield and quality. Analysis starch content accurately at the population level is the i

4、mportant foundation when we study genetic and physiological of starch quality. In this paper, 230 maize inbred lines were set as samples, using the method of polarimeter and pre-treatment of the first derivative add minus one line separately to establish and optimize a Near-infrared spectroscopy (NI

5、RS) model of maize starch content successfully, which can improve the accuracy of the prediction significantly. Of the model, the calibration standard deviation (RMSEE) is 0.609, the cross-validation standard deviation (RMSECV) is 0.722, the external verification standard deviation (RMSEP) is 0.738,

6、 the calibration correlation coefficient (R2cal) is 0.909, the cross-validation correlation coefficient (R2cv) is 0.864, and the external verification correlation coefficient (R2cv) is 0.854. Of the model, the deviation between the predicted value and the chemical value can be controlled within 1.7%

7、, which can improve the accuracy largely when it was used in quantitative analysis of grain starch content and then can be applicated in breeding inbred line selection or crude starch content analysis at the group level.Key words: Maize kernel powder; Starch content; Near-Infrared spectroscopy (NIRS

8、) model; Accuracy基金項目中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程-主要農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)評價與調(diào)控（2019-2023年）作者簡介韓潔楠（1990-），女，河北省石家莊，助理研究員，主要從事玉米籽粒淀粉品質(zhì)遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)制。TelE-mail：hanjienan1 前言淀粉是玉米籽粒胚乳的主要組成部分，約占籽粒70%的干重。淀粉積累量與籽粒飽滿度及產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)，同時總淀粉中支鏈淀粉及直鏈淀粉比例和結(jié)構(gòu)影響籽粒的品質(zhì)。2018年我國玉米總產(chǎn)量達到2.57億噸，種植面積4213萬公頃，是我國種植面積最大、總產(chǎn)量最高的作物（國家統(tǒng)計局，2018年）。目前，玉米品種需求

9、已從傳統(tǒng)產(chǎn)量型向品質(zhì)型、專用型轉(zhuǎn)變，例如近年來發(fā)展起的玉米淀粉、燃料乙醇、氨基酸加工等。玉米制取淀粉原料充足、出粉率高、工藝成熟、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高、不受季節(jié)限制，是最具工業(yè)化生產(chǎn)淀粉的谷物原料。目前以玉米淀粉為原料生產(chǎn)的工業(yè)制品達千余種，其廣泛用途可與石油類產(chǎn)品相提并論1。我國主推玉米品種淀粉含量隨著年代變化總體呈上升趨勢，每10年上升約0.25% 2，平均淀粉含量低于發(fā)達國家。淀粉合成途徑關(guān)鍵基因的改造或調(diào)控是提高玉米淀粉含量的有效途徑，可顯著加快高淀粉玉米等專用型品種培育進程3-6。玉米種質(zhì)資源豐富，淀粉含量差異大7-8，因此構(gòu)建重組自交系群體或收集自交系群體，采用聯(lián)合連鎖不平衡分析（Q

10、TL）及全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），是正向發(fā)掘淀粉含量調(diào)控因子及優(yōu)良單體型的重要途徑。QTL定位發(fā)現(xiàn)，調(diào)控淀粉含量的QTLs遍布玉米的10條染色體9。Wang分析CI7/K22重組自交系群體發(fā)現(xiàn)6個QTLs位點分別解釋4.7%-10.6%淀粉含量差異，7個候選基因中4個基因參與淀粉合成，3個基因編碼非淀粉代謝途徑酶類10。Cook等發(fā)現(xiàn)了多個玉米籽粒淀粉、蛋白及油分調(diào)控基因7。Liu等對263份自交系全基因組聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)77個候選基因與淀粉含量相關(guān)，其中包括淀粉合成關(guān)鍵酶AGPase的亞基APS18。Xiao等對B73 x DHLoPro1 F2:3群體QTL定位發(fā)現(xiàn)qHS3位點，可以解釋

11、26%的淀粉差異11；該位點在三個連鎖群體中均被發(fā)現(xiàn)12-14；利用此位點差異的近等基因系進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)76個基因發(fā)生突變，384個基因差異表達，進一步分析認為催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為6磷酸葡萄糖的己糖激酶ZmHXK3a為靶基因11。Li等對454份自交系玉米進行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)27個位點調(diào)控直鏈淀粉含量，候選基因包括轉(zhuǎn)錄因子、糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶、水解酶等15。淀粉合成通路復(fù)雜，仍需進一步精細定位關(guān)鍵調(diào)控基因，解析基因功能。總淀粉測定常用的化學方法有旋光法、比色法、酶解法、酸解法等16?；瘜W方法測定過程繁瑣、成本高、耗時長，需要配置特定的儀器，不適合大規(guī)模群體水平的測定。20世紀50年代，近紅

12、外光譜分析（near infrared spectroscopy, NIRS）技術(shù)首先應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)檢測與分析，使NIRS技術(shù)在農(nóng)業(yè)相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用研究陸續(xù)展開17。該技術(shù)通過將化學測定值與光譜數(shù)據(jù)建立數(shù)學模型，運用特定儀器掃描樣品獲得光譜數(shù)據(jù)，便可快速獲得樣品定量或定性檢測結(jié)果。NIRS法測定玉米淀粉含量已入選國標法18。近紅外光是指波長介于可見光與中紅外光之間的電磁波，近紅外光照到樣品的內(nèi)部，發(fā)生反射、折射、吸收等相互作用，使光傳播方向不斷變化，最終攜帶樣品信息反射出樣品表面被檢測器接收，這種漫反射光譜采集方式是顆粒、粉末狀等復(fù)雜樣品無損快速測定的形式19。玉米籽粒形態(tài)不規(guī)則，例如馬齒型

13、呈扁平狀，有明顯的具胚平面和無胚平面。研究發(fā)現(xiàn)玉米胚正對近紅外儀器光源時，采集的光譜包含大量胚的信息，胚背對光源采集到的光譜大部分信息則來自胚乳20。玉米籽粒中98%的淀粉積累在胚乳中，完整籽粒裝樣時很難保證胚的朝向，造成預(yù)測偏差較大。為了增加光譜攜帶信息，研究者傾向于將具胚面朝向光源，導(dǎo)致預(yù)測結(jié)果偏低。完整籽粒裝樣，籽粒之間的孔隙大，當對樣品進行掃描時，近紅外光會穿過籽粒間孔隙，造成能量損失，進而影響光譜信息的準確度。玉米籽粒形狀、大小、顏色等性狀會因種植年份和地區(qū)的不同而變化，使得光譜通用性也面臨嚴峻挑戰(zhàn)。應(yīng)用NIRS法分析茶葉中粗纖維、水分及灰分，發(fā)現(xiàn)當樣品顆粒度為 0.5 mm 時，標

14、準偏差更低，值也較穩(wěn)定21。劉建學采用精米粉建立NIRS蛋白質(zhì)含量預(yù)測模型，相關(guān)系數(shù)達0.94，通過對不同粒度米粉分析，發(fā)現(xiàn)樣品粒度越小，所建模型的預(yù)測性能越好22。羅曦以水稻米粉為樣品建立了水稻抗性淀粉含量預(yù)測模型，內(nèi)部驗證及外部驗證都具有較高的相關(guān)系數(shù)（0.97、0.98），定標模型精度更高，誤差更小23。邵春甫以粒徑約為0.15 mm的高梁粉，建立總淀粉、直鏈淀粉以及支鏈淀粉NIRS模型，相關(guān)系數(shù)分別達到0.95、0.92以及0.94，模型精度高24。宋瑜采用小麥粉建立灰分預(yù)測模型，預(yù)測值與真值之間的相關(guān)系數(shù)為0.94，同樣的樣品處理方式比拉曼光譜分析技術(shù)建立的模型預(yù)測精度高25。劉會影

15、建立NIRS法測定玉米秸稈粉樣中纖維素和半纖維素含量模型，預(yù)測平均相對誤差僅為2.34%和2.13%，預(yù)測值與化學值誤差較小26。已有報道均是針對玉米完整籽粒建立的NIRS總淀粉預(yù)測模型，預(yù)測精度及適用性較低。因此本研究旨在建立以玉米籽粒粉為樣品的NIRS預(yù)測模型，在保證快速、高效前提下進一步提高總淀粉預(yù)測精度，實現(xiàn)對群體水平樣本量的快速準確測定。2 材料與方法2.1試驗材料及田間試驗以230份高配合力玉米自交系為材料，包括美國NSS群、美國SS群，中國NSS群、中國SS群、中國旅大紅骨群、中國四平頭群， 為1982年至2016年我國主要的育種材料對這230份供試自交系的代表性加以描述。201

16、8年種植于吉林省公主嶺中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所基地。采用不完全隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，自交授粉。行長4 m，行間距0.6 m，株距0.26 m，種植密度為6.4萬株/hm2。2.2淀粉測定每次重復(fù)挑選長勢一致的三個單穗混合，剔除不完整的籽粒。利用小型電動磨粉機磨樣，充分粉碎籽粒樣品，過50 mm網(wǎng)篩，鼓風干燥烘箱65度將玉米粉水分烘干至2%以下，保存?zhèn)溆谩２捎每焖偎譁y定儀（YGS-101）測定水分（H）。參照國標方法旋光法（GB 5009.9-2016）測定谷物籽粒淀粉。具體操作為：油浴分解。為保證含水量在2%以內(nèi)，稱樣前利用65度烘箱再次干燥樣品4-6 h。稱取2.5000±

17、0.05 g（W）干粉，放入250 mL三角瓶中，加入20 mL氯化鈣-乙酸溶液（pH=2.0）渦旋混勻，充分溶解樣品, 再加入20 mL氯化鈣-乙酸溶液，沖洗容器壁。置于120度甘油浴鍋中，持續(xù)加熱30 min，取出后自來水沖洗冷卻至室溫。待測液制備。將溶解液全部轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，加入1 mL 硫酸鋅溶液（30%, W/V），搖勻，加入1 mL 亞鐵氰化鉀溶液（15%, W/V），搖勻，蒸餾水定容至100 mL。定量濾紙過濾，濾液即為待測液。上機測定。零點調(diào)整用氯化鈣-乙酸溶液：蒸餾水（6:4）。用待測液潤洗旋光管兩次，在20度恒溫條件下測定相對旋光值（，AUTOPOL III旋光儀）

18、。計算公式。粗淀粉含量（%）=*106/203*LW（1-H）。每個樣品平行測定兩次，相對誤差不超過2%。含水量H平均為1%，管長L為10 cm。該試驗在玉米優(yōu)質(zhì)抗逆育種創(chuàng)新組實驗室完成，玉米標準樣品（71.67%）由農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心提供。平均每5天測定標樣一次，測定值與標準含量相比偏差均小于1.5完成標準方法化驗的實驗室是哪？是否是具備國家部門認可的標準化實驗室？完成后的模型分析出的樣品數(shù)據(jù)是否又由具備國家標準資質(zhì)的實驗室檢測？偏差多少？本研究用的230份自交系（分為定標集及測試集），全部應(yīng)用該方法測定淀粉的準確含量。以標準樣品為校正樣品，本實驗室測定結(jié)果與農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)監(jiān)督檢

19、驗測試中心測定結(jié)果偏差小于1.5%，測定結(jié)果準確可靠。%，測定結(jié)果準確可靠。 本研究230份玉米自交系群體，淀粉含量最高為73.63%。用該模型分析的淀粉含量若超過該閾值，我們會運用旋光法進一步測定其準確含量，同時收集光譜不斷完善擴大該模型的應(yīng)用范圍淀粉含量最高為73.63%以上的測試結(jié)果會受多大偏差？應(yīng)用時如何規(guī)避？。2.3 玉米粉樣NIRS法光譜分析樣品處理與旋光法分析樣品一致。在采集光譜前，所有粉樣在65度下再次平衡水分4-6 h，每批樣品隨機抽取20個進行水分測定，確保水分含量全部在2%以內(nèi)。裝入直徑為2 cm，高5 cm的西林瓶中，樣品高度約4 cm，鎮(zhèn)壓勻?qū)嵰员ＷC各部分密度一致。每

20、份樣品裝樣1次，每次裝樣掃描2次，采集全光譜數(shù)據(jù)保存。近紅外光譜儀器為MPA 型傅立葉近紅外反射光譜儀（德國BRUKER 公司），譜區(qū)范圍4000-12000 cm-1，掃描次數(shù)64，分辨率8 cm-1。2.4 NIRS預(yù)測模型建立與驗證近紅外譜區(qū)范圍采用交互式選擇法確定。在收集樣品近紅外光譜時，一些噪音信息會進入到光譜圖中，影響玉米淀粉分析，也直接影響預(yù)測值的可靠性和準確性。因此，在獲得光譜圖時，運用多種數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，最大限度提高光譜數(shù)據(jù)預(yù)測值與真值間的相關(guān)性。OPUS 6.5提供了多種預(yù)處理函數(shù)，包括無光譜處理、消除常數(shù)偏移量、減去一條直線、矢量歸一化、最小-最大歸一化、多元散射校正、一

21、階導(dǎo)數(shù)、一階導(dǎo)數(shù)及減去一條直線、一階導(dǎo)數(shù)加矢量歸一化。光譜預(yù)處理后利用偏最小二乘法（PLS）對淀粉化學測定值與近紅外光譜數(shù)據(jù)擬合并建立模型，具體包含兩步操作：1）利用定標集樣品建立校正模型，并做交叉檢驗；剔除異常值優(yōu)化模型。2）利用測試集樣品進行外部檢驗。2.5統(tǒng)計分析方法試驗數(shù)據(jù)采用Excel (2016版) 和SAS 軟件進行分析處理，包括方差分析、相關(guān)分析等。3 結(jié)果與分析3.1供試樣品淀粉化學法分析對230份供試自交系玉米粉樣進行粗淀粉含量百分比測定，結(jié)果表明粗淀粉含量最高為73.63%，最低為59.85%，平均值為67.62%，分布頻率如圖1所示。本研究中玉米種質(zhì)材料收集于1982年

22、起至2016年國內(nèi)應(yīng)用廣泛的育種自交系，粗淀粉含量涵蓋了當前育種材料的范圍。 圖1 粗淀粉含量分布頻率直方圖 Figure 1 Crude starch content distribution frequency of maize inbred lines3.2玉米全粒粉近紅外光譜圖將玉米粉在短波近紅外區(qū)進行全光譜掃描（如圖2所示）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同樣品曲線線型相似，表明玉米自交系籽粒基本成分相對一致，樣本間的光譜差異則標志著籽粒中各成分百分含量有差異。平行樣品的吸收峰基本重疊在一塊（相同顏色），說明同一樣品不同生物學重復(fù)光譜的重現(xiàn)性好。 圖2 四份隨機樣品的近紅外漫反射光譜示意圖 Figure

23、 2 Schematic diagram of near-infrared diffuse reflectance spectra of four random samples3.3 玉米粉NIRS模型的校正與優(yōu)化NIRS法需要建立精度高、有代表性的預(yù)測模型，建模樣品集的合理性、化學含量測定的準確性直接影響預(yù)測結(jié)果精確度。按照分析方法2.3，獲得230份玉米交系全粒粉樣準確淀粉含量。供試樣品隨機編號排序，淀粉含量分布均勻，利用MAP配套分析軟件OPUS 6.5按比例50%自動選擇建模樣品。主成分分析顯示定標樣品粗淀粉含量覆蓋95%以上供試材料，具有代表性。利用OPUS6.5計算所有樣品的F概率

24、，F(xiàn)>0.99時顯示為紅色，表明該樣品光譜異常或真值有誤，導(dǎo)致預(yù)測值與真值間差異較大，予以刪除。通過內(nèi)部交叉驗證，驗證模型的準確度，同時去除離散性大的樣品。計算表明馬氏距離GH0.4的樣品可視為來自同一群體，GH0.4的樣品則視為異常樣品予以剔除。本研究最終以106份樣品為定標集，建立玉米粉NIRS預(yù)測模型。定標集淀粉含量最高為73.63%，最低為62.35%，平均為67.73%，標準差2.01，淀粉含量頻率分布直方圖如圖3，化學值變化范圍為11.28%，變異程度較高，基本覆蓋自交系籽粒淀粉質(zhì)量分數(shù)變化范圍，滿足建立NIRS模型條件。圖3定標集淀粉含量頻率分布直方圖Figure 3 St

25、arch content distribution frequency of calibration samplesNIRS法預(yù)測精確度與NIRS模型直接相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2和均方根誤差RMSE是評價預(yù)測模型好壞的主要參數(shù)，高精度預(yù)測模型應(yīng)具有較高R2和較低的RMSE。剔除全部異常樣品，以一階導(dǎo)數(shù)加減去一條直線的最優(yōu)預(yù)處理函數(shù)對光譜進行預(yù)處理，利用偏最小二乘法（PLS）建立的NIRS預(yù)測模型精度最高。標準偏差（RMSEE）為0.609，交叉驗證標準偏差（RMSECV）為0.722；定標相關(guān)系數(shù)（R2cal）為0.909、交叉驗證相關(guān)系數(shù)（R2cv）為0.864（如圖4）。相關(guān)系數(shù)、標準差滿足NI

26、RS模型對準確度的要求，可應(yīng)用于定量檢測分析。圖4 玉米粉樣NIRS淀粉預(yù)測定標模型 Figure 4 Starch content predication model of NIRS of maize kernel powder3.4 玉米粉NIRS模型的預(yù)測效果分析進一步通過外部驗證分析NIRS預(yù)測模型的精度，外部驗證所用的樣品未參加模型建立，分析預(yù)測值和化學值之間的符合程度可評價本模型的預(yù)測效果。同樣根據(jù)F得率剔除部分光譜異常或化學值異常樣品后，外部驗證集由94份樣品組成，淀粉含量最高為71.99%，最低為60.41%，平均值為67.62%，標準差1.92。外部驗證標準差（RMSEP）為

27、0.738，相關(guān)系數(shù)（R2cv）為0.854（圖5）。分析發(fā)現(xiàn)預(yù)測值與旋光測定值偏差均在1.7%以內(nèi)，經(jīng)單因素方差分析兩值無顯著差異，表明該預(yù)測模型精度較高，可應(yīng)用于玉米粉淀粉含量的定量分析。圖5 NIRS模型的外部驗證結(jié)果Figure 5 External validation results of NIRS model 4 討論應(yīng)用NIRS技術(shù)快速掃描樣品，可獲得農(nóng)產(chǎn)品水分、灰分、淀粉、直鏈淀粉、蛋白質(zhì)、油分、脂肪、多糖、單糖等含量，方便快捷，被廣泛應(yīng)用于品質(zhì)的定量和定性分析27-31。玉米自交系平均淀粉含量在67-68%之間，處于較高水平。Xiao等選取的近等基因系淀粉含量僅相差2.8%

28、11。玉米種質(zhì)資源豐富，粒型多變，有硬粒型、馬齒型、中間型、粉質(zhì)型等；籽粒形狀有圓形、楔形、中間型，大小也各不同，籽粒形態(tài)特征的差異會導(dǎo)致完整籽粒NIRS預(yù)測準確度降低32，而籽粒磨粉后顆粒均一，裝樣緊實，可顯著提高光譜穩(wěn)定性，使NIRS預(yù)測偏差大幅降低。本研究建立的模型預(yù)測偏差小于1.7%，預(yù)測值與化學值無顯著差異?；蚬脖磉_分析、轉(zhuǎn)錄組分析法可快速、高效發(fā)掘相關(guān)性狀候選基因9，因此群體水平個體性狀的精確分析始終是限制因素。玉米群體一般成百上千份，數(shù)量大。NIRS法能快速獲得定量或定性數(shù)據(jù)，但由于穩(wěn)定性低通常需要多年多點的數(shù)據(jù)綜合分析7-9，除環(huán)境氣候條件對生長發(fā)育影響外，NIRS法預(yù)測偏差

29、大是主要原因。研究發(fā)現(xiàn)NIRS可靠性的增加，會使穩(wěn)定性降低。劉林三等通過分割建模的方式，來提高對完整籽粒直鏈淀粉的預(yù)測精度33。本文建立的玉米籽粒粉樣淀粉NIRS模型，預(yù)測值與真值無顯著性差異，與完整籽?？焖贌o損檢測相比準確度更高，所需樣品更少。按上機分析時每樣裝樣1次計算，平均只需8.24 g干樣，約25粒干種子（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。水分含量對淀粉含量影響大，若準確分析完整籽粒水分含量則費時費力，若常溫平衡水分則需花費較長時間。籽粒粉樣水分可快速烘干、精確檢測，本文中用鼓風干燥箱烘干玉米粉樣只需12小時，含水量更低的粉樣NIRS預(yù)測值也更接近絕對含量。但本文中建立模型所用樣品的淀粉含量范圍較窄，對

30、于含量低于60%及高于74%的樣品預(yù)測穩(wěn)定性較低，需進一步搜集玉米材料完善預(yù)測模型范圍。5 參考文獻1 張濤. 玉米淀粉深加工技術(shù)及產(chǎn)品用途J. 農(nóng)牧產(chǎn)品開發(fā), 1998, 32-34.Zhang T. The deep processing technology of corn starch and application of starch product. Agricultural and Animal Product Development, 1998, 32-34. (in Chinese)2 孫琦, 張世煌, 李新海等. 中國不同年代主推玉米品種品質(zhì)性狀的變化趨勢J. 中國農(nóng)業(yè)科學

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