POD 測定方法

1、植物體POD的測定<原理>了解過氧化氫酶活性測定的幾種方法，掌握用愈創(chuàng)木酚法分別測定過氧化氫酶和過氧化物酶的活性。過氧化物酶廣泛頒布于植物的各個組織器官中。在有過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，可用分光光度計測量生成物的含量。<實驗材料、試劑與儀器設(shè)備>1、實驗儀器722型分光光度計、離心機、秒表、電子天平、研缽2、實驗試劑愈創(chuàng)木酚、30%過氧化氫、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)、反應(yīng)混合液100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)50mL，加入愈創(chuàng)木酚28uL，加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后

2、，加入30%過氧化氫19uL，混合均勻保存于冰箱中3、實驗材料任何植物材料<實驗步驟>1、粗酶液的提取稱取植物(小麥葉片)材料0.1g，加20mmol/LKH2PO4 5mL，于研缽中研磨成勻漿，以10000r/min離心10分鐘，收集上清液保存在冷處，所得殘渣再用20mmol/LKH2PO45mL溶液提取一次，全并兩次上清液。2、酶活性的測定取比色皿2只，于一只中加入反應(yīng)混合液3mL，KH2PO41mL，作為校零對照，另一只中加入反應(yīng)混合液3mL，上述酶液1mL(如酶活性過高可適當稀釋)，立即開啟秒表，于分光光度計470nm波長下測量OD值，每隔30s讀數(shù)一次。以每分鐘表示酶活性

3、大小，即以O(shè)D470/min.mg蛋白質(zhì)表示，蛋白質(zhì)含量測定按Folin法進行。<結(jié)果計算>以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以A470/min.g(鮮重)表示之。也可以用每min內(nèi)A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位(u)表示。 過氧化物酶活性u/(g.min)=式中：A470反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化。 W植物鮮重，g。 VT 提取酶液總體積，mL。Vs 測定時取用酶液體積 ,mL。 t反應(yīng)時間，min。 項目詳細信息介紹項目名稱 過氧化物酶(POD)活性的測定（比色法）所屬實驗課程植物生理學(xué)實驗學(xué)年度2007-2008學(xué)期01專業(yè)分類生物化學(xué)關(guān)鍵詞過氧化物酶(POD)

4、活性的測定實驗要求選修帶課教師陳穎實驗?zāi)康倪^氧化物酶廣泛分布于植物的各個組織器官中。在有過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，可用分光度計測量生成物的含量?；久枋?稱取植物材料1g，加入，0.1mo1/L磷酸緩沖 (pH7.0) 10ml(分三次加入，最后兩次用于洗研缽)，在研缽中研磨成勻漿，以 4 000rmin 離心15分鐘，傾出上清液。 2取一試管加 3.8 ml 0.3%愈創(chuàng)木酚反應(yīng)液，加100ul 3過氧化氫，加酶液100ul （視酶活性大小而定，如酶濃度高可稀釋后再測定），搖勻，立即在分光光度計470nm下測吸光度，從加入酶液時立即開啟秒表記錄時間，1分鐘時

5、讀數(shù)一次（也可2min，視材料而定）。 3以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以A470/min.mg蛋白質(zhì)（或鮮重g）表示之。過氧化物酶活性(U)=A470/min×稀釋倍數(shù)/g.Fw 該實驗涉及到的主要儀器設(shè)備null實驗總?cè)藬?shù)30每組人數(shù)4實驗學(xué)時2是否特色否實驗地點植物生理學(xué)實驗室3.POD的測定方法試劑配制：（1）0.1mol/L的醋酸緩沖液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸緩沖液 A(0.2mmol/L的HAc溶液)6ml冰醋酸溶到494ml蒸餾水中 B(0.2mmol/L的NaAc溶液)（2）0.25%愈創(chuàng)木酚溶液125um愈創(chuàng)木酚溶于50m

6、l 50%乙醇中（臨用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（臨用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸緩沖液1ml 0.25%愈創(chuàng)木酚溶液xml酶液（5min值為500-800即可）0.1ml 0.75%H2O2溶液迅速巔到混勻把A460調(diào)零并開始計時1次/30s,連續(xù)讀取3min過氧化物酶(POD)活性的測定【實驗原理】植物體內(nèi)的黃素氧化酶類代謝產(chǎn)物常包含H202 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H202的積累可導(dǎo)致破壞性的氧化作用。過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)是清除H202的重要保護

7、酶，能將H202分解為02和H20,從而使機體免受H202的毒害作用。其活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。(CAT)催化如下反應(yīng)：2 H2022 H20+ 02本實驗通過測定H202的減少量來測定CAT的活性。在H202存在條件下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色的4-鄰甲氧基苯酚?？捎梅止夤舛扔嫓y生成物的含量來測定活性。【試劑藥品1.50m mol/l pH7.0的磷酸緩沖液2.0.3% H202: 吸0.5ml 30% H202 加入pH7.0的磷酸緩沖液至 50ml3.0.2% 愈創(chuàng)木酚 :秤0.2g愈創(chuàng)木酚加入pH7.0的磷酸緩沖液至 100ml【實驗步驟】酶液的制備1.稱取葉片 0.25g ，加入5倍量的（M/V）pH7.0 的PBS 冰浴研磨 15000r/min離心15min取部分上清液經(jīng)適當稀釋后用于酶活性測定。2. CAT活性的測定在3ml的反應(yīng)體系中，包括0.3% H202 1ml, H20 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液啟動反應(yīng)，測定波長240nm處的OD降低速度。將每分鐘OD減少0.01定義為1個活力單位。3. POD活性的測定在3ml的反應(yīng)體系中，包括0.3% H202 1ml, .0.2% 愈創(chuàng)木酚0.95ml,pH7.