細(xì)胞免疫熒光

1、wordDAPIDAPI即4',6-二瞇基-2-苯基口引喋(4',6-diamidino-2-phenylindole),是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測(cè)。因?yàn)镈API可以透過完整的細(xì)胞膜，它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染劑是利用紫外光波長(zhǎng)的光線激發(fā)。當(dāng)DAPI與雙股DNA結(jié)合時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)為358nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm,其發(fā)散光的波長(zhǎng)X圍含蓋了藍(lán)色至青綠色。DAPI也可以和RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度不及與DNA結(jié)合的結(jié)果，其發(fā)散光的波長(zhǎng)X圍約在400nm左右。DAPI的發(fā)散光為藍(lán)色，且DAPI和綠色熒光蛋白

2、(Greenfluorescentprotein,GFP)或TexasRed染劑(紅色熒光染劑)的發(fā)散波長(zhǎng)，僅有少部分重疊，研究員可以善用這項(xiàng)特性在單一的樣品上進(jìn)行多重?zé)晒馊旧?。DAPI能快速進(jìn)入活細(xì)胞中與DNA結(jié)合，因此DAPI對(duì)生物體而言，也被視為一種毒性物質(zhì)與致癌物。使用過程中應(yīng)注意操作與拋棄的處理程序。染色原理：DAPI為一種熒光染料，可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光，和EB相比，對(duì)雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到顯藍(lán)色熒光的細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞標(biāo)記的效率高(幾乎為100%)。DAPI染色常用于細(xì)胞凋

3、亡檢測(cè),染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。DAPI也常用于普通的細(xì)胞核染色以及某些特定情況下的雙鏈DNA染色。細(xì)胞經(jīng)熱激處理后用DAPI染色3分鐘，在熒光顯微鏡下可以看到到細(xì)胞核的形態(tài)變化。a、正常的煙草細(xì)胞核：核形完整，染色質(zhì)均勻。b、染色質(zhì)固縮，向外周聚集，形成周邊化。c、染色質(zhì)進(jìn)一步固縮，形成很多顆粒物質(zhì)。d、細(xì)胞核破裂形成碎片，核解體。染色步驟編輯在細(xì)胞移植前，將DAPI以一定的濃度加入培養(yǎng)基中，與細(xì)胞共同孵育過夜，用PBS緩沖液漂洗至少6次以洗掉未結(jié)合的DAPI,再用酶消化后離心收集細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液以備用。存儲(chǔ)條件：-20C避光保存每次使用，用量較少，可反復(fù)

4、凍融，無需分裝注意事項(xiàng)：1、DAPI強(qiáng)烈致癌，操作時(shí)要戴上手套。2、貯存液用70%酒精配制，濃度100科g/ml,可用黑紙包住，長(zhǎng)期凍存。使用液按1:1000用PBS稀釋，最終濃度100ng/ml。3、DAPI是非常優(yōu)秀的DNA染料，固定過和沒有固定過的活細(xì)胞均可用DAPI染色。9 / 9FAM(竣基熒光素)分子式：C21H12O7分子量：376.32別名：5-FAM結(jié)構(gòu)式：5-Carboxyfluorescein性狀：溶于水，溶于DMSO和DMF貯存：-20°C干燥避光保存用途：5-FAM主要應(yīng)用于DNA自動(dòng)測(cè)序中，標(biāo)記其中的d/ddCTP(三磷酸胞喀咤脫氧核甘酸、2',3

5、'-雙脫氧胞喀咤三磷酸)，也經(jīng)常用于PCR產(chǎn)物定量，核酸探針等。FAM梭基熒光素(carbox州uorescein)是熒光素衍生物白一種淇中5FAM(carbox姆uorescein-sueeimidvlester),廣泛存在于熒光標(biāo)記試劑盒(Ap-pliedBio叮stemsCo甲o(hù)ration,AmpF比聲脯lerRus翎,PeRA呷li6eationKitUser乞Manual;Prome羅Co甲o(hù)ratoin,Gene而ntTMPowerPlexTM,1.2SystemTechnic以Manual)。FAM與氨基反應(yīng)快速，產(chǎn)物也更穩(wěn)定，適用于氫離子激光(Argon-ionl丑s

6、er)的488nm光譜線,Abs/Em=492/slsnm(pH=9.0),具有熒光素衍生物的普遍特性，在水中穩(wěn)定。FITC(異硫氟酸熒光素)異硫氟酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體I型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4,最大吸收光波長(zhǎng)為490495nm,最大發(fā)射光波長(zhǎng)為520530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。蛋白熒光

7、標(biāo)記試劑，也是醫(yī)學(xué)診斷藥物，主要用作熒光抗體技術(shù)中的熒光染料，能和各種抗體蛋白結(jié)合，結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性，并在堿性溶液中具有強(qiáng)烈的綠色熒光。用于醫(yī)學(xué)，農(nóng)學(xué)和畜牧等方面，可對(duì)由地細(xì)菌病毒和寄生蟲等所致疾病進(jìn)行快速診斷。5-FITCFITCIsomerI;fluorescein-5-isothiocyanate異硫氟酸熒光素3326-32-7C21H11NO5s389.38用于標(biāo)記蛋白，28C保存50mgusingASF(anuclearspecklemarker)核斑紋標(biāo)記(1)熒光素類Fluorescein標(biāo)準(zhǔn)熒光素(Referencestandard)之一，在其基礎(chǔ)上進(jìn)行

8、結(jié)構(gòu)改造，可產(chǎn)生一系列熒光素衍生物。Fluorescein適用于Argon-ionLaser的488nm光譜線，有相對(duì)高的熒光吸收，較好的熒光產(chǎn)率以及良好的水溶性。標(biāo)記蛋白時(shí)通常不會(huì)產(chǎn)生蛋白沉淀。與其他熒光素類衍生物一樣，F(xiàn)luorescein具有光淬滅率高，pH敏感性強(qiáng)與發(fā)射波譜寬的缺點(diǎn)。主要應(yīng)用于聚焦激光掃描微陣歹！J(Confocallaserscanningmicroscopy)和流式細(xì)胞計(jì)應(yīng)用(Flowcytometry)。FITC異硫富酸熒光素，F(xiàn)luoresceinisothiocyanate,是熒光素衍生物的一種，5-FITC較6-FITC更經(jīng)常使用。FITC的異硫富酸基能與氨

9、基反應(yīng)，可用于標(biāo)記氨基修飾DNA一旦形成，產(chǎn)物極為穩(wěn)定。適用于Argon-ionLaser的488nm光譜線，Abs/Em=492/519nm(pH=9.0)。與蛋白的結(jié)合力也強(qiáng)。FITC具有熒光素衍生物的普遍特性。在水中易變壞，不能長(zhǎng)久保存。FITC-Oligo廣泛用于雜交探針；FITC-多肽用于Edman制解蛋白測(cè)序；FITC也經(jīng)常被用于蛋白電泳檢測(cè)(即使是毛細(xì)管電泳)和熒光能量激發(fā)轉(zhuǎn)移測(cè)試。FAM竣基熒光素，Carboxyfluorescein,是熒光素衍生物的一種，5-FAM較6-FAM更經(jīng)常使用。Carboxyfluorescein-5-succimidylester,即5-FAM（

10、NHS廣泛存在于熒光標(biāo)記試劑盒。與FITC相比，F(xiàn)AMW氨基反應(yīng)更快，產(chǎn)物也更穩(wěn)定，但FITC結(jié)合蛋白的量更大且進(jìn)程更易于控制。FAM也適用于Argon-ionLaser的488nm光譜線，Abs/Em=492/518nm（pH=9.0）,具有熒光素衍生物的普遍特性，在水中穩(wěn)定。5-FAM主要應(yīng)用于DNA!動(dòng)測(cè)序中，標(biāo)記其中的d/ddCTP（PE公司），也經(jīng)常用于PCRT物定量，核酸探針等。TET四氯熒光素，Tetrachlorofluorescein,是熒光素衍生物的一種。TET以及HEX勻是在FAMS礎(chǔ)上加以改進(jìn)的，氯原子使FAMAbs與Em直都產(chǎn)生一定的紅移，并在一定程度上減弱了pH敏感

11、性。TET也適用于Argon-ionLaser激發(fā)光源，Abs/Em=521/536nm。TET,HEXFAMff口TAMRAX配合用于DNA自動(dòng)測(cè)序中，其中TET用于標(biāo)記d/ddATP,HEX用于標(biāo)記d/ddGTP或d/ddATP（PE公司）HEX六氯熒光素，Hexachlorofluorescein,是熒光素衍生物的一種。適用于Argon-ionLaser激發(fā)光源，Abs/Em=535/556nm（請(qǐng)參見TET介紹)JOE竣基-4',5'-二氯-2'7-二甲氧基熒光素，Carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dime

12、thoxyfluorescein,是熒光素衍生物的一種，6-JOE更被廣泛使用。JOE熒光產(chǎn)量高，pH敏感性弱，適合于標(biāo)記蛋白。6-JOE也適合于Argon-ionLaser激發(fā)光源，Abs/Em=520/548(pH=9.0)常用于DNA自動(dòng)測(cè)序，標(biāo)記d/ddATP,也經(jīng)常被用于進(jìn)行電泳檢測(cè)與PC心物定量。(2)羅丹明類(Rhodaminedye)R110標(biāo)準(zhǔn)熒光素(Referencestandard)之一，在其基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，即可產(chǎn)生一系列羅丹明類衍生物。與Fluorescein類衍生物相比，羅丹明類熒光素具有更強(qiáng)的光穩(wěn)定性，更高的熒光產(chǎn)量以及更低的pH敏感性羅丹明類熒光素極為適合于標(biāo)

13、記寡核甘酸，但蛋白會(huì)引起大多數(shù)羅丹明類熒光素的熒光淬滅，故大多數(shù)不適宜用于標(biāo)記蛋白。R110被用于DNA自動(dòng)測(cè)序。TAMRA全稱竣基四甲基羅丹明，即Carboxytetramethylrhodamine,是羅丹明類熒光素衍生物，6-TAMR破廣泛使用。TAMRA是少數(shù)幾個(gè)能用于標(biāo)記蛋白的，6-TAMRAS適用于Argon-ionLaser激發(fā)光源，Abs/Em=547/573nm(Ph=8.0),6-TAMRA(NHS常用于熒光標(biāo)記試劑盒中。6-TAMR隹要用于DNA自動(dòng)測(cè)序中。TexasRedTexasRed是一個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光素，與Fluorescein幾乎沒有波譜重疊，只適合于Ar-KrLa

14、ser的568nm光譜線或He-NeLaser的594光譜線，比Tetramethylrhodamine和LissamineTMRhodamineB波長(zhǎng)更長(zhǎng)，熒光量更高。TexasRed在熒光微陣列和流式細(xì)胞計(jì)中更被經(jīng)常作為第三波長(zhǎng)標(biāo)記(Thirdlabels)。(3)BODIPY!BODIPY類熒光素是由分子探針公司開發(fā)，以用來替代那些有部分缺陷的傳統(tǒng)熒光素，普遍具有熒光產(chǎn)量高，pH敏感性低(無離子變化)，光穩(wěn)定性強(qiáng)以及發(fā)射波譜窄的優(yōu)點(diǎn)，故BODIP襟熒光素已被廣泛用于核酸，脂肪酸，磷脂以及各種受體。同時(shí)，由于在電泳過程中對(duì)序列片段影響小，故已被逐漸用于DNA自動(dòng)測(cè)序。但相對(duì)而言，BODIP催熒光素并不特別適合標(biāo)記蛋白.BODIPYFL可代替FluoresceinBODIPYR6G可代替Rhodamine6GBODIPYTMRM代替TetramethylrhodamineBODIPYTR可代替TexasRed這些BODIPY熒光素具有與被替代物幾乎類似的光譜特征，能共用同樣的光過濾器與激發(fā)光源，但更具優(yōu)點(diǎn)。(4)其他熒光素CascadeblueCascadeblue是在花(pyrene)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改造得來的，即sulfonatedpyrene,它是一種短波長(zhǎng)紫外激發(fā)熒光素，與另一種常用的紫外熒光素Aminocoumarin相比，Cascadeblue的Em與Flu