干細胞標記論文

1、SPIO標記人胚胎干細胞皮下注射小鼠的示蹤商量【摘要】目的：探討超順磁性氧化鐵微粒（SPIO）體外標記人胚胎干細胞（ESC）及體內(nèi)示蹤皮下注射裸鼠的人胚胎干細胞的能力。方法：使用硫酸魚精蛋白-SPIO 共培育方式標記人胚胎干細胞。接受顯微鏡觀察干細胞標記情況，并進行富集純化，將經(jīng)過SPIO標記的干細胞皮下注射裸鼠體內(nèi)，應(yīng)用15TMRI系統(tǒng)進行磁標記干細胞成像。結(jié)果：初步標記后的人胚胎干細胞用顯微鏡觀察，SPIO標記的干細胞細胞胞質(zhì)內(nèi)消失細小的黑色鐵顆粒，標記效率為90；標記了SPIO 的人胚胎干細胞體內(nèi)MRI 成像時顯示，細胞移植區(qū)域T2信號減弱。結(jié)論：SPIO能成功地標記ESC，SPIO 標

2、記的ESC 皮下注射入小鼠體內(nèi)的分布、遷移過程可用MRI進行檢測評價?！娟P(guān)鍵詞】干細胞移植；示蹤；超順磁性氧化鐵；磁共振成像；標記近些年來，胚胎干細胞的商量始終是生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)中的熱點。胚胎干(embryonic stem,ES)細胞因具有全能性和無限增殖的能力而有望成為組織工程中種子細胞的新來源1。但是, ESC目前尚不能真正應(yīng)用于臨床治療, 還有很多問題亟待解決。其中, 較為突出的是如何對移植的干細胞進行長期的、無創(chuàng)傷的實時檢測, 從而了解其在體內(nèi)的分布、遷徙、分化和轉(zhuǎn)歸等生物學(xué)行為。本實驗用SPIO標記人的胚胎干細胞，并通過皮下注射小鼠體，用MRI檢測其增殖分化特性。核磁共振成像( Ma

3、gneticResonance Imaging，MRI)是分子影像學(xué)的一種技術(shù)，增加了本實驗過程細胞移植的無創(chuàng)活體示蹤的可行性。依據(jù)成像方法不同， 分子成像主要包括核素分子成像、磁共振( magnetic resonance, MR )分子成像、光學(xué)分子成像等。因MR成像具有無放射性, 有較高的軟組織分辨能力和良好的重復(fù)性而倍受推崇2。 超順磁性氧化鐵微粒( superparamgnetic iron oxides，SPIO)為一種納米分子探針，具有因良好的生物相容性和磁共振信號敏感性而被應(yīng)用于該實驗中。細胞通過吞噬、吞飲等方式將納米粒子內(nèi)吞于細胞體內(nèi)，而對不具有吞噬能力或吞噬能力較弱的細胞,

4、 由于標記率低而不能直接將此類造影劑用于細胞的標記。磁性納米粒子表面修飾被認為是磁性納米粒子與細胞膜表面非特異性相互作用的關(guān)鍵因素, 影響細胞標記率1，并且磁性粒子的粒徑影響磁共振靈敏度， 磁性納米簇與單個納米粒子相比能顯著增強MRI信號2-4。本商量選擇微米級超順磁氧化鐵顆粒(SPIO)標記小鼠胚胎干細胞(ESC)及其分化的心肌細胞并行MR顯像，以檢測標記的有效性和對細胞生物學(xué)活性影響。1 材料與方法11 材料 裸鼠、 硫酸魚精蛋白、SPIO、15TMRI12 方法121 混合液的配制 1.先稱取10mg的硫酸魚精蛋白溶于10ml的蒸餾水中；2.用槍吸取0.3ml的SPIO溶于20ml的無血

5、清的培育基中；3.取1中已配制的溶液100ul加入2中溶液中，使硫酸魚精蛋白濃度為5ug/ml；4.往3中的溶液加入等體積的雙倍血清培育基，使最終SPIO的濃度為50ug Fe/ml,即所需溶液。122 干細胞的體外標記及富集 6天之后，兩種細胞長到大約整個瓶壁的60%，即用我們預(yù)先配制好的混合液給細胞換液，孵育過夜，接下其次天，觀察磁珠標記的情況，并拍照，大多數(shù)細胞均被標記。為了得到更高的標記效率，第三天我們又進行了富集純化，富集過程如下： 1.用胰酶消化細胞，加入3ml的培育基，并將細胞轉(zhuǎn)移到15ml的玻璃離心 中，15000rpm離心5min，棄上清； 2.加入新的培育基打勻細胞，用強力

6、磁石富集，棄上清，重復(fù)2次；3.加入2.5ml新培育基打勻之后轉(zhuǎn)移至小培育皿中，4小時之后細胞貼壁之后觀察，并進行拍照，觀察富集情況，對比富集前后的磁珠標記的情況，富集后幾乎每個細胞均被標記。 收集標記的細胞，制成100ul懸液，皮下注射小鼠左腋下，2周后進行核磁共振成像2 結(jié)果21 SPIO 標記干細胞的結(jié)果干細胞的超順磁氧化鐵顆粒標記：電鏡顯示ESC胞質(zhì)內(nèi)散在分布很多囊泡樣結(jié)構(gòu)即吞飲小泡，高密度鐵顆粒主要集中在囊泡內(nèi)，直徑大約0815 m(圖1)。鏡檢可見ESC胞漿內(nèi)存在大量黑色的SPIO 顆粒，細胞標記率為90（圖1） 富集前檢測SPIO標記ESC（200*） 富集后檢測SPIO標記ES

7、C（100*）圖122 MRI 檢測經(jīng)SPIO標記的ESC移植入正常小鼠左腋皮下，于3-6周后行MRI掃描，在移植部位可見信號缺失區(qū)（圖2）。 細胞移植后的小鼠腋下MRI 掃描結(jié)果 圖23 商量 1，魚精蛋白-SPIO標記率單獨使用SPIO標記非吞噬細胞的效果差，而SPIO和陽離子轉(zhuǎn)染劑(transfection agents，Tas)形成混合物與細胞共培育可大幅提高細胞內(nèi)的鐵攝入量3-4。細胞標記效率與細胞種類、SPIO與轉(zhuǎn)染劑的種類及濃度、共培育時間等有關(guān)3，因此不同種類細胞的最佳化標記方案需要大量實驗驗證，而每種細胞對應(yīng)標記策略的平安性檢測至關(guān)重要。雖然大多數(shù)商量顯示在適當劑量內(nèi)SPIO

8、標記不會影響干細胞的活性、增殖、分化及增加細胞凋亡3-5，但有商量表明較高濃度的SPIO會限制干細胞的增殖5，磁標記干細胞劑量依靠性的向成骨及成軟骨分化減弱亦見報道5-6。由于細胞膜及一般未修飾的SPIO都帶負電荷，細胞不容易攝取，葡聚糖、去鐵蛋白、羧酸聚酰胺樹脂等包被材料，以及PLL、磁性脂質(zhì)體、植物血凝素等轉(zhuǎn)染介質(zhì)的應(yīng)用大大增加了其被細胞吞噬的效率7。對氧化鐵的修飾不僅要增加氧化鐵同細胞膜的親和力,還要進一步幫助氧化鐵微粒進入細胞質(zhì)內(nèi)。本次實驗用硫酸魚精蛋白作為轉(zhuǎn)染介質(zhì)能穿梭于細胞膜內(nèi)外。Emerit等8商量發(fā)現(xiàn):細胞內(nèi)非結(jié)合的鐵能使氧化作用加強,形成過多的氧化產(chǎn)物和羥基自由基而損傷細胞,

9、甚至導(dǎo)致細胞壞死。然而,目前國內(nèi)外文獻關(guān)于鐵濃度對標記細胞的影響的報道差異較大,可能是由于所用的氧化鐵微粒不同而引起的細胞內(nèi)實際游離鐵的差異、標記細胞的濃度差異以及標記時間長短不一引起的。但是, 由于細胞磁標記隨著鐵濃度和孵育時間的增加而增加9 , 且逐漸增加鐵標記濃度和延長標記時間將對細胞的活性及增值能力產(chǎn)生負面影響 10 , 用于磁化標記的鐵濃度應(yīng)當選擇在滿足要求的較低濃度, 我們提倡在共同孵育24 h情況下, 鐵濃度應(yīng)選擇在2040 Lg/ml。 2.MRI成像隨著分子影像學(xué)的進展，活體追蹤干細胞成為可能。MRI示蹤術(shù)是一種示蹤細胞遷移的有效方法。然而，常規(guī)MRI無法顯示移植細胞和與細胞

10、作用的靶細胞或靶器官。而使用超順磁性氧化鐵SPIO作為負性標記物則可以解決此難題。SPIO 在臨床中主要用于肝臟的MRI 負性增強成像，近年來進展到各種細胞的成像，如干細胞11，12。在用于細胞標記時，標記細胞內(nèi)的SPIO 在磁場中引起局部磁場紊亂，在標記了SPIO 的細胞部位及其周圍肯定空間范圍內(nèi)產(chǎn)生無信號或低信號區(qū)， 從而推斷被標記細胞的位置， 依據(jù)其位置的轉(zhuǎn)變和信號的衰減還可推斷細胞的移行、空間分布和增殖情況。細胞膜與SPIO 顆粒都帶有負電荷，兩者相互排斥使得氧化鐵顆粒很難進入細胞內(nèi)，標記率低，所以必需對氧化鐵顆粒進行適當?shù)男揎?，轉(zhuǎn)變其粒子的電性。本實驗接受魚精蛋白包埋SPIO顆粒，使

11、帶負電荷的細胞膜通過非特異性吸取過程攝取SPIO 顆粒。結(jié)果顯示魚精蛋白能使SPIO 高效地標記ESC。在顯微鏡下觀察檢測細胞漿內(nèi)的鐵顆粒，發(fā)現(xiàn)標記率達到90。SPIO 對標記細胞毒性低，細胞增殖不受影響。與未標記細胞相比，標記干細胞的細胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與文獻報道結(jié)果全都14。表明該方法是一種平安的方法，即使在移植后2周，也能通過MRI 監(jiān)測到移植細胞的存活和分布狀況。MRI因其諸多優(yōu)勢在移植細胞定位、生存及遷移監(jiān)測等領(lǐng)域成為商量熱點， 超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)是干細胞MR示蹤中應(yīng)用最廣泛的對比劑15。 SPIO標記干細胞的M

12、R成像 目前多數(shù)干細胞商量接受組織學(xué)分析來評價細胞定位、存活數(shù)量、移植細胞的分化等。但組織學(xué)是有創(chuàng)檢查，而且不能代表全部移植細胞的體內(nèi)生存情況及其動態(tài)遷移3。干細胞移植的臨床應(yīng)用及相關(guān)科學(xué)商量需要合適的影像學(xué)方法對移植細胞在活體進行連續(xù)、無創(chuàng)的示蹤觀察16活體示蹤移植干細胞的生存狀態(tài)及遷移對闡明治療效果的潛在機制及臨床應(yīng)用的實施有極其重要的作用。MR有良好的軟組織準時間分辨率，無電離輻射，可以在示蹤干細胞的同時評價干細胞移植的治療效果，MR透視引導(dǎo)下精確移植定位的商量已見報道17。MRI因其諸多優(yōu)勢在活體干細胞監(jiān)測領(lǐng)域成為商量熱點。SPIO 對標記細胞毒性低，細胞增殖不受影響。與未標記細胞相比

13、， 標記干細胞的細胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與文獻報道結(jié)果全都18。參考文獻1 沈干，從笑倩，汪錚，吳春芳，曹誼林 小鼠胚胎干細胞建系及GFP標記東南高校學(xué)報.2003,Mar; 22( 2) : 71O74, 88 2 M atuszew sk iL, Tom bach B, H eindelW, et al. M olecular and param e-tric im aging w ith iron oxides J . Rad iologe, 2007, 47( 1) : 34- 42.3 Frank JA, Miller BR, Arbab AS,et al. Clinically

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