干細(xì)胞標(biāo)記論文

1、SPIO標(biāo)記人胚胎干細(xì)胞皮下注射小鼠的示蹤商量【摘要】目的：探討超順磁性氧化鐵微粒（SPIO）體外標(biāo)記人胚胎干細(xì)胞（ESC）及體內(nèi)示蹤皮下注射裸鼠的人胚胎干細(xì)胞的能力。方法：使用硫酸魚(yú)精蛋白-SPIO 共培育方式標(biāo)記人胚胎干細(xì)胞。接受顯微鏡觀察干細(xì)胞標(biāo)記情況，并進(jìn)行富集純化，將經(jīng)過(guò)SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞皮下注射裸鼠體內(nèi)，應(yīng)用15TMRI系統(tǒng)進(jìn)行磁標(biāo)記干細(xì)胞成像。結(jié)果：初步標(biāo)記后的人胚胎干細(xì)胞用顯微鏡觀察，SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)消失細(xì)小的黑色鐵顆粒，標(biāo)記效率為90；標(biāo)記了SPIO 的人胚胎干細(xì)胞體內(nèi)MRI 成像時(shí)顯示，細(xì)胞移植區(qū)域T2信號(hào)減弱。結(jié)論：SPIO能成功地標(biāo)記ESC，SPIO 標(biāo)

2、記的ESC 皮下注射入小鼠體內(nèi)的分布、遷移過(guò)程可用MRI進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià)。【關(guān)鍵詞】干細(xì)胞移植；示蹤；超順磁性氧化鐵；磁共振成像；標(biāo)記近些年來(lái)，胚胎干細(xì)胞的商量始終是生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)中的熱點(diǎn)。胚胎干(embryonic stem,ES)細(xì)胞因具有全能性和無(wú)限增殖的能力而有望成為組織工程中種子細(xì)胞的新來(lái)源1。但是, ESC目前尚不能真正應(yīng)用于臨床治療, 還有很多問(wèn)題亟待解決。其中, 較為突出的是如何對(duì)移植的干細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期的、無(wú)創(chuàng)傷的實(shí)時(shí)檢測(cè), 從而了解其在體內(nèi)的分布、遷徙、分化和轉(zhuǎn)歸等生物學(xué)行為。本實(shí)驗(yàn)用SPIO標(biāo)記人的胚胎干細(xì)胞，并通過(guò)皮下注射小鼠體，用MRI檢測(cè)其增殖分化特性。核磁共振成像( Ma

3、gneticResonance Imaging，MRI)是分子影像學(xué)的一種技術(shù)，增加了本實(shí)驗(yàn)過(guò)程細(xì)胞移植的無(wú)創(chuàng)活體示蹤的可行性。依據(jù)成像方法不同， 分子成像主要包括核素分子成像、磁共振( magnetic resonance, MR )分子成像、光學(xué)分子成像等。因MR成像具有無(wú)放射性, 有較高的軟組織分辨能力和良好的重復(fù)性而倍受推崇2。 超順磁性氧化鐵微粒( superparamgnetic iron oxides，SPIO)為一種納米分子探針，具有因良好的生物相容性和磁共振信號(hào)敏感性而被應(yīng)用于該實(shí)驗(yàn)中。細(xì)胞通過(guò)吞噬、吞飲等方式將納米粒子內(nèi)吞于細(xì)胞體內(nèi)，而對(duì)不具有吞噬能力或吞噬能力較弱的細(xì)胞,

4、 由于標(biāo)記率低而不能直接將此類造影劑用于細(xì)胞的標(biāo)記。磁性納米粒子表面修飾被認(rèn)為是磁性納米粒子與細(xì)胞膜表面非特異性相互作用的關(guān)鍵因素, 影響細(xì)胞標(biāo)記率1，并且磁性粒子的粒徑影響磁共振靈敏度， 磁性納米簇與單個(gè)納米粒子相比能顯著增強(qiáng)MRI信號(hào)2-4。本商量選擇微米級(jí)超順磁氧化鐵顆粒(SPIO)標(biāo)記小鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)及其分化的心肌細(xì)胞并行MR顯像，以檢測(cè)標(biāo)記的有效性和對(duì)細(xì)胞生物學(xué)活性影響。1 材料與方法11 材料 裸鼠、 硫酸魚(yú)精蛋白、SPIO、15TMRI12 方法121 混合液的配制 1.先稱取10mg的硫酸魚(yú)精蛋白溶于10ml的蒸餾水中；2.用槍吸取0.3ml的SPIO溶于20ml的無(wú)血

5、清的培育基中；3.取1中已配制的溶液100ul加入2中溶液中，使硫酸魚(yú)精蛋白濃度為5ug/ml；4.往3中的溶液加入等體積的雙倍血清培育基，使最終SPIO的濃度為50ug Fe/ml,即所需溶液。122 干細(xì)胞的體外標(biāo)記及富集 6天之后，兩種細(xì)胞長(zhǎng)到大約整個(gè)瓶壁的60%，即用我們預(yù)先配制好的混合液給細(xì)胞換液，孵育過(guò)夜，接下其次天，觀察磁珠標(biāo)記的情況，并拍照，大多數(shù)細(xì)胞均被標(biāo)記。為了得到更高的標(biāo)記效率，第三天我們又進(jìn)行了富集純化，富集過(guò)程如下： 1.用胰酶消化細(xì)胞，加入3ml的培育基，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml的玻璃離心 中，15000rpm離心5min，棄上清； 2.加入新的培育基打勻細(xì)胞，用強(qiáng)力

6、磁石富集，棄上清，重復(fù)2次；3.加入2.5ml新培育基打勻之后轉(zhuǎn)移至小培育皿中，4小時(shí)之后細(xì)胞貼壁之后觀察，并進(jìn)行拍照，觀察富集情況，對(duì)比富集前后的磁珠標(biāo)記的情況，富集后幾乎每個(gè)細(xì)胞均被標(biāo)記。 收集標(biāo)記的細(xì)胞，制成100ul懸液，皮下注射小鼠左腋下，2周后進(jìn)行核磁共振成像2 結(jié)果21 SPIO 標(biāo)記干細(xì)胞的結(jié)果干細(xì)胞的超順磁氧化鐵顆粒標(biāo)記：電鏡顯示ESC胞質(zhì)內(nèi)散在分布很多囊泡樣結(jié)構(gòu)即吞飲小泡，高密度鐵顆粒主要集中在囊泡內(nèi)，直徑大約0815 m(圖1)。鏡檢可見(jiàn)ESC胞漿內(nèi)存在大量黑色的SPIO 顆粒，細(xì)胞標(biāo)記率為90（圖1） 富集前檢測(cè)SPIO標(biāo)記ESC（200*） 富集后檢測(cè)SPIO標(biāo)記ES

7、C（100*）圖122 MRI 檢測(cè)經(jīng)SPIO標(biāo)記的ESC移植入正常小鼠左腋皮下，于3-6周后行MRI掃描，在移植部位可見(jiàn)信號(hào)缺失區(qū)（圖2）。 細(xì)胞移植后的小鼠腋下MRI 掃描結(jié)果 圖23 商量 1，魚(yú)精蛋白-SPIO標(biāo)記率單獨(dú)使用SPIO標(biāo)記非吞噬細(xì)胞的效果差，而SPIO和陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染劑(transfection agents，Tas)形成混合物與細(xì)胞共培育可大幅提高細(xì)胞內(nèi)的鐵攝入量3-4。細(xì)胞標(biāo)記效率與細(xì)胞種類、SPIO與轉(zhuǎn)染劑的種類及濃度、共培育時(shí)間等有關(guān)3，因此不同種類細(xì)胞的最佳化標(biāo)記方案需要大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，而每種細(xì)胞對(duì)應(yīng)標(biāo)記策略的平安性檢測(cè)至關(guān)重要。雖然大多數(shù)商量顯示在適當(dāng)劑量?jī)?nèi)SPIO

8、標(biāo)記不會(huì)影響干細(xì)胞的活性、增殖、分化及增加細(xì)胞凋亡3-5，但有商量表明較高濃度的SPIO會(huì)限制干細(xì)胞的增殖5，磁標(biāo)記干細(xì)胞劑量依靠性的向成骨及成軟骨分化減弱亦見(jiàn)報(bào)道5-6。由于細(xì)胞膜及一般未修飾的SPIO都帶負(fù)電荷，細(xì)胞不容易攝取，葡聚糖、去鐵蛋白、羧酸聚酰胺樹(shù)脂等包被材料，以及PLL、磁性脂質(zhì)體、植物血凝素等轉(zhuǎn)染介質(zhì)的應(yīng)用大大增加了其被細(xì)胞吞噬的效率7。對(duì)氧化鐵的修飾不僅要增加氧化鐵同細(xì)胞膜的親和力,還要進(jìn)一步幫助氧化鐵微粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。本次實(shí)驗(yàn)用硫酸魚(yú)精蛋白作為轉(zhuǎn)染介質(zhì)能穿梭于細(xì)胞膜內(nèi)外。Emerit等8商量發(fā)現(xiàn):細(xì)胞內(nèi)非結(jié)合的鐵能使氧化作用加強(qiáng),形成過(guò)多的氧化產(chǎn)物和羥基自由基而損傷細(xì)胞,

9、甚至導(dǎo)致細(xì)胞壞死。然而,目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于鐵濃度對(duì)標(biāo)記細(xì)胞的影響的報(bào)道差異較大,可能是由于所用的氧化鐵微粒不同而引起的細(xì)胞內(nèi)實(shí)際游離鐵的差異、標(biāo)記細(xì)胞的濃度差異以及標(biāo)記時(shí)間長(zhǎng)短不一引起的。但是, 由于細(xì)胞磁標(biāo)記隨著鐵濃度和孵育時(shí)間的增加而增加9 , 且逐漸增加鐵標(biāo)記濃度和延長(zhǎng)標(biāo)記時(shí)間將對(duì)細(xì)胞的活性及增值能力產(chǎn)生負(fù)面影響 10 , 用于磁化標(biāo)記的鐵濃度應(yīng)當(dāng)選擇在滿足要求的較低濃度, 我們提倡在共同孵育24 h情況下, 鐵濃度應(yīng)選擇在2040 Lg/ml。 2.MRI成像隨著分子影像學(xué)的進(jìn)展，活體追蹤干細(xì)胞成為可能。MRI示蹤術(shù)是一種示蹤細(xì)胞遷移的有效方法。然而，常規(guī)MRI無(wú)法顯示移植細(xì)胞和與細(xì)胞

10、作用的靶細(xì)胞或靶器官。而使用超順磁性氧化鐵SPIO作為負(fù)性標(biāo)記物則可以解決此難題。SPIO 在臨床中主要用于肝臟的MRI 負(fù)性增強(qiáng)成像，近年來(lái)進(jìn)展到各種細(xì)胞的成像，如干細(xì)胞11，12。在用于細(xì)胞標(biāo)記時(shí)，標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的SPIO 在磁場(chǎng)中引起局部磁場(chǎng)紊亂，在標(biāo)記了SPIO 的細(xì)胞部位及其周圍肯定空間范圍內(nèi)產(chǎn)生無(wú)信號(hào)或低信號(hào)區(qū)， 從而推斷被標(biāo)記細(xì)胞的位置， 依據(jù)其位置的轉(zhuǎn)變和信號(hào)的衰減還可推斷細(xì)胞的移行、空間分布和增殖情況。細(xì)胞膜與SPIO 顆粒都帶有負(fù)電荷，兩者相互排斥使得氧化鐵顆粒很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，標(biāo)記率低，所以必需對(duì)氧化鐵顆粒進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，轉(zhuǎn)變其粒子的電性。本實(shí)驗(yàn)接受魚(yú)精蛋白包埋SPIO顆粒，使

11、帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜通過(guò)非特異性吸取過(guò)程攝取SPIO 顆粒。結(jié)果顯示魚(yú)精蛋白能使SPIO 高效地標(biāo)記ESC。在顯微鏡下觀察檢測(cè)細(xì)胞漿內(nèi)的鐵顆粒，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記率達(dá)到90。SPIO 對(duì)標(biāo)記細(xì)胞毒性低，細(xì)胞增殖不受影響。與未標(biāo)記細(xì)胞相比，標(biāo)記干細(xì)胞的細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果全都14。表明該方法是一種平安的方法，即使在移植后2周，也能通過(guò)MRI 監(jiān)測(cè)到移植細(xì)胞的存活和分布狀況。MRI因其諸多優(yōu)勢(shì)在移植細(xì)胞定位、生存及遷移監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域成為商量熱點(diǎn)， 超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)是干細(xì)胞MR示蹤中應(yīng)用最廣泛的對(duì)比劑15。 SPIO標(biāo)記干細(xì)胞的M

12、R成像 目前多數(shù)干細(xì)胞商量接受組織學(xué)分析來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞定位、存活數(shù)量、移植細(xì)胞的分化等。但組織學(xué)是有創(chuàng)檢查，而且不能代表全部移植細(xì)胞的體內(nèi)生存情況及其動(dòng)態(tài)遷移3。干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用及相關(guān)科學(xué)商量需要合適的影像學(xué)方法對(duì)移植細(xì)胞在活體進(jìn)行連續(xù)、無(wú)創(chuàng)的示蹤觀察16活體示蹤移植干細(xì)胞的生存狀態(tài)及遷移對(duì)闡明治療效果的潛在機(jī)制及臨床應(yīng)用的實(shí)施有極其重要的作用。MR有良好的軟組織準(zhǔn)時(shí)間分辨率，無(wú)電離輻射，可以在示蹤干細(xì)胞的同時(shí)評(píng)價(jià)干細(xì)胞移植的治療效果，MR透視引導(dǎo)下精確移植定位的商量已見(jiàn)報(bào)道17。MRI因其諸多優(yōu)勢(shì)在活體干細(xì)胞監(jiān)測(cè)領(lǐng)域成為商量熱點(diǎn)。SPIO 對(duì)標(biāo)記細(xì)胞毒性低，細(xì)胞增殖不受影響。與未標(biāo)記細(xì)胞相比

13、， 標(biāo)記干細(xì)胞的細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果全都18。參考文獻(xiàn)1 沈干，從笑倩，汪錚，吳春芳，曹誼林 小鼠胚胎干細(xì)胞建系及GFP標(biāo)記東南高校學(xué)報(bào).2003,Mar; 22( 2) : 71O74, 88 2 M atuszew sk iL, Tom bach B, H eindelW, et al. M olecular and param e-tric im aging w ith iron oxides J . Rad iologe, 2007, 47( 1) : 34- 42.3 Frank JA, Miller BR, Arbab AS,et al. Clinically

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