常用培養(yǎng)基的制備技術(shù)及應(yīng)用

1、實(shí)驗(yàn)一 常用培養(yǎng)基的制備技術(shù)及應(yīng)用 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?1掌握培養(yǎng)基的概念和分類。2掌握常用培養(yǎng)基制備的一般程序。3熟悉常用培養(yǎng)基的制備技術(shù)和用途。二 實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基（culture medium）是根據(jù)微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的一定比例的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（碳源、氮源等）、氫離子濃度（pH值）以及滲透壓等條件，用人工方法制成的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。主要用于微生物分離培養(yǎng)、生化鑒定和保存菌種等。培養(yǎng)基按物理性狀不同可分為固體、半固體和液體培養(yǎng)基；按性質(zhì)和用途不同又可細(xì)分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和特殊培養(yǎng)基。根據(jù)物理性狀和用途等不同常將培養(yǎng)基分裝于試管或平皿等容器中。常用培養(yǎng)基制備的一般程序是：

2、調(diào)配成分_溶解_較正pH值_過(guò)濾_分裝_滅菌_質(zhì)量檢驗(yàn)_保存。配制培養(yǎng)基時(shí)可以按照培養(yǎng)基配方調(diào)配各種基本成分，也可購(gòu)買(mǎi)半成品的商品培養(yǎng)基干粉制劑直接配制。三 器材與試劑試劑普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂干粉、脫纖維羊血、半固體培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基干粉、克氏雙糖鐵培養(yǎng)基干粉、1 mol/L NaOH溶液、麥康凱培養(yǎng)基成分（蛋白胨、氯化鈉、膽鹽、乳糖、5 g/L中性紅水溶液、瓊脂粉）、蒸餾水。器材小型藥物天平、藥匙、稱量紙、三角燒瓶、量筒、吸管、精密pH值試紙?jiān)嚬?、硅膠塞、牛皮紙（或報(bào)紙）、棉線、玻璃棒、玻璃紙、無(wú)菌平皿、高壓蒸汽滅菌鍋、微波爐等。四 步驟與方法常用培養(yǎng)基制備的一般程序及方法）調(diào)配成分根據(jù)培養(yǎng)基配方或

3、用法，準(zhǔn)確計(jì)算、稱量所需培養(yǎng)基各基本成分或干粉制劑，裝于三角燒瓶中，加入定量蒸餾水充分混合。）溶解將盛有混合物的三角燒瓶置于沸水浴或流動(dòng)蒸汽滅菌器中加熱溶解，呈半透明狀。）校正pH值即將培養(yǎng)基pH值校正到適合細(xì)菌生長(zhǎng)的最適pH值，一般病原菌的最適pH值為7.27.6。校正培養(yǎng)基pH值的常用試劑有1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L NaCO3溶液和1 mol/L HCl溶液（注意：培養(yǎng)基高壓滅菌后， 用NaOH和HCl校正的pH值會(huì)下降0.10.2，而用NaCO3溶液校正的pH值會(huì)上升0.10.2）；校正培養(yǎng)基pH值的方法常用精密pH值試紙法、比色法和電子pH計(jì)法等。）過(guò)濾培養(yǎng)基中若存

4、在雜質(zhì)或沉淀物時(shí)則需要過(guò)濾澄清。液體培養(yǎng)基用濾紙趁熱過(guò)濾，固體培養(yǎng)基用雙層紗布夾脫脂棉趁熱過(guò)濾。）分裝（）液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基滅菌前分裝于潔凈試管中，分裝到試管的下1/41/3處，加塞，510支試管用牛皮紙蓋帽，棉線扎捆，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、制作日期。滅菌后直立放置。（）固體斜面培養(yǎng)基滅菌前分裝于潔凈試管中，分裝到試管的下1/31/2處，加塞，510支試管用牛皮紙蓋帽，棉線扎捆，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、制作日期。滅菌后趁熱擺成斜面，斜面長(zhǎng)度為試管長(zhǎng)度的2/3，并保持斜面下端距離管底有1 cm以上柱高，同時(shí)斜面上端距離試管塞1 cm以上。（）瓊脂高層培養(yǎng)基滅菌前分裝于潔凈試管中，分裝到試管的下2/3處，

5、加塞，510支試管用牛皮紙蓋帽，棉線扎捆，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、制作日期。滅菌后直立放置。（）固體平板培養(yǎng)基將培養(yǎng)基分裝于三角燒瓶（培養(yǎng)基的量要小于三角燒瓶最大容量），先用玻璃紙或棉塞封口，再用牛皮紙蓋帽、棉線扎口。滅菌后將培養(yǎng)基冷卻至50 左右，以無(wú)菌操作，傾注于平皿內(nèi)（內(nèi)徑為9 cm的平皿傾注1520 mL培養(yǎng)基），馬上水平旋轉(zhuǎn)12周，使培養(yǎng)基均勻平鋪于皿底。待培養(yǎng)基凝固后，在皿底面上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、制作日期，底上蓋下倒置保存。 ）滅菌根據(jù)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耐熱性的不同分別采取相應(yīng)的物理滅菌法（）培養(yǎng)基成分均耐高熱時(shí)常用高壓蒸汽滅菌法，這也是最常用、最可靠的培養(yǎng)基滅菌方法。常用滅菌條件為103.4

6、3 kPa（121.3 ） 1520 min；含糖培養(yǎng)基用68.95 kPa（115.6 ） 1015 min，以免破壞糖類物質(zhì)。（）培養(yǎng)基中含有不耐高熱營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如糖類、明膠和牛乳等）時(shí)，常用流通蒸汽滅菌法，方法是80100 加溫30 min，每天1 次，連續(xù)3 d。（）培養(yǎng)基中富含蛋白質(zhì)（如血清或雞蛋清）時(shí)需用血清凝固器滅菌，方法是將需滅菌的培養(yǎng)基擺放在血清凝固器內(nèi)（一般做成斜面），第一天75 加熱30 min，第二天80 加熱30 min，第三天85 加熱30 min，在3 次滅菌間隙將培養(yǎng)基取出，置35 恒溫箱中過(guò)夜。（）對(duì)液態(tài)高營(yíng)養(yǎng)的不耐熱培養(yǎng)基，如血清、細(xì)胞培養(yǎng)液等，可采用濾過(guò)除菌

7、。）質(zhì)量檢驗(yàn)制備好的培養(yǎng)基須經(jīng)性狀檢查、無(wú)菌檢驗(yàn)和效果檢驗(yàn)均合格才可使用。（）性狀檢查液體培養(yǎng)基應(yīng)外觀清澈透明；半固體培養(yǎng)基應(yīng)質(zhì)地均勻，呈半固態(tài)；固體斜面培養(yǎng)基應(yīng)質(zhì)地均勻，凝固后斜面穩(wěn)定，不下滑；平板培養(yǎng)基應(yīng)質(zhì)地均勻，表面光滑、平整，薄厚適宜。（）無(wú)菌檢驗(yàn)將制備好的培養(yǎng)基置于35 培養(yǎng)24 h，以無(wú)任何細(xì)菌生長(zhǎng)為合格。（）效果檢驗(yàn)將已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于待檢培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后檢查標(biāo)準(zhǔn)菌的生長(zhǎng)繁殖狀況和生化反應(yīng)是否與預(yù)期的結(jié)果符合。）保存制備好且標(biāo)記清楚的培養(yǎng)基置于4 冰箱保存?zhèn)溆?，?yán)格滅菌后的培養(yǎng)基一般可保存1 周以上，但不宜過(guò)久。注意平板培養(yǎng)基應(yīng)底上蓋下倒置保存，以防止蓋內(nèi)水蒸汽落在培養(yǎng)基表面

8、，使得培養(yǎng)基表面粘滯易污染且不易接種；液體、半固體等培養(yǎng)基應(yīng)直立保存。常用培養(yǎng)基的制備技術(shù)）營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基用量筒準(zhǔn)確量取所需蒸餾水，先倒入三角燒瓶一部分，隨后按照營(yíng)養(yǎng)肉湯成分配方（蛋白胨 10 g，牛肉浸出粉 3 g，氯化鈉 5 g，蒸餾水1000 mL見(jiàn)附錄一）或干粉制劑說(shuō)明書(shū)用法準(zhǔn)確計(jì)算、稱量所需粉劑，置于已經(jīng)盛有部分蒸餾水的三角燒瓶中，最后將量筒內(nèi)剩余蒸餾水全部倒入三角燒瓶，充分混勻、加熱溶解后，用1 mol/L NaOH校正pH值到7.57.6（高壓后可降到培養(yǎng)基要求的7.4），分裝于試管中，加塞扎捆標(biāo)記后高壓蒸汽121 滅菌20 min。取出后直立放置，待冷卻后置于4 保存?zhèn)溆??？捎?/p>

9、于一般細(xì)菌的增菌培養(yǎng)。）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用量筒準(zhǔn)確量取所需蒸餾水，先倒入三角燒瓶一部分，之后按照營(yíng)養(yǎng)瓊脂成分配方（蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL見(jiàn)附錄一）或干粉制劑說(shuō)明書(shū)用法準(zhǔn)確計(jì)算、稱量所需粉劑，置于已經(jīng)盛有部分蒸餾水的三角燒瓶中，最后將量筒內(nèi)剩余蒸餾水全部倒入三角燒瓶，充分混勻、加熱煮沸溶解后呈半透明狀，校正pH值到7.27.4。若制作固體斜面則先分裝于試管中，加塞扎捆標(biāo)記后高壓蒸汽121 滅菌20 min，高壓后趁熱擺成斜面，凝固后置于4 保存，可用于一般細(xì)菌菌種的傳代保存；若制作固體平板，則直接封裝在三角燒瓶中，高壓蒸汽121 滅菌20

10、min，滅菌后以無(wú)菌操作傾注平板，待凝固后標(biāo)記、倒置于4 保存，可用于對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高細(xì)菌的分離培養(yǎng)和純化。）半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：配方見(jiàn)附錄一是蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉5 g，蒸餾水1000 mL，pH為7.4，具體做法同肉湯培養(yǎng)基?？捎糜谟^察細(xì)菌的動(dòng)力和保存菌種。）血瓊脂平板將滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂冷卻到50 左右，以無(wú)菌操作加入10%的無(wú)菌脫纖維羊血（或兔血），立即混勻，避免產(chǎn)生氣泡，然后以無(wú)菌操作分裝于無(wú)菌試管或平皿，制成血瓊脂斜面或血瓊脂平板。血瓊脂斜面可用于保存營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌；血瓊脂平板可用分離培養(yǎng)細(xì)菌和檢測(cè)其溶血性。）巧克力瓊脂平板是基于血瓊脂平板制備基礎(chǔ)之上

11、，特點(diǎn)在于滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂冷卻到7080 時(shí)加入無(wú)菌脫纖維血液，且在80 水浴中搖勻1520 min，使血液的色澤由鮮紅轉(zhuǎn)變?yōu)榍煽肆ι?，然后冷?0 左右，以無(wú)菌操作傾注平板即制成巧克力瓊脂平板?？捎糜诜蛛x培養(yǎng)奈瑟菌屬、流感嗜血桿菌屬等對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌。）麥康凱瓊脂平板按照配方基本成分（蛋白胨20 g，NaCl 5 g，膽鹽5 g，乳糖10 g，5 g/L中性紅水溶液5 mL，瓊脂20 g，蒸餾水 1000 mL見(jiàn)附錄一）自行配制時(shí)，先將除乳糖、中性紅之外的成分混合加熱溶解，調(diào)pH7.2之后，再加入乳糖、中性紅，混勻后高壓滅菌115 15 min，取出冷卻至50 左右，以無(wú)菌操作傾注平板，凝固后標(biāo)記、倒置于4 保存，可用于腸桿菌科細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定。五 注意事項(xiàng)要防止加熱溶解時(shí)培養(yǎng)基粘瓶底燒結(jié)，可先在三角燒瓶底部加入部分量好的蒸餾水，再加入稱量好的固體成分，最后將量筒內(nèi)剩余的蒸餾水全部倒入三角燒瓶。制備培養(yǎng)基最好用玻璃器皿（燒瓶、燒杯）。若制備大量培養(yǎng)基時(shí)可用鋁鍋或搪瓷桶，但不能用鐵、銅器皿，因?yàn)殍F離子進(jìn)入培養(yǎng)基，達(dá)到一定濃度會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，而銅離子會(huì)抑制細(xì)菌毒素產(chǎn)生。在按照配方自行配制培養(yǎng)基時(shí)，