2014年實(shí)驗(yàn)六食品中大腸菌群的檢驗(yàn)

1、食品中大腸菌群的檢驗(yàn)1. 食品微生物檢驗(yàn)的意義l有害微生物對(duì)人類(lèi)和生產(chǎn)的影響：引起食品變質(zhì)引起食物中毒導(dǎo)致人體患病1. 食品微生物檢驗(yàn)的意義l是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo),也是判定被檢食品能否食用的科學(xué)依據(jù)l可以判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生的情況,為衛(wèi)生管理工作提供科學(xué)依據(jù)l可以有效地防止或減少食物中毒和人畜共患病的發(fā)生l保證產(chǎn)品的質(zhì)量,避免不 必要的損失2. 食品微生物檢驗(yàn)的范圍3. 食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的微生物指標(biāo)l指示菌概念:在常規(guī)安全衛(wèi)生監(jiān)測(cè)中，用以指示檢樣衛(wèi)生狀況及安全性的指示性微生物類(lèi)型：一般性、特定性（如糞便污染）、其他項(xiàng)目：菌落總數(shù) 、大腸菌群、耐熱大腸菌群、總大腸菌群一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?/p>

2、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膌1. 1. 了解大腸菌群在食品檢驗(yàn)中的意義。了解大腸菌群在食品檢驗(yàn)中的意義。l2. 2. 掌握檢驗(yàn)的程序和步驟。掌握檢驗(yàn)的程序和步驟。l3. 3. 通過(guò)通過(guò)MPNMPN檢索表的檢索得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢索表的檢索得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。二、基本原理二、基本原理l大腸菌群系指一群在大腸菌群系指一群在32323737下下24h24h內(nèi)，能內(nèi)，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌群主要來(lái)源于人蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌群主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)糞便污染指標(biāo)，來(lái)評(píng)價(jià)，來(lái)評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量狀況，食品衛(wèi)生質(zhì)量狀況，

3、推斷食品中腸道致病菌推斷食品中腸道致病菌污染的可能污染的可能。具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。產(chǎn)氣產(chǎn)氣克雷白氏菌克雷白氏菌ETEC EIEC 陰溝腸陰溝腸桿菌桿菌EHEC 產(chǎn)氣產(chǎn)氣克雷白氏菌克雷白氏菌大大腸腸埃希氏菌埃希氏菌檸檬檸檬酸桿菌酸桿菌O157：H7 大腸菌群的食品衛(wèi)生學(xué)意義大腸菌群的食品衛(wèi)生學(xué)意義l作為糞便污染食品的指標(biāo)菌，MPN值愈低則說(shuō)明食品受糞便污染程度及對(duì)人體健康危害程度愈低l作為腸道致病菌污染食品的指針，大腸菌群數(shù)量越多則腸道致病菌存在的可能性就越高，但兩者之間并不總是呈平行關(guān)系l要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量GB 4789.3

4、-2010 GB 4789.3-2010 大腸菌群計(jì)數(shù)大腸菌群計(jì)數(shù)第一法：大腸菌群第一法：大腸菌群MPNMPN計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)法第二法：大腸菌群平板計(jì)數(shù)法第二法：大腸菌群平板計(jì)數(shù)法三、檢測(cè)方法三、檢測(cè)方法l 最近似數(shù)測(cè)定法（最近似數(shù)測(cè)定法（MPN）是指對(duì)未知樣品做）是指對(duì)未知樣品做連續(xù)的連續(xù)的1010倍稀釋，選擇倍稀釋，選擇3 3個(gè)連續(xù)的個(gè)連續(xù)的1010倍稀釋液，每倍稀釋液，每種稀釋液接種種稀釋液接種3 3管裝有培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，根據(jù)管裝有培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，根據(jù)LSTLST初發(fā)酵試驗(yàn)以及初發(fā)酵試驗(yàn)以及BGLBBGLB發(fā)酵證實(shí)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)大腸發(fā)酵證實(shí)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)大腸菌群的陽(yáng)性管數(shù)，查菌群的陽(yáng)性管數(shù)，查

5、MPNMPN檢索表，檢索表，報(bào)告每報(bào)告每g g（mLmL）樣品中大腸菌群的最可能數(shù)。樣品中大腸菌群的最可能數(shù)。l 食品中大腸菌群數(shù)以每食品中大腸菌群數(shù)以每g g（mLmL）樣品中大腸菌）樣品中大腸菌群的最可能數(shù)來(lái)表示，即為大腸菌群群的最可能數(shù)來(lái)表示，即為大腸菌群MPNMPN值。值。 需要用到的培養(yǎng)基需要用到的培養(yǎng)基（1 1）LSTLST肉湯培養(yǎng)基：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨成分：成分：胰蛋白胨或胰酪胨（胰蛋白胨或胰酪胨（TryticaseTryticase）20g20g，NaCL NaCL 5.0g5.0g，乳糖，乳糖5.0g5.0g，K K2 2HPOHPO4 4

6、2.75g 2.75g，KHKH2 2POPO4 4 2.75g 2.75g，月桂基硫酸鈉月桂基硫酸鈉0.1g0.1g，蒸餾水，蒸餾水1000mL1000mL。 制法：制法：將各成分溶解于蒸餾水中。分裝到有倒立發(fā)將各成分溶解于蒸餾水中。分裝到有倒立發(fā)酵管的酵管的20mm20mm150mm150mm試管中，每管試管中，每管10mL10mL。121121高高壓滅菌壓滅菌15min15min。最終。最終pH6.8pH6.80.20.2。（2 2）BGLBBGLB：煌綠乳糖膽鹽肉湯：煌綠乳糖膽鹽肉湯成分：成分：蛋白胨蛋白胨10.0g10.0g，乳糖，乳糖10.0g10.0g，牛膽粉溶液，牛膽粉溶液20

7、0mL200mL，0.1%0.1%煌綠水溶液煌綠水溶液13.3mL13.3mL，蒸餾水，蒸餾水800mL800mL，pH7.2pH7.20.10.1。l3 3個(gè)三角瓶（個(gè)三角瓶（含玻珠含玻珠）中，）中，225ml/225ml/個(gè)個(gè)l9 9支試管，支試管，3 3支支/ /組，組，9ml/9ml/支支抑菌劑的選擇抑菌劑的選擇l大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基膽鹽、十二烷基硫酸鈉硫酸鈉、洗衣粉、洗衣粉、煌綠煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。、龍膽紫、孔雀綠等。l抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭革蘭氏陽(yáng)性菌氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。國(guó)家

8、標(biāo)準(zhǔn)中的生長(zhǎng)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中LSTLST肉湯利用肉湯利用十二烷十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLBBGLB肉湯利用煌綠和膽鹽肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑作為抑菌劑。l抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細(xì)菌的生長(zhǎng)和挑選，但對(duì)大腸菌群中的某腸菌群細(xì)菌的生長(zhǎng)和挑選，但對(duì)大腸菌群中的某些菌株有時(shí)也產(chǎn)生一些抑制作用。些菌株有時(shí)也產(chǎn)生一些抑制作用。 實(shí)驗(yàn)步驟及操作要點(diǎn)：1）無(wú)菌取樣并制作梯度稀釋液；梯度稀釋法依次稀釋樣品無(wú)菌取樣并制作梯度稀釋液；梯度稀釋法依次稀釋樣品到到10-42）樣品勻液的）樣品勻液的pH 值應(yīng)在值應(yīng)在6.57.5

9、之間，必要時(shí)分別用之間，必要時(shí)分別用1 mol/L NaOH 或或1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)。3）從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過(guò)程不得超過(guò)）從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過(guò)程不得超過(guò)15 min。10-210-310-40將產(chǎn)氣的試管內(nèi)將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到樣品接種到BGLB肉湯肉湯LST不產(chǎn)氣（不產(chǎn)氣（-）小導(dǎo)管里無(wú)氣泡小導(dǎo)管里無(wú)氣泡LST產(chǎn)氣（產(chǎn)氣（+）l4）初發(fā)酵試驗(yàn)）初發(fā)酵試驗(yàn) 選擇選擇1010-2-2、1010-3-3、1010-4-4三個(gè)稀釋度的樣品均液三個(gè)稀釋度的樣品均液 （液體樣品可以選擇原液），（液體樣品可以選擇原液）， 用無(wú)菌移液管分別用無(wú)菌移液管分別吸取吸

10、取1mL1mL到到LSTLST發(fā)酵液試管中，發(fā)酵液試管中，每管接種每管接種1mL， 每個(gè)稀釋度做每個(gè)稀釋度做3 3個(gè)平行（共個(gè)平行（共9 9管）管）, ,361 培養(yǎng)培養(yǎng)24 h2 h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24 h2 h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至培養(yǎng)至48 h2 h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。氣者為大腸菌群陰性。LST結(jié)果判斷結(jié)果判斷l(xiāng)大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如滿氣

11、體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管。用手輕輕打動(dòng)試管。5）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 用接種環(huán)從產(chǎn)氣的用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培肉湯管中分別取培養(yǎng)物養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，管中，36 1培養(yǎng)培養(yǎng)48 h2 h，觀察產(chǎn)氣，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。6）大腸菌群最可能數(shù)（）大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告）的報(bào)告 按按5）確證的大腸菌群）確證的大腸菌群LST陽(yáng)性管數(shù)，檢陽(yáng)性管數(shù)，檢索索MPN表（見(jiàn)附錄表（見(jiàn)附錄B），報(bào)告），報(bào)告每每g（mL）樣品中大腸菌群的樣品中大腸菌群的MPN值。值。陽(yáng)性管數(shù)0.100.010.001LST發(fā)酵管BGLB證實(shí)管表表B.1 大腸菌群最可能數(shù)