2022年多能干細(xì)胞定向分化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

1、工程名稱：多能干細(xì)胞定向分化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)首席科學(xué)家：沈曉驊 清華大學(xué)起止年限：2021.1至2021.8依托部門：教育部一、關(guān)鍵科學(xué)問題及研究?jī)?nèi)容、擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題干細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育伴隨著表觀遺傳狀態(tài)、染色質(zhì)構(gòu)造和基因表達(dá)的改變。多能干細(xì)胞包括ESCs和iPSCs代表哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一種最初狀態(tài) (ground state)，被看作是了解分化過程的起點(diǎn)和關(guān)鍵。因此，對(duì)多能干細(xì)胞定向分化和其中的分子及表觀遺傳學(xué)調(diào)控的研究是生命科學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的核心。本工程要探索的最終科學(xué)問題是：表觀遺傳機(jī)理如何控制多能干細(xì)胞的定向分化？表觀遺傳機(jī)制逐步限制細(xì)胞分化和發(fā)育的潛能。多能性干細(xì)胞在分化過

2、程中必須經(jīng)歷一系列表觀遺傳狀態(tài)的改變和中間狀態(tài)直至譜系確立。在此過程中，表觀遺傳圖譜是如何建立的？換而言之，組織特異性的信號(hào)因子、轉(zhuǎn)錄因子和RNA分子是如何作用于表觀遺傳酶機(jī)器，引導(dǎo)其建立細(xì)胞類型特異性的表觀遺傳修飾圖譜？一旦圖譜建立，細(xì)胞特有的表觀遺傳修飾圖譜是如何解讀的？即細(xì)胞特有的表觀遺傳修飾圖譜是如何決定基因表達(dá)和細(xì)胞譜系命運(yùn)的？多能性干細(xì)胞受內(nèi)、外信號(hào)的影響而選擇不同命運(yùn)。那么，多能干細(xì)胞在分化成不同組織類型的細(xì)胞過程中，表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有何異同？另外，細(xì)胞培養(yǎng)并不能完全反映個(gè)體發(fā)育的規(guī)律。那么，同組織類型的細(xì)胞在體外分化和體內(nèi)個(gè)體發(fā)育過程中的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有何異同？雖然小鼠是研究

3、干細(xì)胞分化和哺乳動(dòng)物發(fā)育極佳的模式動(dòng)物，但是干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用需要對(duì)人類的組織細(xì)胞分化有很好的認(rèn)識(shí)。那么，從進(jìn)化角度來看，表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在人和小鼠等物種間有何異同性？如何指導(dǎo)人類多能干細(xì)胞在體外高效定向分化為近似于體內(nèi)發(fā)育的各種功能細(xì)胞，并促進(jìn)它們的功能成熟及提高修復(fù)損傷器官的能力？尋找這些關(guān)鍵科學(xué)問題的答案，將加深對(duì)干細(xì)胞定向分化和生命個(gè)體發(fā)育調(diào)控規(guī)律的認(rèn)識(shí)，為建立能應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的定向分化技術(shù)體系奠定根底。、主要研究?jī)?nèi)容圍繞以上科學(xué)問題，我們以表觀遺傳學(xué)調(diào)控為中心，綜合運(yùn)用遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、蛋白組學(xué)及基因組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，對(duì)體外和體內(nèi)干細(xì)胞分化過程展開系統(tǒng)、深入的分

4、析。首先，以多能干細(xì)胞向包括神經(jīng)外胚層、心血管中胚層等體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的分化為模型，在已建立的分化體系的根底上，利用報(bào)告基因別離出高純度的各分化組織細(xì)胞系。在以上不同的分化過程中，構(gòu)建以表觀遺傳因子為中心的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析單細(xì)胞及多細(xì)胞的全基因組表達(dá)譜和表觀遺傳修飾譜，研究信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA和表觀遺傳因子之間的相互作用，以及這些互作對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)的影響。這些以表觀遺傳因子為中心的蛋白-RNA-DNA相互關(guān)聯(lián)的機(jī)制及其對(duì)全基因組轉(zhuǎn)錄譜的影響作用，我們通稱之為表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們將不僅從宏觀系統(tǒng)水平上認(rèn)識(shí)分化過程中的表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，而且從分子水平上深入研究幾個(gè)

5、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳學(xué)酶機(jī)器、microRNA和長(zhǎng)鏈ncRNA對(duì)以上分化過程的影響。通過對(duì)不同分化系統(tǒng)的比擬，了解不同組織器官的細(xì)胞譜系是如何被確立的，尋找影響定向分化的共通的和特異的調(diào)控機(jī)制。利用報(bào)告基因、基因敲入和敲除的小鼠模型，研究表觀遺傳調(diào)控在體內(nèi)組織發(fā)育中的作用。通過從分化組織細(xì)胞類型、動(dòng)物體內(nèi)外和物種進(jìn)化三個(gè)維度上比擬表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異同，鑒定出影響多能干細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制和調(diào)控分子。最后研究如何操控以上關(guān)鍵調(diào)控因素，獲得高效、平安地誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為神經(jīng)、心血管和生殖細(xì)胞的新手段，為實(shí)際應(yīng)用奠定根底。二、預(yù)期目標(biāo)、總體目標(biāo)本工程將建立一支高學(xué)術(shù)水平的研究團(tuán)隊(duì)，充分利

6、用人和小鼠在體內(nèi)和體外研究系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)和互補(bǔ)性，重點(diǎn)研究多能干細(xì)胞向三種不同模式細(xì)胞分化的以表觀遺傳調(diào)控為中心的分子機(jī)制。在多細(xì)胞或單細(xì)胞水平上，解析多能干細(xì)胞向三種不同模式細(xì)胞分化的、細(xì)胞特有的調(diào)控因子與表觀遺傳因子間相互作用的圖譜，解析全基因組表達(dá)譜和表觀遺傳修飾譜，構(gòu)建以調(diào)控因子與表觀遺傳因子的互作為中心的、關(guān)聯(lián)表觀遺傳修飾和基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，找到控制不同分化方向的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的共通點(diǎn)和特異性，全面系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)表觀遺傳調(diào)控對(duì)多能干細(xì)胞在體內(nèi)、外及不同譜系分化、發(fā)育中的作用。篩選調(diào)控上述分化過程的關(guān)鍵調(diào)控因子包括表觀遺傳因子、非編碼RNA、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)分子；通過綜合調(diào)控假設(shè)干關(guān)鍵因子來

7、優(yōu)化各分化體系，為人工操控干細(xì)胞命運(yùn)，建立高效、平安的定向分化手段提供線索，為干細(xì)胞療法的臨床實(shí)現(xiàn)提供理論和應(yīng)用根底。在相關(guān)領(lǐng)域取得一些理論、方法和技術(shù)突破，力爭(zhēng)取得具有國際影響的原創(chuàng)性成果；培養(yǎng)高水平研究人才，形成能夠持續(xù)進(jìn)展創(chuàng)新性研究的能力；提升我國干細(xì)胞根底研究水平和國際影響力，促進(jìn)我國干細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)學(xué)科的開展。、五年具體目標(biāo) 建立人和小鼠多能干細(xì)胞 (ESCs / iPSCs)向神經(jīng)外胚層、心血管中胚層和生殖細(xì)胞的分化和純化體系。構(gòu)建假設(shè)干基因敲入knockin) 和報(bào)告基因的小鼠模型，為研究在動(dòng)物體內(nèi)表觀遺傳機(jī)制對(duì)胚胎發(fā)育、器官形成的調(diào)控提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。繪制并比擬體內(nèi)外各模式細(xì)胞的

8、全基因組表達(dá)圖譜包括蛋白編碼基因、microRNA和長(zhǎng)鏈ncRNA和表觀遺傳修飾圖譜。建立關(guān)聯(lián)蛋白、DNA和RNA 的三維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并解析細(xì)胞特異的調(diào)控因子包括蛋白、長(zhǎng)鏈ncRNA和microRNA與表觀遺傳機(jī)制的相互作用。構(gòu)建、整合及比擬不同分化方向及狀態(tài)的細(xì)胞的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，全面、動(dòng)態(tài)地認(rèn)識(shí)細(xì)胞命運(yùn)決定和細(xì)胞譜系的特異性與穩(wěn)定性維護(hù)的分子機(jī)制。找到影響干細(xì)胞分化和命運(yùn)決定的假設(shè)干關(guān)鍵調(diào)控因子蛋白、microRNA或長(zhǎng)鏈ncRNA)；實(shí)現(xiàn)向多巴胺能神經(jīng)元、脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、心肌、血管等組織和生殖細(xì)胞的高效定向分化。 預(yù)期在國際主流期刊上影響因子IF>5發(fā)表論文3050篇，力爭(zhēng)在國際頂

9、尖學(xué)術(shù)期刊上包括Cell、Nature和Science等發(fā)表論文 36篇。建立和培養(yǎng)一支具有國際影響力的高水平的干細(xì)胞研究梯隊(duì)，爭(zhēng)取培養(yǎng)國家出色青年基金獲得者35名，并申報(bào)專利35項(xiàng)。三、研究方案、總體學(xué)術(shù)思路本工程將以人和小鼠多能干細(xì)胞及小鼠體內(nèi)干細(xì)胞為模型，來探討生物發(fā)育和細(xì)胞分化的內(nèi)在規(guī)律，并利用這些規(guī)律建立高效、平安的干細(xì)胞定向分化體系如圖1。圖1、總體學(xué)術(shù)思路我們將對(duì)多能干細(xì)胞分化成的三種模式細(xì)胞譜系進(jìn)展研究，包括神經(jīng)外胚層和心血管中胚層在內(nèi)的兩類體細(xì)胞以及生殖細(xì)胞。利用并優(yōu)化現(xiàn)有的分化手段來建立分化的模式細(xì)胞系，研究和比擬它們?cè)谖捶只胺只癄顟B(tài)下的信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和染色質(zhì)水平

10、上的調(diào)控，建立以表觀遺傳調(diào)控為中心的涉及蛋白、DNA和RNA 相互作用及轉(zhuǎn)錄表達(dá)的四維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通稱為表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，我們將建立報(bào)告基因與基因敲入、敲除的小鼠品系，通過別離體內(nèi)干細(xì)胞, 從個(gè)體發(fā)育的角度深入研究以表觀遺傳調(diào)控為中心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)如何控制動(dòng)物體內(nèi)的神經(jīng)、心血管和生殖系統(tǒng)細(xì)胞的形成。比擬不同分化系統(tǒng)和體內(nèi)、外發(fā)育模型的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，找到控制多能干細(xì)胞向不同方向分化的機(jī)制的共通點(diǎn)和特異性。不僅要找到更多控制細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因子，包括轉(zhuǎn)錄因子、microRNA、ncRNA和表觀遺傳因子, 并且全面綜合地認(rèn)識(shí)它們?nèi)绾巫饔糜诒碛^遺傳學(xué)修飾機(jī)制，影響轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終決定細(xì)胞譜系及功能。通過

11、比擬人與小鼠同類細(xì)胞分化過程中的調(diào)控機(jī)制的異同, 從進(jìn)化的角度理解這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的演變。本工程的立項(xiàng)將為我們?nèi)斯げ倏丶?xì)胞命運(yùn)提供新的線索和理論依據(jù)，并將最終促進(jìn)細(xì)胞療法的臨床運(yùn)用。、技術(shù)途徑我們將利用最前沿的技術(shù)平臺(tái)，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及系統(tǒng)生物學(xué)方法，全面系統(tǒng)及深入地認(rèn)識(shí)控制多能干細(xì)胞向不同方向分化的分子及表觀遺傳機(jī)制。依據(jù)體內(nèi)組織器官發(fā)生的規(guī)律，我們將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為神經(jīng)、心血管和生殖細(xì)胞，通過組織特異性熒光蛋白報(bào)告細(xì)胞系及外表抗原，別離純化各分化階段的神經(jīng)、心血管和生殖細(xì)胞，初步建立一個(gè)穩(wěn)定的高效誘導(dǎo)分化方案，為研究分子機(jī)制提供細(xì)胞根底。PRC

12、2主導(dǎo)的H3K27的三甲基化H3K27me3代表一類重要的表觀遺傳抑制機(jī)制。它們調(diào)控幾乎所有與干細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的發(fā)育過程，包括神經(jīng)、心血管及生殖器官的形成，對(duì)ESCs的分化起不可缺少的作用。因此，我們將以PRC2為中心，研究表觀遺傳學(xué)調(diào)控在多能干細(xì)胞定向分化和胚胎發(fā)育中的作用。我們將用一種新的手段，利用生物素biotin和FLAG雙標(biāo)計(jì)內(nèi)、外源的PRC2, 來對(duì)PRC2復(fù)合物進(jìn)展蛋白質(zhì)組學(xué)tandem protein complex purification coupled with mass spec microsequencing、基因組學(xué) (RNA-seq、ChIP-seq和RIP-

13、seq)、分子及細(xì)胞、生物化學(xué)的分析。我們首先利用人和小鼠ESCs的分化模型，研究PRC2在神經(jīng)、心血管和生殖系統(tǒng)中如何與蛋白、RNA和DNA結(jié)合和相互作用。在利用體外細(xì)胞培養(yǎng)的同時(shí)，我們將建立基因敲入的knock-in小鼠品系，表達(dá)受內(nèi)源啟動(dòng)子控制的生物素 (biotin) 和FLAG雙標(biāo)計(jì)的PRC2蛋白, 為研究動(dòng)物體內(nèi)胚胎發(fā)育、器官形成的分子機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。此外，利用我們?cè)谛∈驪RC2表觀遺傳學(xué)和microRNA系統(tǒng)方面的優(yōu)勢(shì)，我們將建立一系列轉(zhuǎn)基因小鼠品系，使它們既有神經(jīng)、心血管或生殖細(xì)胞特異性熒光蛋白報(bào)告體系，也同時(shí)表達(dá)帶標(biāo)記的PRC2組分或條件性microRNA全敲除系統(tǒng)，研究表

14、觀遺傳調(diào)控和microRNA在體內(nèi)發(fā)育中的作用。對(duì)以上體外、體內(nèi)不同分化模型及小鼠早期胚胎發(fā)育，利用單、多細(xì)胞microRNA和轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)single-cell RNA-seq，全面分析多能干細(xì)胞在體內(nèi)、外定向分化過程中全基因組水平的蛋白編碼基因、ncRNA和microRNA的表達(dá)。利用ChIP-Seq技術(shù)分析重要表觀遺傳修飾譜包括H3K27me3。此外，我們將對(duì)幾個(gè)在神經(jīng)、生殖系統(tǒng)特異表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白包括Musahi、HuD、FMRP、PELOTA、DAZL和VASA等進(jìn)展RNA免疫共沉淀和高通量測(cè)序分析RIP-seq，來篩選調(diào)控神經(jīng)、生殖系統(tǒng)分化的重要ncRNA, 說明它們的生理功

15、能。通過分析不同分化階段各類細(xì)胞的mRNA、microRNA和ncRNA表達(dá)譜、PRC2靶區(qū)域和結(jié)合蛋白及ncRNA，以及表觀遺傳修飾譜，利用系統(tǒng)生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的方法，整合以上信息，建立以表觀遺傳調(diào)控為中心的涉及蛋白質(zhì)、DNA和RNA 相互作用及轉(zhuǎn)錄表達(dá)的四維表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。從宏觀系統(tǒng)水平上全面、動(dòng)態(tài)地認(rèn)識(shí)信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA和表觀遺傳因子之間的相互作用，它們?nèi)绾谓閷?dǎo)表觀遺傳學(xué)酶機(jī)器PRC2的募集和表觀遺傳標(biāo)記的建立，以及這些互作對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)的影響。構(gòu)建在不同分化系統(tǒng)和體內(nèi)、外發(fā)育模型的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過比擬這些網(wǎng)絡(luò)，認(rèn)識(shí)它們的共通點(diǎn)和特異性，尋找影響定向分化的網(wǎng)絡(luò)中

16、心或節(jié)點(diǎn)，篩選出更多的控制細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因子，包括信號(hào)因子、轉(zhuǎn)錄因子、microRNA、ncRNA和表觀遺傳因子。結(jié)合過表達(dá)、RNA干擾及基因敲除等技術(shù)，研究關(guān)鍵因子在分化過程中的功能及它們與表觀遺傳機(jī)制的相互作用。包括轉(zhuǎn)錄因子、microRNA和ncRNA是如何控制表觀遺傳機(jī)制來建立特定的表觀遺傳狀態(tài)，而表觀遺傳機(jī)制又是如何調(diào)控轉(zhuǎn)錄表達(dá)的。通過比擬人和小鼠多能干細(xì)胞分化過程中轉(zhuǎn)錄因子、microRNA和表觀遺傳機(jī)制互作網(wǎng)絡(luò)的異同, 從進(jìn)化角度深入理解表觀遺傳為中心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在干細(xì)胞分化過程中的作用。最后，我們將把研究成果轉(zhuǎn)化到人類ESCs定向分化的體系中, 優(yōu)化培養(yǎng)條件，利用mRNA 轉(zhuǎn)染、

17、化學(xué)小分子誘導(dǎo)等先進(jìn)技術(shù)，爭(zhēng)取最大限度地提高人類多能干細(xì)胞向各種神經(jīng)、心血管和生殖組織定向分化的效率和平安性，并通過動(dòng)物移植模型驗(yàn)證分化細(xì)胞的功能。3、課題設(shè)置本工程運(yùn)用人和小鼠的多能干細(xì)胞，構(gòu)建及比擬不同分化系統(tǒng)和體內(nèi)、外發(fā)育模型的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)和分子水平上研究控制多能干細(xì)胞向不同方向分化的分子機(jī)制，通過認(rèn)識(shí)調(diào)控機(jī)制的共通點(diǎn)和特異性，找到更多控制細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因子，并且深入研究它們?nèi)绾巫饔糜诒碛^遺傳修飾機(jī)器，影響轉(zhuǎn)錄表達(dá)和最終決定細(xì)胞譜系及功能。最后，研究如何通過操控決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因子或機(jī)制，提高人類多能干細(xì)胞向各種神經(jīng)、心血管和生殖細(xì)胞分化的效率和平安性?；谶@樣的思路，同時(shí)

18、考慮工程團(tuán)隊(duì)成員的研究方向的共性，我們?cè)O(shè)置四個(gè)課題： 多能干細(xì)胞向體細(xì)胞包括神經(jīng)外胚層及心血管中胚層分化模型及調(diào)控機(jī)制；多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化模型及調(diào)控機(jī)制；表觀遺傳學(xué)調(diào)控在干細(xì)胞定向分化中的作用；轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在干細(xì)胞定向分化中的作用。圖2、各課題間相互關(guān)系課題、將建立和優(yōu)化多能干細(xì)胞向三類組織細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系圖2。課題、不僅為課題、提供分化的細(xì)胞模型去研究分化過程中的分子及表觀遺傳學(xué)調(diào)控，同時(shí)也有自己在機(jī)制研究上的側(cè)重點(diǎn)。課題、側(cè)重于利用系統(tǒng)生物學(xué)方法，為課題、的研究提供機(jī)制和提出生物學(xué)假設(shè)，使其在分子水平上得到驗(yàn)證。并且，課題、的基因敲入和敲除的小鼠模型將與課題、的熒光報(bào)告基因小鼠

19、雜交，從個(gè)體發(fā)育的角度研究表觀遺傳調(diào)控如何控制動(dòng)物體內(nèi)組織器官的形成。并且, 課題、的研究?jī)?nèi)容應(yīng)該是表觀遺傳調(diào)控路線中的上下游的關(guān)系。課題主要集中表觀遺傳狀態(tài)是如何建立的，即在分化過程中細(xì)胞特有的調(diào)控因子和表觀遺傳酶的相互作用；而課題主要集中在廣義的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，涉及到對(duì)表觀遺傳狀態(tài)的解讀，即表觀遺傳狀態(tài)如何調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄組。通過對(duì)課題、研究結(jié)果的整合，我們構(gòu)建出影響干細(xì)胞分化和細(xì)胞譜系命運(yùn)的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。課題、研究的分化系統(tǒng)之間，也存在信號(hào)分子、RNA 結(jié)合蛋白、microRNA和表觀遺傳調(diào)控機(jī)制上的共同點(diǎn)。通過對(duì)不同分化系統(tǒng)的比擬，我們才能更好地認(rèn)識(shí)調(diào)控機(jī)制上的共通性和特異性。我

20、們希望通過操控向不同譜系分化的共通的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，來提高定向分化效率；通過操控不同譜系分化的特異性的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，來控制定向分化方向。因此，這四個(gè)課題形成有機(jī)整體，對(duì)我們綜合認(rèn)識(shí)干細(xì)胞在體內(nèi)、外及不同模式動(dòng)物中的分化機(jī)制是缺一不可的。4、工作安排本課題承當(dāng)單位為清華大學(xué)和北京大學(xué)和中科院動(dòng)物所。具體分工和經(jīng)費(fèi)分配如下:課題1：多能干細(xì)胞向體細(xì)胞包括神經(jīng)外胚層及心血管中胚層分化模型及調(diào)控機(jī)制；負(fù)責(zé)人: 那潔, 副教授, 清華大學(xué)學(xué)術(shù)骨干: 沈沁，教授，清華大學(xué)張榮利，副教授, 北京大學(xué)預(yù)算經(jīng)費(fèi)： 24%課題2：多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化模型及調(diào)控機(jī)制；負(fù)責(zé)人: 韓春生, 研究員, 中科院動(dòng)物所學(xué)術(shù)

21、骨干: 紀(jì)家葵，教授，清華大學(xué)預(yù)算經(jīng)費(fèi)： 24%課題3：表觀遺傳學(xué)調(diào)控在干細(xì)胞定向分化中的作用；負(fù)責(zé)人: 沈曉驊, 教授, 清華大學(xué)學(xué)術(shù)骨干: 劉曉玲，高級(jí)工程師，清華大學(xué)夏永靜，副教授, 清華大學(xué)預(yù)算經(jīng)費(fèi)： 25%課題4：轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在干細(xì)胞定向分化中的作用。負(fù)責(zé)人: 湯富酬, 教授, 北京大學(xué)學(xué)術(shù)骨干: 汪陽明，教授，北京大學(xué)劉曉穎，講師, 北京大學(xué)預(yù)算經(jīng)費(fèi)： 27%那潔副教授和沈沁教授將分別負(fù)責(zé)多能干細(xì)胞向心血管和神經(jīng)分化方面的研究。兩實(shí)驗(yàn)室將合作建立轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)，別離體內(nèi)發(fā)育的各階段，各類型心血管和神經(jīng)細(xì)胞。那潔副教授和張榮立副教授將合作在動(dòng)物模型上驗(yàn)證分化細(xì)胞的損傷修復(fù)功能。紀(jì)

22、家葵實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室將集中精力于將人的ESCs分化為PGCs，而韓春生實(shí)驗(yàn)室將集中力量獲得從多能性細(xì)胞來的SSCs。兩個(gè)研究組將合作建立從多能細(xì)胞到生殖細(xì)胞的更加高效平安的誘導(dǎo)方案和機(jī)理研究。沈曉驊教授致力于系統(tǒng)解析PRC2介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控在干細(xì)胞定向分化中的作用，負(fù)責(zé)多能干細(xì)胞系和knockin質(zhì)粒的構(gòu)建，及表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。劉曉玲高級(jí)工程師負(fù)責(zé)建立和維持knockin小鼠，及建立轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)，包括擁有報(bào)告基因和雙標(biāo)記基因敲入的小鼠模型或microRNA全敲除的小鼠模型。夏永靜副教授負(fù)責(zé)利用以上細(xì)胞和小鼠模型向心血管、神經(jīng)和生殖分化方面的研究。湯富酬教授負(fù)責(zé)解析人和小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化過

23、程中的轉(zhuǎn)錄組及表觀遺傳組，及對(duì)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的功能和它們與表觀遺傳因子和網(wǎng)絡(luò)的相互調(diào)控。汪陽明教授負(fù)責(zé)研究人和小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化過程中microRNA組學(xué)分析與其功能，及microRNA與表觀遺傳因子和網(wǎng)絡(luò)的相互調(diào)控。以上科研工作者在課題分屬的研究?jī)?nèi)容中均在國內(nèi)外做出過突出的成績(jī)，實(shí)驗(yàn)室均有良好的研究條件，包括硬件設(shè)施和軟件支撐，能夠保證課題的正常進(jìn)展?？蒲谐晒纬烧撐膶⒐_發(fā)表在知名雜志，關(guān)鍵技術(shù)將申報(bào)專利。5、創(chuàng)新點(diǎn)與特色 參加工程的各個(gè)課題組，近幾年來在干細(xì)胞研究方面積累了豐富的研究經(jīng)歷和前期工作根底，在干細(xì)胞相關(guān)研究領(lǐng)域居國際領(lǐng)先地位。并且，本工程整合各實(shí)驗(yàn)室的特長(zhǎng)，組織了干細(xì)胞基因

24、調(diào)控研究方面的專家，包括表觀遺傳學(xué)沈曉驊、表觀遺傳和基因組學(xué)湯富酬和非編碼RNA汪陽明，與干細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)那潔、神經(jīng)干細(xì)胞沈沁和生殖干細(xì)胞紀(jì)家葵，韓春生研究方面的專家。因此，我們是一支優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的團(tuán)隊(duì)。重要的是，我們會(huì)做到真正的交流、合作、互補(bǔ)與共同開展。我們將建立一個(gè)包括人和小鼠多能干細(xì)胞在體內(nèi)、外向神經(jīng)、心血管和生殖細(xì)胞分化的相關(guān)數(shù)據(jù)庫。該庫包括以下幾個(gè)內(nèi)容：分化體系；全轉(zhuǎn)錄組，包括蛋白編碼基因、microRNA和長(zhǎng)鏈ncRNA的表達(dá)圖譜; 表觀遺傳學(xué)圖譜，包括H3K27me3、H3K4me3等標(biāo)記圖譜；蛋白關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，包括PRC2的關(guān)聯(lián)蛋白；蛋白 RNA 的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，包括PRC2的關(guān)聯(lián)ncRN

25、A 。各組在自己的研究系統(tǒng)內(nèi)開展工作，不斷更新及共享數(shù)據(jù)庫，并探尋其它系統(tǒng)中與自己興趣相關(guān)的新的突破點(diǎn)。通過統(tǒng)一規(guī)劃，聯(lián)合攻關(guān)，與定期的學(xué)術(shù)交流比方每月召開一次大組會(huì)議，各組之間可以在第一時(shí)間內(nèi)了解其它組的工作進(jìn)展，從而防止了單槍匹馬的孤軍作戰(zhàn)，增強(qiáng)我們?cè)趪H競(jìng)爭(zhēng)中的優(yōu)勢(shì)。本工程以發(fā)育生物學(xué)根本原理為根底，不僅從宏觀系統(tǒng)水平上動(dòng)態(tài)認(rèn)識(shí)分化過程中的以表觀遺傳學(xué)為中心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而且從分子水平上深入研究轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳學(xué)酶機(jī)器、microRNA和長(zhǎng)鏈ncRNA對(duì)多能干細(xì)胞定向分化的影響。從而了解細(xì)胞譜系在不同組織器官是如何被確立的，尋找影響定向分化的共同和特異機(jī)制，并著重于關(guān)鍵調(diào)控因子的鑒定。有

26、的放矢地設(shè)計(jì)出提高分化效率和操控細(xì)胞命運(yùn)的最正確方案。我們已建立了一個(gè)非常成熟的用生物素和FLAG標(biāo)記PRC2各核心組分的ESCs實(shí)驗(yàn)手段。利用生物素biotin與鏈霉親和素streptavidin的高度特異性及極強(qiáng)的親和作用，結(jié)合高通量蛋白質(zhì)及DNA測(cè)序技術(shù)，我們有一個(gè)極好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)去提醒在全基因組范圍內(nèi)所有與PRC2相互作用的蛋白、microRNA與長(zhǎng)鏈ncRNA分子。并且，通過構(gòu)建基因敲入knockin) 小鼠模型，將生物素FLAG 雙標(biāo)記通過同源重組整合到內(nèi)源編碼PRC2 組分的基因組位點(diǎn)上，為研究在動(dòng)物體內(nèi)表觀遺傳機(jī)制對(duì)胚胎發(fā)育、器官形成提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。單細(xì)胞分析是本工程的特色之一。由

27、于分化、發(fā)育過程中細(xì)胞的異質(zhì)性Heterogeneity，單純的大量細(xì)胞平均分析Ensemble Analysis會(huì)損失關(guān)鍵的基因表達(dá)調(diào)控信息。在本課題中，我們將利用我們自己最近開展的單細(xì)胞數(shù)字轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)RNA-Seq，對(duì)多能干細(xì)胞在體內(nèi)、外原初分化過程中的基因表達(dá)變化進(jìn)展單細(xì)胞分辨率的、全轉(zhuǎn)錄組范圍的分析，獲得基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的準(zhǔn)確定量信息。同時(shí)，我們正在建立及完善少量細(xì)胞ChIP-Seq和RIP-Seq技術(shù)。將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析與表觀遺傳組分析結(jié)合起來，我們將突破簡(jiǎn)單的基因表達(dá)現(xiàn)象描述以及簡(jiǎn)單的表觀遺傳組現(xiàn)象描述，利用最新的技術(shù)手段，研究多能性細(xì)胞分化發(fā)育過程中關(guān)鍵表觀遺傳密碼對(duì)于核心基

28、因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)理。我們已建立可microRNA全敲除的ESCs和小鼠模型，為尋找在干細(xì)胞分化過程中起關(guān)鍵作用的microRNA 提供了實(shí)驗(yàn)根底和手段。這一模型防止了因microRNA表達(dá)的飽和性saturation和冗余性redundancy對(duì)研究microRNA功能所造成的技術(shù)性困難。本工程側(cè)重于研究microRNA與表觀遺傳因子之間的相互調(diào)控這一尚未充分研究的領(lǐng)域，以此作為一個(gè)突破口來探討表觀遺傳修飾建立的機(jī)制，并且為完善ESCs的定向分化提供新的靶點(diǎn)和技術(shù)。我們是世界上率先使用RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)展細(xì)胞重編程的團(tuán)隊(duì)之一，在這項(xiàng)新技術(shù)的應(yīng)用上已積累了很多經(jīng)歷。相比DNA，病毒或蛋白質(zhì)的技術(shù)

29、，RNA技術(shù)有簡(jiǎn)單直接，高效可控，不改變基因組等優(yōu)點(diǎn)，這決定了它在細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)中將會(huì)有廣泛應(yīng)用。本研究進(jìn)一步開發(fā)RNA 轉(zhuǎn)染技術(shù)在干細(xì)胞定向分化中的應(yīng)用，以提高分化細(xì)胞生成效率和平安性。6、可行性分析研究如何誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為具有獨(dú)特功能的各種成體細(xì)胞是國際干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但也是研究難點(diǎn)。盡管科學(xué)家們已投入了大量的精力去嘗試各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的組合培養(yǎng)體系使多能干細(xì)胞在體外特定條件下分化為各種類型的細(xì)胞，但是分化方向很難控制，分化效率低，并且所得到的細(xì)胞往往缺乏正常的生理功能。因此，這一問題的解決依賴于對(duì)干細(xì)胞在定向分化過程中的調(diào)控機(jī)制的全面深入解析。個(gè)體發(fā)育和干細(xì)

30、胞分化過程的本質(zhì)就是在不同類型的細(xì)胞中建立不同的表觀遺傳圖譜。因此，系統(tǒng)解析以表觀遺傳學(xué)圖譜的建立、維持、識(shí)別和解讀機(jī)制為中心的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是認(rèn)識(shí)干細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育的關(guān)鍵所在，也是最有可能產(chǎn)生突破性發(fā)現(xiàn)的研究方向。近幾年來，本工程的主要參加人員在多能干細(xì)胞的表觀遺傳機(jī)制沈曉驊、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控湯富酬、汪陽明，與多能干細(xì)胞的定向分化沈沁、那潔、紀(jì)家葵、韓春生方面做了大量扎實(shí)的工作，已經(jīng)積累了豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷和大量前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并獲得了多項(xiàng)具有國際影響的研究成果。在此根底上，我們將研究進(jìn)一步集中在以表觀遺傳調(diào)控為中心的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)這個(gè)方向上，使用最前沿的科學(xué)技術(shù)手段，綜合運(yùn)用各種生物學(xué)和系統(tǒng)生物

31、學(xué)技術(shù)，對(duì)體外和體內(nèi)干細(xì)胞分化過程展開系統(tǒng)、深入的分析，因此取得重大突破性成果的可能性是很高的。這樣實(shí)質(zhì)性的合作研究是單個(gè)研究體系、單個(gè)實(shí)驗(yàn)室所難以企及的。四、年度方案第一年研究方案1、 運(yùn)用不同的生長(zhǎng)因子和信號(hào)分子組合，定向誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向心血管、神經(jīng)和生殖細(xì)胞分化，建立和優(yōu)化分化培養(yǎng)體系；2、 制作一系列轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，帶有心血管、神經(jīng)或生殖細(xì)胞組織特異性報(bào)告基因比方Mesp1、Nkx2.5、Islet1、Six3、Pax6、VASA和Dazl驅(qū)動(dòng)表達(dá)的熒光標(biāo)記，純化不同分化階段的心血管、神經(jīng)及生殖細(xì)胞；3、 利用組織細(xì)胞特異性CRE小鼠如Mesp1-CRE、 Mef2C-CRE、 MHCa

32、-CRE、 Pax6-CRE、TH-CRE等與雙色熒光Flox轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，別離體內(nèi)發(fā)育的各階段不同類別的心血管、神經(jīng)及生殖細(xì)胞；4、 別離小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的上胚層、外胚層、中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞，優(yōu)化單細(xì)胞高通量測(cè)序技術(shù)single-cell RNA-Seq，對(duì)以上別離純化的、體內(nèi)外各組織類型細(xì)胞，進(jìn)展單/多細(xì)胞cDNA和microRNA文庫的構(gòu)建；5、 建立人和小鼠ESCs系穩(wěn)定表達(dá)生物素biotin和FLAG雙標(biāo)記的表觀調(diào)控蛋白比方PRC2復(fù)合體組分包括EED、EZH2、EZH1、JMJ 和 MTF2；建立生物素biotin和FLAG雙標(biāo)記基因敲入knockin的ESCs。預(yù)期目標(biāo)1

33、、 建立人和小鼠多能干細(xì)胞向心血管、神經(jīng)和生殖細(xì)胞的分化、別離和培養(yǎng)系統(tǒng)；2、 建立假設(shè)干組織特異性熒光蛋白報(bào)告體系；3、 獲得較為純化的心血管前體和組織細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞NSCs、神經(jīng)元、原始生殖細(xì)胞PGCs和精原干細(xì)胞SSCs和小鼠體內(nèi)別離的各胚層細(xì)胞；4、 完成RNA-seq和microRNA-seq測(cè)序文庫的構(gòu)建；5、 完成基因組敲入knock-in質(zhì)粒載體的構(gòu)建，并得到內(nèi)源編碼bfPRC2 組分的陽性克隆ESCs；建立表達(dá)bfPRC2的分化細(xì)胞系，包括 EpiSCs (上胚層干細(xì)胞，僅對(duì)小鼠)、NPCs神經(jīng)前體細(xì)胞和NSCs 神經(jīng)干細(xì)胞等。第二年研究方案1、 對(duì)體內(nèi)外分化的各階段、組織

34、的細(xì)胞進(jìn)展RNA-seq和microRNA-seq分析，研究編碼及非編碼基因表達(dá)譜；篩選多能干細(xì)胞向各組織定向分化的差異表達(dá)基因和非編碼RNA；2、 對(duì)體內(nèi)外分化的各階段、 組織的細(xì)胞進(jìn)展染色質(zhì)免疫沉淀-測(cè)序ChIP-seq分析，系統(tǒng)解析定向分化各階段細(xì)胞的H3K4me3和H3K27me3等表觀遺傳修飾譜式;3、 建立體外分化的人類神經(jīng)干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)體系；鑒定microRNA缺失干細(xì)胞在分化過程中的表型；構(gòu)建生物素FLAG雙標(biāo)記PRC2的小鼠模型；建立生殖系統(tǒng)小鼠動(dòng)物模型研究平臺(tái)；4、 優(yōu)化biotin-streptavidin介導(dǎo)的蛋白提純及質(zhì)譜鑒定，和RNA免疫沉淀及高通量測(cè)

35、序(bioRIP-seq) 的實(shí)驗(yàn)方法；鑒定與PRC2相互作用染色質(zhì)區(qū)域；研究-catenin在多能干細(xì)胞心血管組織分化過程中的結(jié)合蛋白；分析Foxg1和Jarid1B在多能干細(xì)胞分化過程中各時(shí)期的表達(dá)特性；通過RNAi和過表達(dá)研究Foxg1在神經(jīng)外胚層和前腦神經(jīng)元分化中的作用； 研究生殖質(zhì)的功能。預(yù)期目標(biāo)1、 解析未分化和不同分化細(xì)胞的全基因組表達(dá)譜，初步建成多能干細(xì)胞向心血管、神經(jīng)和生殖細(xì)胞定向分化的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選假設(shè)干在神經(jīng)、心血管和生殖細(xì)胞分化過程中可能起重要作用的、差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳調(diào)控蛋白、microRNA和長(zhǎng)鏈ncRNA；2、 鑒定PRC2和H3K4me3、H3

36、K27me3等表觀遺傳修飾在染色質(zhì)上的結(jié)合區(qū)域； 3、 完善蛋白組學(xué)和bioRIP-seq的實(shí)驗(yàn)方法，為后期大規(guī)模系統(tǒng)生物學(xué)研究提供最正確實(shí)驗(yàn)手段；4、 深入提醒經(jīng)典信號(hào)通包括Wnt/-catenin等、 Foxg1和表觀遺傳調(diào)控因子PRC2、BAF250a、BAF180、ZFP261等在神經(jīng)、心血管和生殖細(xì)胞分化中的分子與表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制；鑒定microRNA缺失的干細(xì)胞和神經(jīng)-心血管共培養(yǎng)體系中的干性基因表達(dá)、分子標(biāo)記物和生理特征； 5、 完成假設(shè)干小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建， 獲得內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)生物素-FLAG標(biāo)記PRC2基因的敲入小鼠， 獲得幾個(gè)可能對(duì)生殖細(xì)胞形成起重要作用的基因的flo

37、x條件性敲除小鼠，包括BAF250、BAF180、ZFP261和Stra8-EGFP，TNAP-CRE、VASA-CRE、Stra8-CRE、Ngn3-CRE等轉(zhuǎn)基因小鼠。第三年研究方案1、 對(duì)于差異表達(dá)的microRNA、ncRNA和蛋白因子,利用RNA過表達(dá)、RNAi、反義核酸以及基因敲除、免疫共沉淀和ChIP等技術(shù)，深入研究它們?cè)诙嗄芨杉?xì)胞向心血管、神經(jīng)和生殖細(xì)胞定向分化的功能；2、 研究Musashi、HuD、FMRP、PELOTA、DAZL和VASA等RNA結(jié)合蛋白在多能干細(xì)胞定向分化中的功能； 3、 利用蛋白質(zhì)復(fù)合體純化和質(zhì)譜測(cè)序系統(tǒng)高通量篩選多能干細(xì)胞定向分化中與PCR2相互作用

38、的蛋白質(zhì),；4、 利用bioRIP-seq高通量篩選多能干細(xì)胞定向分化中與PCR2相互作用的非編碼RNAncRNA；5、 利用microRNA缺失干細(xì)胞及相關(guān)分化表型篩選起重要調(diào)控作用的microRNA，并研究microRNA和轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于表觀遺傳修飾的直接調(diào)節(jié)機(jī)制;6、 建立同時(shí)擁有報(bào)告基因和雙標(biāo)記表觀遺傳基因敲入的小鼠模型或microRNA全敲除的小鼠模型；建立小鼠心肌梗死、神經(jīng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞移植模型。預(yù)期目標(biāo)1、構(gòu)建與PRC2相互作用的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)ncRNA和microRNA；2、獲得假設(shè)干影響多能干細(xì)胞向心血管、神經(jīng)和生殖細(xì)胞定向分化的調(diào)控因子包括蛋白、microRNA和長(zhǎng)鏈ncRNA；3、說明重要RNA結(jié)合蛋白和非編碼RNA在神經(jīng)和生殖分化中的作用；4、獲得一系列既帶有組織特異性熒光蛋白標(biāo)記，也同時(shí)表達(dá)帶標(biāo)記的PRC2組分或條件性microRNA全敲除系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，為深入研究體內(nèi)胚胎發(fā)育過程中的分子和表觀遺傳調(diào)控提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。第四年研究方案1、 利用同時(shí)擁有報(bào)告基因和雙標(biāo)記基因敲入的小鼠或microRNA全敲除的小鼠模型，別離胚胎發(fā)育中生殖、神經(jīng)、心血管等譜系的細(xì)胞，對(duì)以上較為純化的少量細(xì)胞進(jìn)展RNA-seq、bioC