知無(wú)不“研”一文讀懂免疫共沉淀技術(shù)(Co-IP)

1、知無(wú)不“研一文讀懂免疫共沉淀技術(shù)（Co-IP）蛋白間相互作用是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者，參與幾乎所有的重要生命活動(dòng)。因此，蛋白蛋白相互作用研究以及建立相互作用的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，具有十分重要的意義，也是目前蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Co-IP（免疫共沉淀,co-inmunoprecipitation）是經(jīng)典的利用抗體從樣品中捕獲靶蛋白及其互作蛋白、復(fù)合體的一項(xiàng)技術(shù)，能夠特異性富集所研究的目的蛋白。由于過(guò)程中采用了非變性條件，保留了互作及復(fù)合體的細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)。相對(duì)于酵母雙雜交、pulldown等方法，其特色之一便是捕獲的蛋白互作發(fā)生在所研究的特定組織細(xì)胞內(nèi)，保存了互作蛋白及復(fù)合體的“內(nèi)源”狀態(tài)。Co-I

2、P實(shí)驗(yàn)原理：以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)丫也能沉淀下來(lái)。ProteinA-agarosebeadAntigenisolationAntibodybindingtoProteinA-agarosebeadAantybodyElutionandanalysisProteinandinteractingproteinCo-IP實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢(shì):a）取材可以選擇該目的蛋

3、白所在物種、特定組織、細(xì)胞，因此CoIP能夠反應(yīng)該蛋白在天然組織細(xì)胞狀態(tài)下存在的互作關(guān)系蛋白；b）找出整個(gè)復(fù)合體中直接/間接互作的多個(gè)蛋白，研究復(fù)合體組成；c）通過(guò)與質(zhì)譜鑒定連用可以初篩到一系列未知蛋白，再通過(guò)其他技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。Co-IP實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)a）需要特異性IP級(jí)別誘餌蛋白抗體（重點(diǎn)）；b）如果沒(méi)有特異性抗體，則需要考慮構(gòu)建重組標(biāo)簽質(zhì)粒，用標(biāo)簽抗體進(jìn)行CoIP實(shí)驗(yàn)；c）樣品種類(lèi)實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)：過(guò)表達(dá)細(xì)胞樣品細(xì)胞樣品動(dòng)物組織樣品植物樣品（通常為轉(zhuǎn)基因植物，標(biāo)簽抗體也很難達(dá)到特異性富集）；d）CoIP-MS風(fēng)險(xiǎn)：由于存在特異性抗體高豐度蛋白，質(zhì)譜不一定能夠鑒定到誘餌蛋白。CoIP技術(shù)案例分析a）

4、兩個(gè)已知蛋白互作驗(yàn)證（體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）常規(guī)思路：通過(guò)一系列功能實(shí)驗(yàn)確定某個(gè)信號(hào)通路，明確通路相關(guān)蛋白并進(jìn)行驗(yàn)證。文獻(xiàn)中：通過(guò)CoIP-WB驗(yàn)證誘餌蛋白CEBPB和互作蛋白PGCla是否結(jié)合，進(jìn)一步確定HCP5/miR-3619-5p/AMPK/PGCla/CEBPB通路在胃癌中的作用。AGSMKN45PGClaCEBPBInputFrom：MSC-inducedlncRNAHCP5drovefattyacidoxidationthroughmiR-3619-5p/AMPK/PGCla/CEBPBaxistopromotestemnessandchemo-resistanceofgastriccanc

5、er.b）通過(guò)質(zhì)譜篩選某個(gè)已知蛋白可能結(jié)合蛋白（體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）常規(guī)思路：通過(guò)組學(xué)或其他手段確定某個(gè)功能相關(guān)蛋白，進(jìn)一步篩選確定該蛋白作用機(jī)理，則可以選擇CoIPMS.文獻(xiàn)中：通過(guò)CoIP-MS實(shí)驗(yàn)篩選到差異蛋白vimentin,CoIP-WB和GSTpull-down等方法進(jìn)一步確定P62與vimentin互作。Fromp62/SQSTMlinteractswithvimentintoenhancebreastcancermetastasis.c）通過(guò)質(zhì)譜篩選某個(gè)已知蛋白可能結(jié)合蛋白（體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）特點(diǎn)一：使用EGFP融合蛋白標(biāo)簽做IP實(shí)驗(yàn)。特點(diǎn)二：則是通過(guò)兩次平行CoIP-MS實(shí)驗(yàn)，除了篩選兩次差異

6、蛋白外，進(jìn)一步將兩次差異蛋白取交集縮小篩選范圍，從中選擇Ngb蛋白互作蛋白。EGFPC2IKA，ECifPCI明EOVTSINGBACTC1VIMIGKCPGK1RPSABANF1CKBHSPASGPIYWHA2YBX125commonelementsMthetwohNgb-EGFPsanrples:NeuroglobinActinVimentjnImmunoglobulinkappconstantPhosphoglyceratekinase140SproteinSABrrfactorCreatinekirwseB-type78kDaglucose*regulaiedproteinGlucos

7、e6-phosphateisomerase14-3-3proteinzeta/deltaNuclease-sensitiwelement-bindingproton1From-ConnectingtheDotsintheNeuroglobin-ProteininteractionNetworkofanUnstressedandFerroptoticCellDeathNeurob1astomaMode1.Co-IP技術(shù)疑點(diǎn)分析1、Co-IP可不可以用珠子做？比如HisGST的瓊脂糖？答：Co-IP是通過(guò)磁珠與抗體形成的復(fù)合物進(jìn)行富集，HisGST的瓊脂糖這些柱料不適用。2、請(qǐng)問(wèn)Co-Ip如何選擇

8、合適的Input對(duì)照和同型對(duì)照？有什么要求和原則嗎？答：Co-IP使用Input陽(yáng)性對(duì)照即可，Input即實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞裂解液。3、互作驗(yàn)證一定要western嗎？純化的蛋白可見(jiàn)呢？答：可見(jiàn)蛋白只能判斷蛋白大小，還是需要WB確定就是目的蛋白。4、Co-IP時(shí)，Input的帶型不夠完，怎么解決？答：可以瞬轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)處理。5、兩個(gè)蛋白，哪個(gè)適合ip有要求嗎？答：有IP級(jí)別抗體的蛋白優(yōu)先考慮作為誘餌蛋白。6、請(qǐng)問(wèn)Co-IP,INPUT的加樣量是多少？那IgG和IP的上樣量相應(yīng)有要求嗎？答：通常上樣量50ug/lOOug。7、免疫共沉淀如何避免假陽(yáng)性？答：Co-IP選擇抗體尤為關(guān)鍵，特異性抗體可以排除非特異性結(jié)合進(jìn)而排除假陽(yáng)性。同時(shí)可以結(jié)合Co-IP反向驗(yàn)證進(jìn)一步排除假陽(yáng)性。若抗體濃度過(guò)高，則降低抗體濃度；若抗體特異性不好，則更換抗體。8、質(zhì)譜結(jié)果幾百個(gè)怎么分析可能的互作蛋白？答：如果蛋白較多，建議先做功能注釋?zhuān)?/p>