Nurr1基因修飾人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞源性多巴胺能神經(jīng)

1、.Nurr1基因修飾人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞源性多巴胺能神經(jīng)【摘要】【目的】探討Nurr1基因修飾的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(HUCB-MSC)源性的多巴胺能神經(jīng)元移植對帕金森病(PD)模型鼠的治療作用?！痉椒ā縎D大鼠PD模型隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、單純HUCB-MSC組(B組)、Nurr1基因醫(yī)學(xué)論文代寫代發(fā)代寫醫(yī)學(xué)論文代寫代發(fā)各專業(yè)醫(yī)學(xué)職稱論文助醫(yī)代寫論文網(wǎng)：客服咨詢電話作Q Q：273322232 E-mail：clotlw修飾HUCB-MSC組(C組)。將HUCB-MSC及Nurr1基因修飾后的HUCB-MSC體外分化為多巴胺能神經(jīng)元，并通過立體定向的手段將其移植入毀

2、損側(cè)紋狀體，觀察移植前后PD模型大鼠旋轉(zhuǎn)行為的變化和腦內(nèi)多巴胺(DA)含量的改變，以及紋狀體區(qū)酪氨酸羥化酶(TH)表達(dá)的變化?！窘Y(jié)果】B、C兩組在移植后第2周、4周和8周時旋轉(zhuǎn)行為及腦內(nèi)DA含量均較A組有所改善(P 0.05，P 0.01)，且B、C組間比較C組改善明顯(P 0.05)，這種差異以第8周時最為明顯。移植后B、C兩組TH表達(dá)較A組明顯增高，并隨著時間的增加而逐漸增高，且C組在各時間點(diǎn)上TH表達(dá)較B組含量高(P 0.05)，并在移植后第8周時最為明顯?！窘Y(jié)論】Nurr1基因修飾HUCB-MSC來源的多巴胺能神經(jīng)元移植治療PD模型鼠，能有效地增加鼠腦內(nèi)多巴胺含量和紋狀體區(qū)TH的表達(dá)，

3、改善PD模型鼠的癥狀，為細(xì)胞移植治療PD提供了一種嶄新的手段?！娟P(guān)鍵詞】Nurr1基因；人臍帶血；間充質(zhì)干細(xì)胞；多巴胺能神經(jīng)元；帕金森病Therapeutic Effect of Transplantation of Dopaminergic Neuron Derived from Nurr1 Gene Modified HUCB-MSC to Rat Model of Parkinson's Disease HUANG Shi-xiong1，LIU Jun2*，WEN Guo-qiang1，XIAO Song-hua2，LIAO Xiao-ping1，LIU Yun-lin2，OUY

4、ANG Feng1，XING Yi-gang2(1.Department of Neurology，Hainan Provincial People's Hospital，Haikou 570311，China；2.Department of Neurology，The Second Affiliated Hospital，Guangzhou 510120，China)Abstract：【Objective】To observe the therapeutic effect on rat model of Parkinson's disease(PD)by transplant

5、ation of dopaminergic neuron derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells(HUCB-MSC)modified by Nurr1 gene.【Methods】Forty-five SD rat model of PD were grouped randomly into sham operation group(group A)，HUCB-MSC transplantation group(group B)and Nurr1 gene modified HUCB-MSC group(gr

6、oup C).HUCB-MSC and Nurr1gene modified HUCB-MSC were differentiated to dopaminergic neuron and then transplanted into impair striatum of rat PD model.Rotational behavior examination was carried out at different time point after transplantation.Dopamine content and the expression of tyrosine hydroxyl

7、ase(TH)in rat striatum were detected at the same time point as well.【Results】The rat rotational behavior was improved and dopamine content in striatum increased obviously in group Band Cas compared with gro up Aat the 2nd，4th，and 8th week after transplantation(P 0.05 and P0.01，respectively).These ch

8、anges were more significant in group Cthan that in group Bat each time point after transplantation(P 0.05)and the differences reached the most obvious at 8th week after transplantation.Meanwhile，TH expression in rat striatum in group Band Cincreased with time and was higher than that in group A(P 0.

9、01)，furthermore，it was higher in group Cthan that in group Bafter transplantation(P 0.05)，and the differences reached most obvious at the 8th week.【Conclusion】Transplantation of dopaminergic neurons derived from HUCB-MSC modified with Nurr1 can elevate the DA content，increase the expression of TH in

10、 rat brain and improve the symptoms of rat model of PD effectively，which provide anew strategy for cell transplantation therapy for PD.Key words：Nurr1 gene；human umbilical cord blood；mesenchymal stem cells；dopaminergic neuron；Parkinson's diseaseJ SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2009，30(5)：522-526利用外源性

11、多巴胺能神經(jīng)元重建腦內(nèi)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)是移植治療帕金森病(Parkinson's disease，PD)的目標(biāo)之一。國內(nèi)外目前采用的補(bǔ)充多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)營養(yǎng)藥物，雖然能部分改善病人癥狀，但并不能阻止病情的發(fā)展，甚至加速殘存的多巴胺神經(jīng)元變性。因此，阻止中腦多巴胺能神經(jīng)元變性、促進(jìn)多巴胺分泌的基因治療和細(xì)胞移植目前則是國內(nèi)外在PD研究領(lǐng)域的重中之重1。臍血干細(xì)胞是一種具有分化潛能的原始細(xì)胞，具備自我更新和增殖能力，并能在特定因素的影響或誘導(dǎo)下，向各種細(xì)胞或組織分化2-3。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)使用基因重組成纖維細(xì)胞生長因子-8(fibroblast growth factor-8，F(xiàn)GF-8)

12、和音猬因子(sonic hedgehog，SHH)刺激可以將人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，HUCB-MSC)誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元，但陽性率較低，其移植后療效欠佳4。近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子Nurr1與干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化及多巴胺能神經(jīng)元生存和發(fā)展關(guān)系密切，Nurr1基因的過表達(dá)能在一定程度上促進(jìn)多種干細(xì)胞向DA能神經(jīng)元的分化5-6。我們在前期的體外研究已完成了HUCB-MSC的分離和純化，進(jìn)一步將HUCB-MSC以及Nurr1基因體外修飾的HUCB-MSC在條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用細(xì)

13、胞因子的誘導(dǎo)促使HUCB-MSC進(jìn)一步向多巴胺能神經(jīng)元分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nurr1基因體外修飾的HUCB-MSC較單純HUCB-MSC向DA能神經(jīng)元分化的比例明顯增高7。為了驗(yàn)證其進(jìn)一步的治療效果，本研究將HUCB-MSC以及Nurr1基因修飾后HUCB-MSC源性體外分化的DA能神經(jīng)元移植入PD模型大鼠紋狀體內(nèi)，通過觀察移植前后PD模型大鼠旋轉(zhuǎn)行為的變化和腦內(nèi)多巴胺(dopamine，DA)含量的改變，以及紋狀體區(qū)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)表達(dá)的變化，闡明Nurr1基因結(jié)合HUCB-MSC來源的多巴胺能神經(jīng)元移植在PD細(xì)胞移植治療策略中的重要地位。1材料與方法

14、1.1實(shí)驗(yàn)材料正常雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量為190220 g之間，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)，阿樸嗎啡(apomorphine，Apo)和TH單克隆抗體(Sigma公司)，510高壓泵型高效液相色譜儀(美國HP公司)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)向多巴胺能神經(jīng)元的分化體外HUCB-MSC的分離、培養(yǎng)、鑒定；體外Nurr1基因的轉(zhuǎn)染至MSC，轉(zhuǎn)染后基因表達(dá)的檢測，以及HUCB-MSC及Nurr1基因修飾的HUCB-MSC在含有FGF-8和Shh的神經(jīng)細(xì)胞條件培養(yǎng)液中向DA能神經(jīng)元

15、的分化及鑒定見參考文獻(xiàn)7。1.2.2 SD大鼠帕金森病模型制備SD大鼠帕金森病模型制作以及行為學(xué)檢測采用本課題組以往建立的方法，詳見參考文獻(xiàn)8。1.2.3實(shí)驗(yàn)動物分組及HUCB-MSC源性DA能神經(jīng)元移植策略取合格的PD模型鼠共45只，隨機(jī)分為3組。對照組(假手術(shù)組，A組)，15只；單純HUCB-MSC源性多巴胺能神經(jīng)元移植治療組(單純移植組，B組)，15只；Nurr1基因修飾的HUCB-MSC源性多巴胺能神經(jīng)元移植治療組(基因修飾組，C組)，15只。采用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉模型鼠成功后，行毀損側(cè)紋狀體一點(diǎn)定位注射。注射量均為4L/只，細(xì)胞濃度為1×105/L，注射完成后留針

16、10 min再移除，以保證細(xì)胞植入，假手術(shù)組予以4L生理鹽水注射。移植大鼠不進(jìn)行任何免疫抑制劑的處理。1.2.5 PD模型鼠移植后的行為學(xué)檢測及腦內(nèi)DA含量的測定各組分別于移植后第2、4、8周，行Apo誘發(fā)行為學(xué)檢測，計數(shù)大鼠平均每分鐘身體旋轉(zhuǎn)360°的次數(shù)，觀察各組PD模型進(jìn)行不同移植策略后行為學(xué)的變化。各組在做完旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)后，分別取3只模型鼠，斷頭取腦立即置于冰上，快速解剖移植(毀損)側(cè)紋狀體，保存于-70冰箱內(nèi)待測。同時分別取健康大鼠3只作為空白對照。測定時行紋狀體稱質(zhì)量，加入高氯酸勻漿，離心取上清液，過濾后行高效液相測定腦內(nèi)DA含量。1.2.6移植后紋狀體區(qū)TH檢測各組動物(每

17、個時間點(diǎn)取2只動物進(jìn)行檢測)于進(jìn)行Apo誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)后即采用升主動脈灌注法固定腦組織，作厚度為5m的切片，按試劑盒說明書操作，并行TH染色，陽性染色呈棕色。采用圖像分析儀分析紋狀體區(qū)TH染色的平均灰度和平均吸光度，計算陽性單位值。1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計和結(jié)果分析全部數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，各組數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)采用方差分析。P 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1移植后模型鼠行為學(xué)的檢測結(jié)果在移植后第2、4、8周對模型鼠旋轉(zhuǎn)行為進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：B組及C組在移植后第2、4和8周時其旋轉(zhuǎn)行為均較移植治療前有所改善，且隨時間

18、延長改善情況越明顯。對3組在移植后第2、4、8周時比較發(fā)現(xiàn)，在各時間點(diǎn)B組、C組均較對照組均有明顯改善(P 0.05)，其中以C組改善更為明顯，同B組比較在各時間點(diǎn)亦有明顯差異(P 0.05)，且這種差異以移植后第8周最為明顯，見表1。2.2移植后PD大鼠腦內(nèi)多巴胺含量的測定利用高效液相色譜技術(shù)對各組大鼠紋狀體內(nèi)的DA水平進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示。B、C兩組腦內(nèi)DA含量較A組明顯增高(P 0.01)，在第8周時最為明顯，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.01)。移植后各時間點(diǎn)C組比B組含量高(P 0.05)，而這種差異在移植后8周時達(dá)到最大，但C組即使在移植后8周時，其腦內(nèi)DA含量仍較健康大鼠低(

19、P 0.01)。2.3免疫組織化學(xué)結(jié)果紋狀體區(qū)TH免疫組化結(jié)果顯示，移植后各時間點(diǎn)動物紋狀體區(qū)TH染色的陽性單位(positive unit，PU)值在A組為3.2±0.3，在B、C兩組其TH表達(dá)較A組明顯增高，且隨著時間的增加而逐漸增高，在第2、4、8周時，B組TH的PU值分別為4.6±0.2，5.3±0.1和5.8±0.2，C組為5.5±0.3，6.8±0.2和7.1±0.3，同A組相比均有顯著性差異(P 0.01)，且C組在各時間點(diǎn)上TH表達(dá)較B組含量高(P 0.05)，這種差異在移植后8周時達(dá)到最大(P<0.0

20、1；圖3)。3討論由于PD的病理學(xué)基礎(chǔ)和黑質(zhì)-紋狀體通路研究的較為透徹，而且其結(jié)構(gòu)較其它神經(jīng)部位簡單，突觸聯(lián)系易于建立，已成為神經(jīng)干細(xì)胞能夠治愈的最佳靶疾病9。而利用外源性多巴胺能神經(jīng)元重建腦內(nèi)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)是移植治療PD的主要策略。Yang等10將人胚胎干細(xì)胞來源的多巴胺能神經(jīng)元移植至6-OHDA所致的PD模型鼠，可使其運(yùn)動功能得以改善長達(dá)5個月。類似的效果亦可見于過表達(dá)Pitx3的神經(jīng)干細(xì)胞所分化形成的多巴胺能神經(jīng)元上11。然而由于神經(jīng)干細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞的來源受限，取材難度大，尤其是牽涉到倫理道德方面的問題，大大地限制了其今后的臨床應(yīng)用。研究表明，臍血干細(xì)胞是一種具有分化潛能的原始細(xì)胞，

21、具備自我更新和增殖能力，并能在特定因素的影響或誘導(dǎo)下，向各種細(xì)胞分化，是造血、內(nèi)皮、間充質(zhì)和神經(jīng)等多種干細(xì)胞的豐富來源12-13。具有來源豐富，易于獲得且干細(xì)胞含量高，細(xì)胞原始，異體移植后免疫排斥反應(yīng)發(fā)生率低、程度較輕等優(yōu)越性。因此進(jìn)一步探討臍血干細(xì)胞的特性，深入研究其定向分化以及神經(jīng)移植后的作用將會對包括PD在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞移植治療提供一種嶄新的策略。作為近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子Nurr1與神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化及多巴胺能神經(jīng)元生存和發(fā)展關(guān)系密切5，同時我們以往的研究亦發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的Nurr1基因可以拮抗6-羥多巴對神經(jīng)干細(xì)胞的毒性作用14。我們在本課題的前

22、期研究中已成功地在體外使用Nurr1基因誘導(dǎo)使得HUCB-MSC進(jìn)一步向DA能神經(jīng)元分化并完成了DA能神經(jīng)元的鑒定，更重要的是發(fā)現(xiàn)Nurr1基因體外修飾的HUCB-MSC較單純HUCB-MSC向DA能神經(jīng)元分化的比例明顯增高7。本研究在完成HUCB-MSC以及Nurr1基因修飾后HUCB-MSC體外誘導(dǎo)分化成DA能神經(jīng)元的基礎(chǔ)上，將分化后的DA能神經(jīng)元移植入PD模型大鼠腦紋狀體內(nèi)來進(jìn)一步觀察，對比其潛在的治療效果。結(jié)果顯示單純移植組、基因修飾組在移植后第2、4、8周時其旋轉(zhuǎn)行為均較治療前有所改善，且隨時間延長改善情況越明顯；同時，三組在移植后各時間點(diǎn)比較，單純移植組、基因修飾組兩組均較對照組有

23、明顯改善(P 0.05)；且基因修飾組改善更為明顯，同單純移植組比較亦有明顯差異(P 0.05)，這種差異以第8周時最為明顯。上述結(jié)果表明，在用HUCB-MSC源性DA能神經(jīng)元移植治療后，PD模型癥狀得以明顯改善，而Nurr1基因修飾后的HUCB-MSC源性多巴胺能神經(jīng)元治療的效果更為明顯，動物的癥狀改善程度和持續(xù)時間明顯延長。表明了HUCB-MSC對PD潛在的治療效果以及Nurr1基因?qū)UCB-MSC向DA能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的重要作用。為了更客觀地衡量HUCB-MSC來源的DA能神經(jīng)元和Nurr1基因修飾后HUCB-MSC來源的DA能神經(jīng)元移植后腦內(nèi)DA含量的變化，在移植后2周、4周、8周時

24、利用高效液相色譜技術(shù)對PD模型鼠紋狀體內(nèi)的DA含量進(jìn)行了定量測定，同時增加健康大鼠紋狀體內(nèi)DA含量的檢測作為對照，發(fā)現(xiàn)兩個移植治療組腦內(nèi)DA含量較假手術(shù)組明顯增高(P<0.01)，移植后各時間點(diǎn)上Nurr1基因修飾組腦內(nèi)的DA含量較單純移植組增高(P<0.05)，而這種差異在移植后8周時達(dá)到最大。但即使在移植后8周時，Nurr1基因修飾組腦內(nèi)DA含量仍較健康大鼠低(P<0.01)。TH免疫組化結(jié)果顯示，移植后各時間點(diǎn)大鼠紋狀體區(qū)TH在兩個移植組表達(dá)較對照組明顯增高，且隨著時間的增加而逐漸增高。在第8周，單純移植組和基因修飾組TH表達(dá)同對照組相比有顯著性差異(P<0.01

25、)，且基因修飾組在各時間點(diǎn)上TH表達(dá)均較單純移植組含量高(P<0.05)，這種差異在移植后8周時達(dá)到最大(P<0.01)。以上結(jié)果表明盡管移植后并不能完全糾正PD模型鼠腦內(nèi)DA含量的減少，但細(xì)胞移植后仍使得腦內(nèi)DA能神經(jīng)元數(shù)量及DA含量增加，受損的DA能系統(tǒng)在一定程度上得到重建的作用仍是較為顯著的。Nurr1基因修飾組所取得的療效除了與其在多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育、分化及維持中的主導(dǎo)作用外，還可能通過減少小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)毒性介質(zhì)的形成而起到對PD多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用15。綜上所述，HUCB-MSC來源的，尤其是Nurr1基因修飾后HUCB-MSC來源的DA能神經(jīng)元

26、移植治療PD模型，能有效地增加動物腦內(nèi)TH的表達(dá)，改善PD模型鼠的癥狀。為細(xì)胞移植治療PD提供了一種嶄新的策略。【參考文獻(xiàn)】1 Svendsen CN，Caldwell MA，Shen J，et al.Long-term survival of human central nervous system progenitor cells transplanted into arat model of Parkinson's diseaseJ.Exp Neurol，1997，148(1)：135-146.2 McGuckin C，F(xiàn)orraz N，Baradez MO，et al.Embr

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