生殖支原體檢測方法的研究進展

1、生殖支原體檢測方法的研究進展            生殖支原體檢測方法的研究進展    2008-5-9 13:11:23                          

2、60;                      自Tully等1981年首次從非淋菌性尿道炎男性患者的尿道分泌物中分離培養(yǎng)出2株生殖原體（Mycoplasma genitalun,Mg）以后，許多學者對Mg的生長特性、免疫學特性、分子生物學特性以及與疾病的關(guān)系等進行了大量的研究并建立了多種Mg的檢測方法，本文就Mg的檢測方法研究進展進行簡要綜述。    &

3、#160;1 分離培養(yǎng)法         國內(nèi)學者對SP-4培養(yǎng)基進行了改良。趙季文等4利用改良的SP-4培基從性病及性亂人群中分離Mg獲得成功，初代生長時間在30天以上，平均為37.83天，最長為55天。     1.2組織細胞培養(yǎng)法 組織細胞培養(yǎng)支原體，可為支原體提供良好的類似體內(nèi)的生長環(huán)境。早在60年代，Chanock等5報道了肺炎支原體（Mp）在組織細胞中的生長。90年代，Jensen等3，6開始嘗試用細胞培養(yǎng)法來進行Mg的繁殖，并借此在電鏡下觀察到Mg侵入細胞的過程

4、以及在細胞內(nèi)的定位。在PCR的監(jiān)測下，Jensec發(fā)現(xiàn)在11分PCR檢測MgDNA陽性的尿道標本中，有9份適應在Vero細胞磁頭中增殖，經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入改良的Friis fF肉湯培養(yǎng)基中，有6份能繼續(xù)傳代生長，最終在瓊脂培養(yǎng)基中克隆獲得4株。Jensen認為，在分離獲得新的Mg菌株方面，細胞培養(yǎng)繁殖過程起到了三方面的作用，一是使臨床標本中的Mg逐漸適應在人工培養(yǎng)基中生長，二是增加了接種于支原體肉湯培養(yǎng)基中的支原體數(shù)量，三是提供持續(xù)的接種源。     2 血清學方法     根據(jù)Mg的免疫學特性，人們建立了用檢

5、測Mg抗體和檢測與鑒定Mg抗原的血清學方法。     Furr等7于1984年詳細報道了檢測Mg抗體的MIF技術(shù)。Moller等對31例未檢測出Ct和Mh血清抗體的急性盆腔炎患者，用MIF檢測Mg抗體，發(fā)現(xiàn)其中大約40%在發(fā)病后一個月內(nèi)抗體滴度有4倍或4倍以上的改變。Taylor-Robinson等9報道應用間接MIF檢測NGU患者Mg抗體，認為間接MIF試驗是一種具有足夠敏感性、特異性和簡便易行的檢測方法。Jensen等曾用EIA檢測有尿道炎癥與無尿道炎癥狀的男性STD患者急性期血樣標本中Mg抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反應性較弱，且與Mp存在廣泛的交叉反應。 &#

6、160;   根據(jù)特異性抗體能阻止支原體的生長及代謝這一特性，可采用已知高價血涉及進行祖先生長及代謝抑制試驗以鑒別支原體11。趙季文等曾采用MIT鑒定所分離獲得的Mg菌株。     暴露于支原體表面的脂結(jié)合膜蛋白（lipid-associated membrane proteins,LAMPs是一種支原體種屬特異性抗原，具有高抗原性，且不同菌株的支原體，其LAMP抗體具有高度種屬特異性，與其它種屬無交叉反應12，13。）因此提取Mg的LAMP建立ELISA方法檢測Mg抗體，可消除Mg與Mp之間的交叉反應。  

7、60;  3 分子生物學方法     DNA探針和聚合酶鏈反應（PCR）檢測Mg的方法，克服了前兩類檢測方法的弊端，為研究Mg與疾病的病因?qū)W關(guān)系提供了有力的手段。     3.1DNA探針技術(shù) 1987年Hyman14用PUCB載體構(gòu)建成Mg基因文庫，并從中篩選制備出特異性DNA探針，通過斑點雜交，可檢測僅含0.1 ng的特異性支原體DNA，即105CFU。     3.2 聚合酶鏈反應（PCR）技術(shù) PCR是一種新的基因診斷技術(shù)，靈敏度高，特異性強，且快

8、速、簡便。1990年，PCR技術(shù)開始在醫(yī)學支原領域應用。     早期的引物多參照菌體末端特異性粘附蛋白的DNA序列而設計。Palmer等體外擴增Mg粘附蛋白的部分核苷酸序列，3株Mg均出現(xiàn)37bp的DNA片斷，并證明PCR技術(shù)可檢測到10-15g的 mg-DNA，其引物序列的：     mg1:5TGT CTA TGACCA GTA TGT AC3     mg2:5CTG CTT TGG TCA AGA CAT CA3     19

9、91年Jensen等16根據(jù)Mg的粘附蛋白基因設計合成了如下組引物：     mgPa-1 5AGA TGA TGA AAC CCT AAC CCC TTG G3     mgPa-1 5GAC CAT CAA GGT ATT TCT CAA CAG C3     mgPa-1 5CCG AGG GGT TTT CCA TTT TTG C3     用MgPa-1 和MgPa-3成功地擴增出Mg的281bpDNA片段，5個臨床分離株擴增

10、出同樣的產(chǎn)生，而其他支原體和細菌均為陰性，用MgPa-2作探針，對擴增產(chǎn)物經(jīng)Southern eP印跡雜交，均為陽性，證明引物具有特異性，共檢出下降大約有50個Mg細胞。1993年Jensen等17又根據(jù)Mg粘膜蛋白基因設計了另一對引物，即：     mg粘附蛋白基因設計了另一對引物，即：     mgPa-476：5ATG GCG AGC CTA TCT TTG ATC CTT TAA 3     mgPa-903：5TTC ACC TCC CCA CTA CTG TCC

11、TAA TGC3     用來證實和補充引物MgPa-1和MgPa-3所擴增的結(jié)果，其擴增片段為453bp。研究發(fā)現(xiàn)，這兩對Mg粘附蛋白引物的敏感性完全一致。用這種方法檢測99例尿道炎病人的尿道拭子，結(jié)果17例Mg陽性，而用培養(yǎng)法無一例陽性。     1994年 Jensen18擴增Mg粘附蛋白基因序列并測序表明：該序列在Mg條件之間有明顯異質(zhì)性，為此，Jensen等學者根據(jù)原體屬性高度保守區(qū)域16SrRNA的基因序列，設計了種特異性PCR引物，以期檢測臨床標本中所有Mg的感染：其引物序列為：  

12、0;  Mg-1，5GAA TGA CTC TAG CAG GCA ATG GCTG3     Mg-2，5ATT TGC TGC TCA CTT TTA CAA GTT GGCT3     4種臨床標本的實驗結(jié)果表明，Mg粘附蛋白的基因序列不相同，但其165rRN基因序列則是100%同源，將兩種引物PCR結(jié)合，還可在可疑陽性標本中檢測出10-50個Mg基因拷貝以下的Mg基因，即以16SrRNA基因為靶基因的PCR系統(tǒng)在保證長期特異性基礎上更為靈敏。    

13、0;趙季文等19采用Palmer設計的引物，擴增 mg37bpDNA片段，檢測三種人群的Mg，結(jié)果是性亂人群陽性率為25.26%，性病人群為12.33%，而健康人群為3.85%?？追睒s等20采用Jensen設計的MgPa-1和MgPa-3，擴增Mg281bpDNA片段，檢測結(jié)果是性亂婦女Mg檢出率為10.2%，STD患者為4.0%。     1998年，糜祖煌等研究報道了分別以Mg粘附蛋白和16rRNA基因為靶基因建立的二種套式PCR檢測技術(shù)，前者擴增生Mg的374bpDNA片段，后者擴增產(chǎn)生241bpDNA片段。套式PCR不僅提高了靈敏度，而且因采用兩

14、對不同的引物，特性也進一步的得到提高。用這些法檢測40例女性STD患者，發(fā)現(xiàn)Mg陽性12例，陽性率30%，檢出陽性率均高于普通PCR法。      4 小結(jié)     微生物感染診斷的“金標準”是培養(yǎng)法，然而Mg培養(yǎng)成功率極低，有待于對培養(yǎng)基進行進一步的研究和改良，以促進Mg在其中的生長；此外，將細胞株引入Mg的培養(yǎng)可能是一個較好的方法，有必要加強這方面的探索和研究。免疫學檢測方法因支原體種屬間易出現(xiàn)交叉反應以及對抗原、抗體純度要求較高而在實際應用上受到一定限制，若能研究建立快速、靈敏、特異的檢測臨床標本中

15、Mg抗原的方法，則具有較大的實用價值。PCR技術(shù)是一個簡單而又直接的檢測Mg方法，正被日益廣泛地采用，主要用于Mg感染的早期診斷或急性感染的診斷及各種人群中Mg的流行病學研究。但在應用時應注意：臨床標本中Mg含量低，DNA純度不夠，抑制物過多，TaqDNA聚合酶活性低均會引起假陰性，應進一步完善模板DNA的提取技術(shù)；因PCR靈敏度極高，在整個操作過程中均應嚴格避免PCR產(chǎn)物的污染，以減少假陽性。     5參考文獻     Tully JG,D.Taylor-Robinson,RM,Cole,and DL Rose

16、,A newly discoveed mycoplasma in the human urogenital tract.Lancet ,1981,1288     Tully JG,D Tylor-Robinson,DL Rose,et al.Mycoplasma genitalium,a new species from the human urogenital tract.Int J.Syst .Bacteriol,1983,33(2):387     Jensen JS,Hansen HT,Lind K,Is

17、olation of Mycoplasm genitalium strains from the male urethra.J Clin Microbiol,1996,34(2):286     趙季文，王婉云，范寶劍，等。生殖支原體分離培養(yǎng)及流行病學意義的研究，南京鐵道醫(yī)學院學報，1997，16（4）：229     Chanock RM,Fox HH,James WD,et al.Growth of laboratory and naturally occurring stuains of Eaton agen

18、t in monkey kidney tissue culture,Pro Soc Exp Biol Med,1960,105:371     Jensen JS,J Blom and K Lind,Intracellular location&nbs p;of Mycoplasma genitalium in cltured Vero cell as demon-strated by electron microscop            

19、                           生殖支原體檢測方法的研究進展    2008-5-9 13:11:23                &#

20、160;                                y,Int J Exp Path,1994,7591     Furr PM and D Taylor-Robinson,Microm-munofluoresence techn

21、ique for detection of antibody to Mycoplasma genitalium. J Clin Pathol,1984,37(9):1072     Moller BR,D Taylor-Robinson ,and PM Furr,Serological evidence implicating Mycoplasma genitalium inpelvic inflammatory disease,Lancet,1984,1:1102     Taylor-Robinson D,PM

22、 Furr ,and NF Hanna,Micro-biological and serological study of nongonococcal urethritis with special reference to Mycoplasma genitalium.Genitourin Med,1985,61:319     Jensec JS,R Qrsum B Dohn,et al.Mycoplsma genitalium:a cause of male urethritis?Genitourin,Med,1993,69:265  &#

23、160;  中華醫(yī)學會微生物與免疫學會支原體學組，人體支原體感染的實驗診斷技術(shù)，1992年3月     Wang RY-H Shin JW-k: Grandinetti T,et al.High frequency of antibodies to Mycoplasma penetrans in HIV infected patients.Lancet,1992,340:1312     Wang RY-H,Grandinetti T,Tully J et al.Antibodies to M

24、genitalium in patients with AIDS and patients attending sexual transmitted diseases clinics,Abstr93rd Gen Meet Am Soc Microbiol 1993,G-18:165     Hyman HC,Yoger U,Razin S,et al.DNA probes for detection and identification of Mycoplasma pneu-moniae and Mycoplasma genita lium.J Clin Microbiol,1987,25(4):726     Palmer HM,Giloy CB,Furr et al.Development and evaluation of the polymerase chain reaction to detect Mycoplasma genitalium,FEMS Microbiol .Lett,1991,77:199