褪黑素對(duì)大鼠脊髓損傷后iNOS表達(dá)的影響

1、褪黑素對(duì)大鼠脊髓損傷后iNOS表達(dá)的影響                       作者：李東 武永剛 趙爾曼 楊秀玲 段力軍【摘要】  目的：探討褪黑素對(duì)大鼠脊髓損傷后誘生型一氧化氮合酶 (iNOS)表達(dá)的影響。方法：采用改良 Allens撞擊法制備脊髓損傷模型；成年SD大鼠110只隨機(jī)分為假損傷組、損傷組和藥物組3組，其中損傷組和藥物治療組各50只，分5個(gè)時(shí)間點(diǎn)

2、（8小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)、7天、14天）處死；假損傷組10只，于手術(shù)后14天處死，采用HE染色和免疫組化檢測(cè)脊髓損傷后脊髓組織中 iNOS蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與損傷組比較,藥物治療組大鼠損傷后脊髓組織 iNOS表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P0.05)。結(jié)論：褪黑素可通過(guò)抑制 iNOS蛋白表達(dá)對(duì)大鼠脊髓損傷起保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】  脊髓損傷;褪黑素;誘生型一氧化氮合酶    Abstract  Objective：To investigate the influence of Melatonin on the induction of

3、inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression in spinal cord upon spinal cord injury (SCI) in rats. Methods:SCI model was reproduced according to Allens method with modification. One hundred and ten adult SD rats were randomly divided into three groups: sham injury group (n=10), the spinal cord

4、injured group (n=50), and SCI with melatonin treatment group (n=50). For the SCI groups with or without melatonin treatment, rats were killed at different time (8h, 24h, 72h, 7d, 14d). And rats of sham injury group were killed at 14d post SCI operation. HE staining and Immunohistochemistry method we

5、re employed to detect iNOS expression in spinal cord. Results:Melatonin treatment significantly reduces the induction of iNOS expression in spinal cord of rats subjected to SCI operation(P<0.05 or 0.01). Conclusion:The result suggests that melatonin may exert protective effect on spinal cord inju

6、ry through inhibiting the induction of iNOS expression.    Key words  Spinal cord injury; Melatonin; Inducible nitric oxide synthase (iNOS)脊髓損傷 (spinal cord injury, SCI)后的繼發(fā)性損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程, 包括興奮性氨基酸、氧化性代謝產(chǎn)物和致炎細(xì)胞因子等多種效應(yīng)因子的釋放，可導(dǎo)致脊髓組織不可逆損害，表現(xiàn)為不同程度的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和自主神經(jīng)功能障礙。一氧化氮 (NO)作為在體內(nèi)廣泛存在并具有多

7、重生物學(xué)效應(yīng)的信號(hào)介質(zhì)可能起很重要的作用，體內(nèi)NO由一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase, NOS)生成,NOS廣泛存在于包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的各系統(tǒng)中。NOS有3種亞型,其中誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)產(chǎn)生的 NO量大、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),通過(guò)直接引起過(guò)氧化損傷或作為信號(hào)介質(zhì)介導(dǎo)其它炎癥因子而起作用，表現(xiàn)出強(qiáng)的神經(jīng)毒性。褪黑素(5-甲氧基-N-乙酰色胺,melatonin,MT)主要是由松果體分泌的激素,能直接清除自由基,減輕細(xì)胞的過(guò)氧化損害1。本試驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察大白鼠脊髓損傷后腹腔注射褪黑素對(duì)iNOS表達(dá)的影響，

8、分析褪黑素在脊髓繼發(fā)性損傷中的可能作用，為臨床治療繼發(fā)性脊髓損傷提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供資料。1  材料與方法1.1  主要儀器與試劑  Olympus光學(xué)顯微鏡圖像采集系統(tǒng)顯微圖像分析系統(tǒng)(日本)，褪黑素購(gòu)自晶美北京分公司(瑞士Alexis公司生產(chǎn))，兔抗大鼠iNOS多克隆抗體免疫組化試劑盒、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司提供。1.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組  健康成年SD大鼠110只,雌雄各半,體重250330g。隨機(jī)分為假損傷組、損傷組和藥物治療組3組。其中損傷組和藥物治療組各50只，分5個(gè)時(shí)間點(diǎn)

9、（損傷后8小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)、7天、14天）處死；假損傷組10只，于手術(shù)后14天處死。藥物治療組術(shù)后立即給予褪黑素每天50mg/kg，腹腔注射，連用7天;而假手術(shù)組和損傷組給予等量含5%無(wú)水乙醇的生理鹽水。1.3  動(dòng)物模型的建立  采用改良Allen's撞擊法，10%的水合氯醛按300mg/kg體重腹腔麻醉，俯臥位固定，常規(guī)碘伏消毒鋪巾，以T10棘突為中心行背側(cè)正中縱切約2.5cm,行T9、10椎板切除術(shù)，暴露硬脊膜，在硬膜表面墊一彎曲度與脊髓表面一致的塑料墊片,用重10g金屬棒從4.0cm高處沿中空玻璃管垂直自由落下撞擊脊髓，造成急性脊髓損傷，假手術(shù)組只做

10、T9、10椎板切除術(shù)，顯露硬脊膜，不用重物撞擊。造模成功的標(biāo)志為大鼠的雙下肢呈回縮性撲動(dòng)、尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動(dòng)。造模成功的動(dòng)物每天給予截癱護(hù)理，每日人工排尿排便3次。1.4  取材和HE染色  將各組大鼠在各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉下開(kāi)胸,經(jīng)左心室-主動(dòng)脈插管心臟灌注固定,先用等滲鹽水約250mL沖洗至流出澄清液,再用4%多聚甲醛約200mL灌流至動(dòng)物完全僵硬,完整取出包括損傷段及其上下約1cm脊髓組織。迅速用4%甲醛液進(jìn)行固定過(guò)夜，脫水，石蠟包埋，4m連續(xù)切片，做HE染色,觀(guān)察病理改變。1.5  免疫組織化學(xué)染色及圖像分析  切片脫蠟水化后,用3%過(guò)氧化氫室溫孵育

11、 10分鐘,滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶;5%BSA室溫封閉 20分鐘;加入180稀釋兔抗大鼠iNOS多克隆抗體 4過(guò)夜;滴加生物素化羊抗兔IgG 37 20分鐘;滴加SABC 37孵育 20分鐘;DAB顯色,蘇木素復(fù)染,封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。鏡下觀(guān)察陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕黃色,每組抽取一張切片，每張切片任選5個(gè)高倍視野,應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定iNOS陽(yáng)性細(xì)胞百分率和平均灰度值,取其平均值。1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì),各組數(shù)據(jù)采用x±s表示,陽(yáng)性細(xì)胞百分率和平均灰度值，采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

12、2  結(jié)果2.1  HE染色  假損傷組表現(xiàn)為正常脊髓組織的特點(diǎn),顯示灰白質(zhì)交界清楚，神經(jīng)元豐富，胞體大，核仁明顯。損傷組傷后8小時(shí)見(jiàn)灰、白質(zhì)界限不清，有大量紅細(xì)胞滲出，神經(jīng)細(xì)胞變性；傷后24小時(shí)后大量出血、明顯水腫、神經(jīng)細(xì)胞變性、神經(jīng)元核濃聚；傷后72小時(shí)部分出血灶融合成小片狀，水腫明顯，神經(jīng)元變性，神經(jīng)元固縮、壞死、溶解，部分出現(xiàn)壞死;傷后7天充血水腫減輕，灰、白質(zhì)有多個(gè)出血灶融合；神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞變性，部分崩解，神經(jīng)元數(shù)量減少；灰、白質(zhì)區(qū)均有空洞形成，大量小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管形成;傷后14天充血水腫消退，灰、白質(zhì)區(qū)均有空洞，神經(jīng)膠質(zhì)增生明顯

13、，較多結(jié)締組織增生。藥物治療組與損傷組相比，各時(shí)間點(diǎn)組織水腫較輕，出血較少，空洞形成較少，神經(jīng)元細(xì)胞較多，脊髓損傷均有不同程度的減輕。見(jiàn)圖1、圖2。    圖1  損傷組24小時(shí)（略）   圖2  藥物治療組24小時(shí)（略）2.2  免疫組化檢測(cè)結(jié)果  假損傷組未見(jiàn)iNOS蛋白表達(dá)。脊髓損傷后,損傷組神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等中均可見(jiàn)不同程度的iNOS表達(dá),以神經(jīng)元為主。損傷后8小時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞有表達(dá),損傷后1天、3天表達(dá)增加明顯,7天達(dá)高峰,14天逐漸降低。與損傷組比較,褪黑素治療組各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織iN

14、OS蛋白表達(dá)降低，高峰亦發(fā)生在損傷后7天，陽(yáng)性細(xì)胞百分率均顯著降低，平均灰度值均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。1         表1  大鼠脊髓iNOS免疫組化表達(dá)陽(yáng)性指標(biāo)測(cè)定（略）注：與同時(shí)間損傷組比較P<0.05,與同時(shí)間損傷組比較P<0.013  討論    SCI后的繼發(fā)性損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程,包括興奮性氨基酸、氧化性代謝產(chǎn)物和致炎細(xì)胞因子等多種效應(yīng)因子的釋放，可導(dǎo)致脊髓組織不可逆損害。研究認(rèn)為急性脊髓損傷后脊髓局部缺血、壞死,引

15、起多種炎癥介質(zhì)釋放,并引發(fā)興奮毒性級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)iNOS高表達(dá),產(chǎn)生過(guò)量的具有神經(jīng)毒性作用的NO,是造成急性脊髓損傷后繼發(fā)性神經(jīng)元死亡的直接因素2。NO作為在體內(nèi)廣泛存在并具有多重生物學(xué)效應(yīng)的信號(hào)介質(zhì)在SCI的繼發(fā)性損傷中可能起很重要的作用，體內(nèi)NO由NOS催化生成,NOS廣泛存在于包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的各系統(tǒng)中。一氧化氮合酶有三種異構(gòu)體，分別為內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶(eNOS)、神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS)和誘生型一氧化氮合酶（iNOS）。eNOS和nNOS合稱(chēng)固有型一氧化氮合酶（cNOS)，cNOS的活性為鈣依賴(lài)性，在正常生理?xiàng)l件下，催化合成基礎(chǔ)量的NO，抑制血小板聚集和粘附，從而維持

16、血管舒張狀態(tài)，維持組織器官血流量在生理水平3;而iNOS的活性為非鈣依賴(lài)性，在正常生理狀態(tài)下含量極微4。組織細(xì)胞急性缺血早期，谷氨酸釋放增加，激活NMDA受體，受體介導(dǎo)性鈣內(nèi)流增多，激活cNOS使NO生成增加。少量增加可以對(duì)抗創(chuàng)傷和缺血應(yīng)激引起的血管收縮。隨著損傷區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、炎性因子產(chǎn)生，轉(zhuǎn)錄因子NF-KB活化，使iNOS表達(dá)增加5,iNOS的活性為非鈣依賴(lài)性，一旦合成，持續(xù)催化生成大量的NO。體內(nèi)大量的NO導(dǎo)致自由基O-·2生成增多，或與自由基O-·2反應(yīng)生成作用更強(qiáng)的自由基ONOO-6。ONOO-氧化線(xiàn)粒體Mn-SOD使O-·2進(jìn)一步積聚增加7。

17、0;   褪黑素（MT）主要由松果體分泌,是存在于人體內(nèi)的重要神經(jīng)內(nèi)分泌活性物質(zhì),具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律等重要功能。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MT具有很強(qiáng)的清除羥自由基和過(guò)氧自由基作用8,不僅可直接清除OH-、O-·2等,還可通過(guò)增加抗氧化酶的活性發(fā)揮抗氧化作用,是目前已知體內(nèi)最強(qiáng)的抗氧化成分。MT清除氧自由基的活性不需要其受體的調(diào)節(jié),MT抗氧化能力至少部分是通過(guò)直接清除自由基9。MT作為松果體分泌的激素,它具有高脂溶性和水溶性,能通過(guò)核膜進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮作用,能使脫氧核糖核酸免受到氧的毒性作用10。因此MT不僅保護(hù)膜脂質(zhì),而且保護(hù)蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞的其他成分。McCann等11發(fā)現(xiàn)N

18、O可以激起松果體分泌MT增加，消除NO，減少NO神經(jīng)毒性，MT尚能顯著抑制iNOS基因相關(guān)表達(dá)。亦有研究表明,褪黑素還可直接清除一氧化氮12。NOS是產(chǎn)生自由基的酶之一,可促進(jìn)一氧化氮的合成,一氧化氮與過(guò)氧化硝酸鹽結(jié)合產(chǎn)生自由基。褪黑素能抑制iNOS的產(chǎn)生,從而減少毒性一氧化氮的生成。還有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可通過(guò)抑制谷氨酸引起的NO釋放增加,對(duì)抗其神經(jīng)毒性,保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受損傷,為損傷后神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)創(chuàng)造了有利條件13。    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脊髓損傷后,損傷組神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等中均可見(jiàn)不同程度的iNOS表達(dá),以神經(jīng)元為主。損傷后8小時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞有表達(dá),損傷后1天增

19、加明顯,7天達(dá)高峰,14天逐漸降低。與損傷組比較,褪黑素組各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織iNOS蛋白的表達(dá)降低，高峰前移，發(fā)生在損傷后3天，陽(yáng)性細(xì)胞百分率均顯著降低，平均灰度值均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療組大鼠脊髓組織病理改變較輕。提示褪黑素可能通過(guò)抑制脊髓組織中iNOS的表達(dá)，減輕脊髓損傷后的繼發(fā)性損害，起到保護(hù)脊髓的作用。但對(duì)抑制iNOS的具體機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步的研究?！尽?#160; 1 Russel JB, Dun XT, Carmen O, et al. Action of melatonin in the reduction of oxidation stressJ. Biomed

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