堿性成纖維細(xì)胞因子在博萊霉素致肺纖維化肺血管損傷中的作用

1、堿性成纖維細(xì)胞因子在博萊霉素致肺纖維化肺血管損傷中的作用         08-01-14 15:12:00     編輯：studa20             作者：劉華，陳利萍，朱新菊，賀永鋒，趙杰，劉新社【摘要】  目的 探討堿性成纖維細(xì)胞因子(bFGF)在博萊霉素(BLM)致大鼠肺纖維化肺組織中的表達(dá)及其在肺血管損傷中的作用。方法 于大鼠

2、氣管內(nèi)注射BLM以復(fù)制其肺纖維化模型,應(yīng)用bFGF多克隆抗體按SABC法行免疫組織化學(xué)染色,定量圖像分析。結(jié)果 BLM組動(dòng)物支氣管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)、支氣管和肺小動(dòng)脈肌層以及肺泡巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)可見較多棕黃色細(xì)顆粒狀bFGF陽性表達(dá)產(chǎn)物,顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 在BLM致大鼠肺纖維化過程中bFGF表達(dá)上調(diào)，提示bFGF可能參與肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病過程。 【關(guān)鍵詞】  堿性成纖維細(xì)胞因子；博萊霉素；肺纖維化；血管損害；免疫組化The role of bFGF in vascular injury ofBLMinduced pulmonary fibrosisABSTRACT

3、: Objective  To explore the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF) in pulmonary tissues of rats with bleomycininduced pulmonary fibrosis and the role of bFGF in vascular injury. Methods  Pulmonary fibrosis was induced in rats by intratracheal injection of bleomycin(BLM). Lung e

4、xpression of bFGF proteins was assessed by SABC immunohistochemistry using bFGF monoclonal antibody and quantitative image analysis. Results  The expression of bFGF in the lung tissues of BLM group was mainly distributed in bronchiole epithelial cells, muscular layers of bronchi and arterioles,

5、 and alveolar macrophage. It was higher than that in control group, with significant difference (P<0.05). Conclusion  The upregulation expression of bFGF in the BLMinduced pulmonary fibrosis indicates that it directly participates in the process of pulmonary fibrosis.KEY WORDS: basic fibrobl

6、ast growth factor (bFGF); bleomycin; pulmonary fibrosis; vascular injury; immunohistochemical method肺間質(zhì)纖維化是一種病因各異、表現(xiàn)相似的疾病譜，是各種彌漫型肺間質(zhì)疾病的最終表現(xiàn)形式，其主要病理特點(diǎn)是肺內(nèi)成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過多聚集。肺間質(zhì)纖維化一旦形成，將不可逆地導(dǎo)致嚴(yán)重的甚至致命的呼吸循環(huán)功能障礙。有關(guān)肺纖維化發(fā)生的機(jī)理已有了較為深入的研究，但纖維化過程中肺組織、血管的損傷機(jī)制尚不清楚。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFG

7、F)具有強(qiáng)大的促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖的作用1，是各種原因所致肺間質(zhì)纖維化形成機(jī)制研究的重點(diǎn)對(duì)象。在本研究中，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合圖像分析，觀察博萊霉素(bleomycin, BLM)致大鼠肺組織纖維化中肺組織bFGF的表達(dá)，從血管損傷方面探討bFGF在BLM致肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制中的作用。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組  體重200-250g的健康雌性Wistar大鼠60只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為BLM組和生理鹽水對(duì)照組，每組30只。1.2  肺纖維化模型的建立  BLM組用戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔

8、注射麻醉大鼠，在無菌操作下作頸部正中切口，逐層暴露氣管，用lmL注射器(前帶7號(hào)針頭)抽取含BLM(5mg/kg)的生理鹽水0.2-0.3mL，經(jīng)兩氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管。將大鼠直立，繼續(xù)朝向心端進(jìn)針約1.0-1.5cm，回抽出空氣并無阻力后，將藥液注入氣管，旋轉(zhuǎn)動(dòng)物，使藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻。縫合傷口。對(duì)照組，在同樣條件下，向氣管內(nèi)注入相同體積的生理鹽水。兩組動(dòng)物分別于氣管內(nèi)灌注后3、7、14、21、28d隨機(jī)處死動(dòng)物各6只。1.3  肺組織病理標(biāo)本的制作  戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。常規(guī)消毒后開胸，暴露心肺，于右心室插入與輸液器相連的針頭，

9、左心耳剪一約2mm左右切口，向右心室內(nèi)灌注PBS(pH 7.4)沖洗血管至雙肺呈白色膠凍狀。結(jié)扎左主支氣管，經(jīng)氣管向右肺注入40g/L多聚甲醛6mL，使胸膜展開，結(jié)扎氣管后右肺置40g/L多聚甲醛中固定。上、中、下葉各取材一塊，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片(5m)。1.4  bFGF免疫組織化學(xué)染色  采用免疫組化SABC法，bFGF多克隆抗體購(gòu)自博士德公司。免疫組織化學(xué)染色按試劑盒說明書進(jìn)行：石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水；3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2(蒸餾水新鮮配制)室溫5min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗，3min×3；復(fù)合消化液1min，蒸餾水洗，3min×3；正常

10、工作血清封閉液室溫10min，甩去多余液體，不洗；兔抗大鼠bFGF多克隆抗體(IgG型)，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)選擇工作濃度為1100，4過夜，0.01mol/L PBS洗，3min×3；生物素化山羊抗兔IgG抗體，37 20min，0.01mol/L PBS洗，3min×3。SABC試劑37 20min，0.01mol/L PBS洗，5min×4；DBA室溫顯色，蒸餾水洗；蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。各組均設(shè)陰性對(duì)照切片，以0.01mol/L PBS代替一抗。1.5  bFGF的定量分析  使用北京航空彩色病理圖像分析系統(tǒng)。將待測(cè)切片放置在連接計(jì)算機(jī)的顯微鏡下觀察。每組6只動(dòng)物，每只動(dòng)物取3張組織切片,每張切片取5個(gè)視野(上、中、下、左、右)，于高倍鏡下(×400)檢測(cè)bFGF平均吸光度值(A)。1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，各組間進(jìn)行t檢驗(yàn)和相關(guān)分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2  結(jié)果2.1  肺組織的病理變化  大體標(biāo)本：對(duì)照組雙肺呈粉紅色，表面光滑,開胸后迅速萎陷；BLM組可見雙肺表面灶狀分布的出血點(diǎn)，隨時(shí)間延長(zhǎng)上述改變由新鮮