光學(xué)顯微技術(shù)

1、第二章第二章 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù) 第二章第二章 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)l光學(xué)顯微鏡的發(fā)展歷程光學(xué)顯微鏡的發(fā)展歷程l光學(xué)顯微鏡的成象原理光學(xué)顯微鏡的成象原理l光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和光路圖光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和光路圖l顯微鏡的重要光學(xué)參數(shù)顯微鏡的重要光學(xué)參數(shù)l樣品制備樣品制備1. 1. 光學(xué)顯微鏡的發(fā)展歷程光學(xué)顯微鏡的發(fā)展歷程l1590年，荷蘭的詹森父子(Hans and zachrias Janssen) 制造出第一臺(tái)原始的、放大倍數(shù)約為20倍的顯微鏡。l16l0年，意大利物理學(xué)家伽利略(Galileo)制造了具有物鏡、目鏡及鏡筒的復(fù)式顯微鏡。 l1665年，英國(guó)物理學(xué)家羅伯特胡克(Robert

2、 Hooke)用左圖這臺(tái)復(fù)式顯微鏡觀察軟木塞時(shí)發(fā)現(xiàn)了小的蜂房狀結(jié)構(gòu)，稱為“細(xì)胞”，由此引起了細(xì)胞研究的熱潮。l 1684年，荷蘭物理學(xué)家惠更斯(Huygens)設(shè)計(jì)并制造出雙透鏡目鏡惠更斯目鏡，是現(xiàn)代多種目鏡的原型。這時(shí)的光學(xué)顯微鏡已初具現(xiàn)代顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)(右圖)。（左）1665年 R. Hoock用來(lái)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡，(右)1848年的顯微鏡。1. 1. 光學(xué)顯微鏡的發(fā)展歷程光學(xué)顯微鏡的發(fā)展歷程l在顯微鏡的發(fā)展史中，貢獻(xiàn)最為卓著的是德國(guó)的物理學(xué)家、數(shù)學(xué)家和光學(xué)大師恩斯特阿貝(Ernst Abbe)。l他提出了顯微鏡的完善理論，闡明了成像原理、數(shù)值孔徑等問題，在1870年發(fā)表了有關(guān)放大理

3、論的重要文章。l兩年后又發(fā)明了油浸物鏡，并在光學(xué)玻璃、顯微鏡的設(shè)計(jì)和改進(jìn)等方向取得了光輝的業(yè)績(jī)。2. 光學(xué)顯微鏡的成象原理光學(xué)顯微鏡的成象原理l2.1 衍射的形成衍射的形成l2.2 阿貝成像原理阿貝成像原理2.1 2.1 衍射的形成衍射的形成l物理光學(xué)把光視為一種電磁波，具有波粒二象性，即波動(dòng)性和粒子性。由于光具有波動(dòng)性質(zhì)，使得光波相互之間發(fā)生干涉作用，產(chǎn)生衍射現(xiàn)象。狹縫實(shí)驗(yàn)l屏幕上的P1點(diǎn)到狹峰上邊緣的距離和它到狹峰下邊緣的距離之差為一個(gè)波長(zhǎng)。l從狹峰上緣和從狹峰下緣發(fā)出的兩列光波在P1點(diǎn)相互增強(qiáng)，但這兩列光波不過(guò)是從連線b上發(fā)出的無(wú)數(shù)光波中的一對(duì)，其他任意兩列光波到達(dá)P1點(diǎn)的波程差均小于一

4、個(gè)波長(zhǎng)。l整個(gè)狹峰內(nèi)發(fā)出的光波的累計(jì)相干效果，是在P1點(diǎn)兩側(cè)造成一個(gè)光強(qiáng)的低谷，P1點(diǎn)位于谷底位置。l相反，在P2點(diǎn)處，從狹縫上緣和下緣發(fā)出的光波的波程差1 個(gè)波長(zhǎng)，P2成為相干增強(qiáng)區(qū)的中心，稱為第一級(jí)衍射極大值。衍射結(jié)果衍射結(jié)果點(diǎn)光源通過(guò)透鏡產(chǎn)生的埃利斑第一暗環(huán)半徑 式中 n為介質(zhì)折射率，照明光波長(zhǎng)，透鏡孔徑半角，M透鏡放大倍數(shù)說(shuō)明埃利斑半徑與照明光源波長(zhǎng)成正比，與透鏡數(shù)值孔徑成反比 sin61. 00nMR 由斑點(diǎn)光源衍射形成的埃利斑（a）及其光強(qiáng)分布圖（b）衍射使物體上的一個(gè)點(diǎn)在成像的時(shí)候不會(huì)是一個(gè)點(diǎn)，而是一個(gè)衍射光斑。如果兩個(gè)衍射光斑靠得太近，它們將無(wú)法被區(qū)分開來(lái)。2.2 2.2 阿貝

5、成像原理阿貝成像原理l對(duì)于周期性結(jié)構(gòu)的物體，圖像的形成用阿貝成像原理來(lái)解釋。l光線通過(guò)細(xì)小的網(wǎng)孔時(shí)要發(fā)生衍射，衍射光線向各個(gè)方向傳播，凡是光程差滿足 k=0，1，2，的，互相加強(qiáng)。同一方向的衍射光則成為平行光束。l平行光束通過(guò)物鏡在后焦面上會(huì)聚；形成衍射花樣。衍射花樣上的某個(gè)衍射斑點(diǎn)是由不同物點(diǎn)的同級(jí)衍射光相干加強(qiáng)形成的；同一物點(diǎn)上的光由于衍射分解，對(duì)許多衍射斑點(diǎn)有貢獻(xiàn)。l從同一物點(diǎn)發(fā)出的各級(jí)衍射光，在產(chǎn)生相應(yīng)的衍射斑點(diǎn)后繼續(xù)傳播，在象平面上又相互干涉，形成物象k阿貝成像原理l阿貝成像原理可以簡(jiǎn)單地描述為兩次干涉作用：平行光束受到有周期性特征物體的散射作用形成衍射譜，各級(jí)衍射波通過(guò)干涉重新在像

6、平面上形成反映物的特征的像。物與象之間的相似性 l物象是由直射光和衍射光互相干涉形成的，不讓衍射光通過(guò)就不能成象，參與成象的衍射斑點(diǎn)愈多，則物象與物體的相似性愈好。3. 3. 光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和光路圖光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和光路圖4 4 顯微鏡的重要參數(shù)顯微鏡的重要參數(shù)l4.1 數(shù)值孔徑數(shù)值孔徑l4.2 分辨率分辨率l4.3 放大率和有效放大率放大率和有效放大率l4.4 光學(xué)透鏡的象差光學(xué)透鏡的象差4.1 4.1 數(shù)值孔徑數(shù)值孔徑l數(shù)值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（n）和半孔徑角（）的正弦之乘積。NA= nsinl孔徑角是物鏡光軸上的物點(diǎn)與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度?？讖?/p>

7、角越大，進(jìn)入物鏡的光通亮就越大，分辨率越高?？讖浇桥c物鏡的有效直徑成正比，與焦點(diǎn)的距離成反比。l 根據(jù)阿貝成像原理，衍射光線反映了物體形貌的細(xì)節(jié)，因此一個(gè)物鏡要反映物體的細(xì)節(jié)，必須能夠接受盡量多的高階衍射光線。 l物鏡接收衍射光線的能力也強(qiáng)烈的依賴于在樣品與鏡頭之間的介質(zhì)。因此，數(shù)值孔徑的概念更加能夠有效的描述物鏡的成像能力。 4.2 4.2 分辨率分辨率瑞利判據(jù)：兩埃利斑中心間距等于第一暗環(huán)半徑R。此時(shí), 兩中央峰之間疊加強(qiáng)度比中央峰最大強(qiáng)度低19，因此肉眼仍能分辨是兩個(gè)物點(diǎn)的像 分辨本領(lǐng)l此時(shí), 樣品上相應(yīng)的兩個(gè)物點(diǎn)間距離r。定義為透鏡能分辨的最小距離，也就是透鏡的分辨本領(lǐng)。lr。 R。

8、Ml分辨本領(lǐng)是由物鏡的NA值與照明光源的波長(zhǎng)兩個(gè)因素決定，NA值越大，照明光線波長(zhǎng)越短，分辨率就越高。 sin61. 00nr 4.3 4.3 放大率和有效放大率放大率和有效放大率l由于經(jīng)過(guò)物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率應(yīng)該是物鏡放大率和目鏡放大率1的乘積： =1l顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。l當(dāng)選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時(shí)，顯微鏡不能分清物體的微細(xì)結(jié)構(gòu)，此時(shí)即使過(guò)度地增大放大倍率，得到的也只能是一個(gè)輪廓雖大但細(xì)節(jié)不清的圖像，稱為無(wú)效放大倍率。4.4 4.4 光學(xué)透鏡的象差光學(xué)透鏡的象差l（1 ）球面象差（簡(jiǎn)稱球差）邊緣與中心部分的折射光不能通過(guò)會(huì)聚相交于一點(diǎn)

9、光學(xué)透鏡的象差光學(xué)透鏡的象差l（2）色象差 由于組成白光的各色光波長(zhǎng)不同，折射率不同，因而成象的位置也不同 光學(xué)透鏡的象差光學(xué)透鏡的象差l（3）象域彎曲。 垂直于光軸的直立的物體經(jīng)過(guò)透鏡后臺(tái)形成一彎曲的象面，稱為象域彎曲 象域彎曲是幾種象差綜合作用的結(jié)果 5 5樣品制備樣品制備l5.1取樣取樣l5.2 鑲樣鑲樣l5.3 磨光磨光l5.4 拋光拋光l5.5腐蝕腐蝕5.15.1取樣取樣l取樣應(yīng)選擇有代表性的部位l對(duì)于軟材料，可以用鋸、車、刨等加工方法；l對(duì)于硬材料，可以用砂輪切片機(jī)切割或電火花切割等方法；l對(duì)于硬而脆的材料，如白口鑄鐵，可以用錘擊方法；l在大工件上取樣，可用氧氣切割等方法。 5.2

10、 5.2 鑲樣鑲樣l用專門的鑲樣機(jī)，在合適的加熱溫度和壓力下，將試樣鑲嵌在固化的樹脂或塑料基體中。l還可以采用機(jī)械鑲嵌法，即用夾具夾持試樣。5.3 5.3 磨光磨光l金相試樣的磨光除了要使表面光滑平整外，更重要的是應(yīng)盡可能減少表層損傷。l每一道磨光工序必須除去前一道工序造成的變形層，而不是僅僅把前一道工序的磨痕除去。l手工磨光時(shí)，本道工序的磨痕應(yīng)與上一道工序的磨痕方向垂直，這樣可以使試樣磨面保持平整并平行于原來(lái)的磨面。5.4 5.4 拋光拋光（1）機(jī)械拋光。粗拋，精拋。（2）電解拋光。電解拋光時(shí)，在試樣表面上形成一層具有較高電阻的薄膜，試樣凸起部分的膜比凹下部分薄，膜越薄電阻越小，金屬溶解速度越快，從而使凸起部分漸趨平坦。（3）化學(xué)拋光?；瘜W(xué)拋光的原理與電解拋光類似，是化學(xué)藥劑對(duì)試樣表面不均勻溶解的結(jié)果。 5.55.5腐蝕腐蝕（1）化學(xué)腐蝕。l純金屬及單相合金的腐蝕是一個(gè)化學(xué)溶解的過(guò)程。由于晶界上原子排列不規(guī)則，具有較高的自由能，所以晶界易受腐