DNA生物合成——復(fù)制

1、DNA生物合成復(fù)制清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件2DNA的合成主要包括三個方面： S期的DNA復(fù)制（replication） DNA損傷時的修復(fù) 某些病毒以RNA為模板合成DNA以DNA為模板復(fù)制(replication) 指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復(fù)制親代DNADNA目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件3v本章主要內(nèi)容v 復(fù)制的基本規(guī)律v 參與DNA復(fù)制的酶類和其他物質(zhì)v 復(fù)制的過程v 反轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式 v DNA的損傷與修復(fù)目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件413.1 復(fù)制的基本規(guī)律(Basic Rules of DNA Rep

2、lication)v復(fù)制的方式 半保留復(fù)制(semi-conservative replication)v雙向復(fù)制(bidirectional replication)v半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuous replication) 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件51半保留復(fù)制 DNA生物合成時，親代雙鏈DNA解開為兩條單鏈，以拆開后的雙鏈中的每一條鏈分別作為模板，按堿基配對原則，分別合成與兩條模板互補的兩條新鏈。每一條新鏈和一條舊鏈構(gòu)成一分子DNA雙鏈（即子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈為新合成的），這樣，就形成了既彼此全同又和原來DNA分子相同的兩個完整

3、的DNA分子。DNA的這種合成方式稱為半保留復(fù)制。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件6AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件7vDNA復(fù)制理論上有三種形式：目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件8v密度梯度實驗結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)

4、與分子生物學(xué)課件9按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。v半保留復(fù)制的意義:目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件102雙向復(fù)制原核生物復(fù)制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件11oriterA BCA. 環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點；B. 復(fù)制中的兩個復(fù)制叉；C. 復(fù)制接近終止點(termination, ter)。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件12真

5、核生物基因組龐大而復(fù)雜，由多個染色體組成，全部染色體均需復(fù)制，每個染色體又有多個起始點，稱為多點雙向復(fù)制。即每個起始點產(chǎn)生兩個移動方向相反的復(fù)制叉，復(fù)制完成時，復(fù)制叉相遇并匯合連接。習(xí)慣上把兩個相鄰起始點之間的一段DNA稱為一個復(fù)制子（replicon）。 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件133、復(fù)制的半不連續(xù)性目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件14 順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進行的，順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為前導(dǎo)鏈這股鏈稱為前導(dǎo)鏈(leading strand)。 另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著另一股鏈因為復(fù)制的方向與解

6、鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為后隨鏈解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為后隨鏈(lagging strand)。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段片段(okazaki fragment)。 前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。不連續(xù)性。 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件1513.2 參與DNA復(fù)制的酶類和其他物質(zhì) (Enzyme and Other Substances Involved in DNA Replication)v底物(substrate): d

7、ATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP；v 聚合酶(polymerase):依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為 DNA-pol；v模板(template): 解開成單鏈的DNA母鏈；v 引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可依次聚合；v其他的酶和蛋白質(zhì)因子。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件161、解螺旋酶（helicase）利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件172、單鏈結(jié)合蛋白（single strand binding protein，SSB）在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整。4、拓撲異

8、構(gòu)酶能夠引起DNA的拓撲異構(gòu)反應(yīng)的一類酶，其特點是既能水解 ，又能連接磷酸二酯鍵。3、引物酶促進引物合成的酶。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件18108局部解鏈后拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶v拓撲異構(gòu)酶分類目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件19拓撲異構(gòu)酶切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當時候封閉切口，DNA進入松弛狀態(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓撲異構(gòu)酶切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端， DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件205、DNA聚合酶v 全稱：依賴DNA的DNA聚合酶 (DNA-

9、dependent DNA polymerase)。v 簡稱：DNA-pol。v 活性：53 的聚合活性。35核酸外切酶活性。53核酸外切酶活性。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件21目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件22 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | | 3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5?目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件23（1）原核生物DNA聚合酶vDNA-pol vDNA-pol vDNA-pol vDNA-pol vDNA-pol 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)

10、生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件24v DNA-pol 是大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的第一個DNA聚合酶，也稱為Kornberg酶?；钚裕?53 聚合活性。 35核酸外切酶活性。 53核酸外切酶活性。功能：對復(fù)制中的錯誤進行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進行填補。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件25323個氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 604個氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N 端C 端木瓜蛋白酶DNA-pol vKlenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學(xué)研究常用的工具酶。 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件26v DNA-pol 為多亞基酶，有

11、53聚合活性及35核酸外切酶活性。在無DNA聚合酶和DNA聚合酶存在時起作用，真正的功能尚不清楚。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件27v DNA-pol 是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件28（2）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol 起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件29目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物

12、學(xué)課件30（3）復(fù)制的保真性v 復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能準確傳代的基本保證。 復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇。v 此外還需酶學(xué)的機制來保證復(fù)制的保真性。 核酸外切酶活性在復(fù)制中辨認、切除錯配堿基并加以校正。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件31v DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價（氫鍵）與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。v嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件32DNA pol 的校讀功能的校讀功能v DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。v

13、 堿基配對正確， DNA-pol 不表現(xiàn)活性。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件33v遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；v聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能；v復(fù)制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。vDNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機制：目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件34（6）DNA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口。連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。v作用方式：目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件35vDNA連接酶的作用：對單獨存在的DNA單鏈沒有連接作用。在DNA不連續(xù)合成、重組及損傷修

14、復(fù)過程中，DNA連接酶有重要作用。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件3613.3 DNA復(fù)制的基本過程和機制 (The Process of DNA Replication)1原核生物DNA的復(fù)制（1）復(fù)制起始DNA解開成單鏈，提供模板。形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件37目 錄E.coli 復(fù)制起始點oriC 的辨認清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件38 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓撲異構(gòu)酶引物酶SSB3535引發(fā)體含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)

15、生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件393535引物3 HO5引物酶引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件40（2）復(fù)制的延長前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制，后隨鏈不連續(xù)復(fù)制。在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件41v前導(dǎo)鏈的合成：前導(dǎo)鏈的子鏈沿著53方向可以連續(xù)地延長。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件42v后隨鏈的合成目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件43v同一復(fù)制叉上前導(dǎo)鏈和后隨鏈由相同的DNA-pol催化延長。 目 錄清華版教材醫(yī)

16、學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件44（3）復(fù)制的終止復(fù)制的終止包括引物RNA的切除、空缺部位的填補及最后由連接酶連接切口。 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件45復(fù)制過程簡圖目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件462、真核生物DNA的復(fù)制真核染色體復(fù)制只在S期發(fā)生一次。 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件47（1）復(fù)制的起始分兩步進行：即復(fù)制基因的選擇和復(fù)制起點的激活。 v真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動。 v復(fù)制的起始需要DNA-pol （引物酶活性）和pol （解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復(fù)制因子(

17、replication factor, RF)。 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件48前復(fù)制復(fù)合物及復(fù)制叉的形成 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件49（2）復(fù)制的延長DNA-pol 和pol 分別具有解螺旋酶和引物酶活性。在復(fù)制叉及引物生成后，DNA-pol 通過PCNA的協(xié)同作用，逐步取代pol ，在RNA引物的3-OH基礎(chǔ)上連續(xù)合成前導(dǎo)鏈。后隨鏈引物也由pol 催化合成，然后由PCNA協(xié)同，pol 置換pol ，繼續(xù)合成DNA子鏈。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件503553前導(dǎo)鏈3535親代DNA后隨鏈引物核小體v真核生物復(fù)制叉的延長： 目 錄清華版教

18、材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件51（3）復(fù)制的終止和端粒酶v染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。v染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件5253355335+53333555目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件53線性DNA復(fù)制的末端 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件54端粒(telomere) 指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。v端粒的功能：v維持染色體的穩(wěn)定性。v維持DNA復(fù)制的完整性。v端粒的結(jié)構(gòu)特點：v由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。v末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基的短序列。目 錄

19、清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件55端粒酶(telomerase)：由RNA和蛋白質(zhì)組成的一種核糖核蛋白，能識別和結(jié)合端粒序列。端粒酶催化作用的爬行模型 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件5613.4 反轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式 (Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways)高等生物的遺傳物質(zhì)大多數(shù)是雙鏈DNA，通常采用半保留方式復(fù)制。而某些病毒的基因組是RNA。少數(shù)低等生物，如感染型M13噬菌體只含單鏈DNA。另外，原核生物的質(zhì)粒，真核生物的線粒體DNA，都是染色體以外存在的DNA。這些非染色體基因組，采用特殊的方式進行復(fù)制

20、。 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件571、RNA指導(dǎo)的DNA合成反轉(zhuǎn)錄v反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)。 v反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription)。 反轉(zhuǎn)錄酶目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件58RNA病毒在細胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遺傳信息，并可在細胞內(nèi)獨立繁殖。在某些情況下，前病毒基因組通過基因重組(recombination)，參加到細胞基因組內(nèi)，并隨宿主基因一起復(fù)制和表達。這種重組方式稱為整合(integration)。前病毒獨立繁殖或整合，都可成為致病的原因。 目 錄清華

21、版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件59反轉(zhuǎn)錄病毒RNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA的過程 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件60v反轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義：v反轉(zhuǎn)錄酶和反轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。 v反轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同時兼有遺傳信息傳代與表達功能。v對反轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論。 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件612、其他復(fù)制方式v噬菌體DNA按滾環(huán)方式復(fù)制。v線粒體DNA按D環(huán)方式復(fù)制。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件62滾環(huán)復(fù)制示意圖3-OH5-P555333355533 5目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與

22、分子生物學(xué)課件63dNTPDNA-pol D環(huán)復(fù)制示意圖目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件64v D環(huán)復(fù)制時需合成引物。線粒體DNA為雙鏈，第一個引物以內(nèi)環(huán)為模板延伸。至第二個復(fù)制起始點時，又合成另一個反向引物，以外環(huán)為模板進行反向的延伸。最后完成兩個雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制。因復(fù)制中呈字母D形狀而得名。vD環(huán)復(fù)制的特點是復(fù)制起始點不在雙鏈DNA同一位點，內(nèi)、外環(huán)復(fù)制有時序差別。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件6513.5 DNA的損傷與修復(fù)（DNA Damage & Repair）DNA損傷（也稱突變）：具體指個別dNMP殘基以至片段DNA在構(gòu)成、復(fù)制或表型功能的異常變化。

23、從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件661、DNA損傷的類型v自發(fā)性損傷： DNA分子的自發(fā)性損傷可能是DNA復(fù)制本身的特性所致，也可能是DNA分子自身構(gòu)型的變化或化學(xué)變化影響了復(fù)制時堿基的正確配對。 盡管復(fù)制DNA的酶促系統(tǒng)試圖通過校正讀碼的機制來糾正不正確核苷酸的錯誤插入，但是仍有些錯誤逃避校正，發(fā)生頻率大約在10-10左右。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件67v 物理損傷： 物理損傷主要指紫外線和各種輻射，其中又以紫外線照射研究較多。紫外線的高能量可以使相鄰嘧啶形成嘧啶二聚體。電離輻射（如射線、射線等）的作用比較復(fù)雜，

24、除射線的直接效應(yīng)外，還可以通過水在電離時所形成的自由基起作用，使DNA出現(xiàn)雙鏈斷裂或單鏈斷裂，大劑量照射時還可造成堿基的破壞。目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件68v 化學(xué)損傷： 化學(xué)因素導(dǎo)致DNA的損傷可以是化學(xué)物質(zhì)直接與DNA發(fā)生作用引起的，也可以通過間接方式引起。 烷化劑是化學(xué)因素引起DNA損傷的典型代表。 一些與DNA正常堿基結(jié)構(gòu)類似的化合物能在DNA復(fù)制時取代正常堿基摻入并與互補鏈上的堿基配對。 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件692、DNA突變的類型v點突變(point mutation)v缺失 (deletion)v插入 (insertion)v重排 (rearrangement) 框移(frame-shift) 目 錄清華版教材醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件70 點突變 即DNA分子上的堿基錯配。 分兩類： 轉(zhuǎn)換：兩種嘧啶或兩種嘌呤間的互換； 顛換：嘌呤與嘧啶或嘧啶與嘌呤間的互換。 點突變可導(dǎo)致編碼氨基酸的改變。目 錄