流式細(xì)胞分析方案課件

1、流式細(xì)胞儀（流式細(xì)胞儀（FlowCytometer簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)FCM）是一項(xiàng)集激光）是一項(xiàng)集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)及細(xì)胞技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。概括來(lái)說(shuō)，流式細(xì)胞術(shù)就是對(duì)于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中概括來(lái)說(shuō)，流式細(xì)胞術(shù)就是對(duì)于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選的技術(shù)。從開(kāi)始設(shè)想到第一臺(tái)儀器的問(wèn)世的技術(shù)。從開(kāi)始設(shè)想到第一臺(tái)儀器的問(wèn)世,科技工作者進(jìn)行科技工作者進(jìn)行了

2、不懈的努力。隨著各相關(guān)技術(shù)的迅速發(fā)展，了不懈的努力。隨著各相關(guān)技術(shù)的迅速發(fā)展，F(xiàn)CM技術(shù)已技術(shù)已經(jīng)成為日益完善的細(xì)胞分析和分選的工具。經(jīng)成為日益完善的細(xì)胞分析和分選的工具。BD FACSVantageBD-Calibur 其特點(diǎn)是：其特點(diǎn)是：測(cè)量速度快，最快可在測(cè)量速度快，最快可在1秒種內(nèi)計(jì)測(cè)數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；秒種內(nèi)計(jì)測(cè)數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，可以對(duì)同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，可以對(duì)同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；化學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；是一門(mén)綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、是一門(mén)綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、

3、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)等從多計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)等從多領(lǐng)域的知識(shí)和成果；領(lǐng)域的知識(shí)和成果；既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。概要說(shuō)來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)主要包括了樣品的液流概要說(shuō)來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)主要包括了樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的分選和計(jì)數(shù)技術(shù)，以及數(shù)據(jù)的采技術(shù)、細(xì)胞的分選和計(jì)數(shù)技術(shù)，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。集和分析技術(shù)等。FCM目前發(fā)展的水平凝聚了目前發(fā)展的水平凝聚了半個(gè)世紀(jì)以來(lái)人們?cè)谶@方面的心血和成果。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)人們?cè)谶@方面的心血和成果。 流式細(xì)胞儀主要由三部分組成：流動(dòng)室和液流式細(xì)胞儀主要由三部分組成：流動(dòng)室和液流系

4、統(tǒng)；光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)。其作用如下：流系統(tǒng)；光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)。其作用如下： 液流系統(tǒng)：依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激液流系統(tǒng)：依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)。光照射區(qū)。 光路系統(tǒng)：細(xì)胞由激光激發(fā)，通過(guò)光學(xué)濾片光路系統(tǒng)：細(xì)胞由激光激發(fā)，通過(guò)光學(xué)濾片產(chǎn)生光信號(hào)，并傳送到相應(yīng)的探測(cè)器。產(chǎn)生光信號(hào)，并傳送到相應(yīng)的探測(cè)器。 電系統(tǒng)：把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。電系統(tǒng)：把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。在流式細(xì)胞儀中，細(xì)胞被傳送到液流中的激光照射區(qū)。在流式細(xì)胞儀中，細(xì)胞被傳送到液流中的激光照射區(qū)。任何存在于懸液中的直徑為任何存在于懸液中的直徑為0.2-150微米的粒子或細(xì)胞微米的粒子或細(xì)胞都適用于流式分析。在實(shí)際工作

5、中，用實(shí)體組織進(jìn)行流都適用于流式分析。在實(shí)際工作中，用實(shí)體組織進(jìn)行流式細(xì)胞分析往往是不可能的，分析之前必須對(duì)其進(jìn)行分式細(xì)胞分析往往是不可能的，分析之前必須對(duì)其進(jìn)行分解。被液滴包繞的粒子稱(chēng)為細(xì)胞液柱，當(dāng)粒子經(jīng)過(guò)激光解。被液滴包繞的粒子稱(chēng)為細(xì)胞液柱，當(dāng)粒子經(jīng)過(guò)激光照射區(qū)時(shí)，通過(guò)激光激發(fā)產(chǎn)生散射光。含有熒光的粒子照射區(qū)時(shí)，通過(guò)激光激發(fā)產(chǎn)生散射光。含有熒光的粒子就會(huì)表現(xiàn)出其熒光特性。散射光和熒光由光路系統(tǒng)（相就會(huì)表現(xiàn)出其熒光特性。散射光和熒光由光路系統(tǒng)（相應(yīng)的透鏡，濾片和探測(cè)器）收集。分光器和濾光片引導(dǎo)應(yīng)的透鏡，濾片和探測(cè)器）收集。分光器和濾光片引導(dǎo)散射光和熒光至相應(yīng)的探測(cè)器，把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。散

6、射光和熒光至相應(yīng)的探測(cè)器，把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。 Flow CellInjector TipSheath fluid 高流速適用于定性測(cè)量，如免疫表型。樣本高流速適用于定性測(cè)量，如免疫表型。樣本流變寬，細(xì)胞間距離縮短，這樣在單位時(shí)間內(nèi)流流變寬，細(xì)胞間距離縮短，這樣在單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)量增加，可以快速獲取數(shù)經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)量增加，可以快速獲取數(shù)據(jù)。據(jù)。 低流速促使樣本流變窄，單個(gè)細(xì)胞得以依次低流速促使樣本流變窄，單個(gè)細(xì)胞得以依次通過(guò)，這樣大多數(shù)細(xì)胞可流經(jīng)激光束的中心，細(xì)通過(guò)，這樣大多數(shù)細(xì)胞可流經(jīng)激光束的中心，細(xì)胞受激光照射的能量比較均一，因而低流速適用胞受激光照射的能量比較均一

7、，因而低流速適用于檢測(cè)分辨率要求高的實(shí)驗(yàn)，如于檢測(cè)分辨率要求高的實(shí)驗(yàn)，如DNA分析。分析。 前向角散射：前向角散射（前向角散射：前向角散射（FSC）光與被測(cè)細(xì)光與被測(cè)細(xì)胞的大小和面積有關(guān)，檢測(cè)的是激光束照射方胞的大小和面積有關(guān)，檢測(cè)的是激光束照射方向與收集散射光信號(hào)的光電倍增管軸向方向的向與收集散射光信號(hào)的光電倍增管軸向方向的散射光信號(hào)。散射光信號(hào)。FSC不受細(xì)胞熒光染色的影響，不受細(xì)胞熒光染色的影響，常用于免疫表型分析的信號(hào)處理。常用于免疫表型分析的信號(hào)處理。Forward Angle Light Scatter前向角前向角FALS SensorLaser側(cè)向角散射：側(cè)向角散射（側(cè)向角散射：

8、側(cè)向角散射（SSC）光與光與被測(cè)細(xì)胞的顆粒密度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)，被測(cè)細(xì)胞的顆粒密度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)，對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感。感。SSC收集與激光束正交收集與激光束正交90度方向的度方向的散射光信號(hào)。散射光信號(hào)。90 Degree Light Scatter90度側(cè)向角度側(cè)向角FALS Sensor90LS SensorLaser顆粒度細(xì)胞大小上述兩種信號(hào)都是來(lái)自于激光原光束，目前采上述兩種信號(hào)都是來(lái)自于激光原光束，目前采用這兩個(gè)參數(shù)組合，可區(qū)分不同種類(lèi)的細(xì)胞亞用這兩個(gè)參數(shù)組合，可區(qū)分不同種類(lèi)的細(xì)胞亞群，同時(shí)可獲得細(xì)胞相關(guān)的重要信息，下圖群，同時(shí)可獲得

9、細(xì)胞相關(guān)的重要信息，下圖（圖（圖3-2）為）為FSC和和SSC組成的二維散點(diǎn)圖，組成的二維散點(diǎn)圖，從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細(xì)胞、單從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及粒細(xì)胞區(qū)分開(kāi)核細(xì)胞及粒細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。 熒光物質(zhì)吸收符合其波長(zhǎng)范圍的光能量，內(nèi)部電熒光物質(zhì)吸收符合其波長(zhǎng)范圍的光能量，內(nèi)部電子受激上升到高能級(jí)。然后受激電子迅速衰落回子受激上升到高能級(jí)。然后受激電子迅速衰落回基態(tài)，釋放過(guò)剩能量成為光子。這種能量的轉(zhuǎn)換基態(tài)，釋放過(guò)剩能量成為光子。這種能量的轉(zhuǎn)換稱(chēng)為熒光。稱(chēng)為熒光。 能夠激發(fā)熒光物質(zhì)的波長(zhǎng)范圍稱(chēng)為激發(fā)光譜。因能夠激發(fā)熒光物質(zhì)的波長(zhǎng)范圍稱(chēng)為激發(fā)光譜。因?yàn)楦嗟哪芰肯脑谖?/p>

10、收轉(zhuǎn)換而不是熒光轉(zhuǎn)換中，為更多的能量消耗在吸收轉(zhuǎn)換而不是熒光轉(zhuǎn)換中，所以發(fā)射光波長(zhǎng)要高于激發(fā)光波長(zhǎng)。熒光物質(zhì)的所以發(fā)射光波長(zhǎng)要高于激發(fā)光波長(zhǎng)。熒光物質(zhì)的發(fā)射波長(zhǎng)范圍叫做發(fā)射光譜。發(fā)射波長(zhǎng)范圍叫做發(fā)射光譜。 目前的流式細(xì)胞儀大多采用氬離子激光器，因?yàn)槟壳暗牧魇郊?xì)胞儀大多采用氬離子激光器，因?yàn)?88nm的激光器能夠激發(fā)一種以上的熒光。光的激光器能夠激發(fā)一種以上的熒光。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜的峰值，源的譜線愈接近被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜的峰值，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)愈強(qiáng)。所產(chǎn)生的熒光信號(hào)愈強(qiáng)。FITC的激發(fā)光譜如圖的激發(fā)光譜如圖3-3所示，所示， 488nm非常接近非常接近FITC的激發(fā)光譜的的

11、激發(fā)光譜的峰值，所以峰值，所以FITC被激發(fā)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出最強(qiáng)熒光信被激發(fā)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出最強(qiáng)熒光信號(hào)，而當(dāng)號(hào)，而當(dāng)FITC被其波譜范圍內(nèi)的其它波長(zhǎng)激發(fā)被其波譜范圍內(nèi)的其它波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，也會(huì)檢測(cè)到熒光，但信號(hào)強(qiáng)度不會(huì)這么高。時(shí)，也會(huì)檢測(cè)到熒光，但信號(hào)強(qiáng)度不會(huì)這么高。Fluorescein (FITC)400 nm600 nm700 nmRelative IntensityWavelength500 nmExcitationEmissionPhycoerythrin (PE)400 nm600 nm700 nmRelative IntensityWavelengthExcitationEmission500

12、 nmFluorescent Dyes600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm457350514610 632488Common Laser Lines對(duì)單克隆抗體進(jìn)行熒光染色，通過(guò)分析細(xì)胞表對(duì)單克隆抗體進(jìn)行熒光染色，通過(guò)分析細(xì)胞表面抗原標(biāo)記面抗原標(biāo)記確認(rèn)細(xì)胞類(lèi)型。在細(xì)胞的混合群體中，我們使確認(rèn)細(xì)胞類(lèi)型。在細(xì)胞的混合群體中，我們使用不同的熒光染料區(qū)分細(xì)胞亞群。每個(gè)亞群的用不同的熒光染料區(qū)分細(xì)胞亞群。每個(gè)亞群的染色模式與染色模式與FSC和和SSC數(shù)據(jù)相結(jié)合，用于識(shí)別樣數(shù)據(jù)相結(jié)合，用于識(shí)別樣本中的細(xì)胞種類(lèi)，并可以得到各細(xì)胞亞群的百本中的細(xì)胞種類(lèi)，并可以得到各細(xì)胞亞群的百分含量。

13、而且，還可以對(duì)感興趣的細(xì)胞進(jìn)行再分含量。而且，還可以對(duì)感興趣的細(xì)胞進(jìn)行再分選。分選。FreqFluorescenceFALS SensorFluorescence detectorPMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersExample Channel Layout for Laser-based Flow CytometryLaser 1234Flow cell臺(tái)式機(jī)通常配有兩根激光器：第一根激光臺(tái)式機(jī)通常配有兩根激光器：第一根激光器波長(zhǎng)為器波長(zhǎng)為488nm。第二根為波長(zhǎng)。第二根為波長(zhǎng)635nm的紅二極管固態(tài)激光器。的紅二極管固態(tài)激光器。n設(shè)門(mén)設(shè)門(mén)

14、n通過(guò)設(shè)門(mén)的方法可以定義細(xì)胞亞群的區(qū)域。如通過(guò)設(shè)門(mén)的方法可以定義細(xì)胞亞群的區(qū)域。如：血樣本是混合細(xì)胞群，如果想單獨(dú)分析淋巴：血樣本是混合細(xì)胞群，如果想單獨(dú)分析淋巴球細(xì)胞，可根據(jù)球細(xì)胞，可根據(jù)FSC或細(xì)胞大小，在或細(xì)胞大小，在FSC，SSC的散點(diǎn)圖中設(shè)門(mén)，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映淋巴的散點(diǎn)圖中設(shè)門(mén)，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映淋巴細(xì)胞亞群的熒光特性。細(xì)胞亞群的熒光特性。直方圖可直觀單個(gè)參數(shù)的細(xì)胞數(shù)量。陰直方圖可直觀單個(gè)參數(shù)的細(xì)胞數(shù)量。陰性對(duì)照用于決定直方圖中單參數(shù)的左右性對(duì)照用于決定直方圖中單參數(shù)的左右邊界。左圖中邊界。左圖中M1為陰性對(duì)照峰。右圖中為陰性對(duì)照峰。右圖中M2為為CD3 FITC陽(yáng)性峰。陽(yáng)性峰。 統(tǒng)計(jì)

15、結(jié)果表明，整個(gè)事件共記錄了統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，整個(gè)事件共記錄了6000個(gè)細(xì)胞，門(mén)內(nèi)個(gè)細(xì)胞，門(mén)內(nèi)淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞2891個(gè)。其中個(gè)。其中M1（陰性）細(xì)胞陰性）細(xì)胞619個(gè)，個(gè)，M2（CD3陽(yáng)性）細(xì)胞陽(yáng)性）細(xì)胞2272個(gè)細(xì)胞。淋巴細(xì)胞亞群個(gè)細(xì)胞。淋巴細(xì)胞亞群CD3陽(yáng)陽(yáng)性 百 分 含 量 的 統(tǒng) 計(jì) 結(jié) 果 為 ：性 百 分 含 量 的 統(tǒng) 計(jì) 結(jié) 果 為 ： M 2 ：2272/2891=78.59%。 二維點(diǎn)圖以雙參數(shù)顯示結(jié)果，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。圖為二維點(diǎn)圖以雙參數(shù)顯示結(jié)果，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。圖為陰性對(duì)照?qǐng)D，用于設(shè)定陰性對(duì)照邊界，全圖劃分為四個(gè)象限，以陰性對(duì)照?qǐng)D，用于設(shè)定陰性對(duì)照邊界，

16、全圖劃分為四個(gè)象限，以區(qū)分陰性細(xì)胞、單陽(yáng)性細(xì)胞以及雙陽(yáng)性細(xì)胞。左下象限（區(qū)分陰性細(xì)胞、單陽(yáng)性細(xì)胞以及雙陽(yáng)性細(xì)胞。左下象限（LL）為為雙陰性細(xì)胞，左上象限（雙陰性細(xì)胞，左上象限（UL）為為Y軸陽(yáng)性細(xì)胞（軸陽(yáng)性細(xì)胞（CD19 PE），），右右下象限（下象限（LR）為為X軸陽(yáng)性細(xì)胞（軸陽(yáng)性細(xì)胞（CD3 FITC），），右上象限右上象限（URUR）為雙陽(yáng)性細(xì)胞（為雙陽(yáng)性細(xì)胞（CD19CD19+ +/CD3/CD3+ +）。）。 如圖如圖5-7所示，淋巴細(xì)胞亞群雙陽(yáng)性細(xì)胞所示，淋巴細(xì)胞亞群雙陽(yáng)性細(xì)胞（ C D 1 9+/ C D3 +） 的 百 分 含 量 為 ：的 百 分 含 量 為 ：296/283

17、9=10.43%。 488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detectorPurdue University Cytometry Laboratories流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用臨床常見(jiàn)應(yīng)用臨床常見(jiàn)應(yīng)用微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞靈敏度:10-7 細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析: :在細(xì)胞周期在細(xì)胞周期( (G0G0，G1G1，S S，G2 G2 ，M)M)的各個(gè)時(shí)期，的各個(gè)時(shí)期，DNADNA的含量隨各時(shí)相呈現(xiàn)的含量隨各時(shí)相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過(guò)核酸

18、染料標(biāo)記出周期性的變化。通過(guò)核酸染料標(biāo)記DNADNA，并并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個(gè)時(shí)由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的分布狀態(tài)，計(jì)算出期的分布狀態(tài)，計(jì)算出G0/G1%G0/G1%，S%S%及及G2/M%G2/M%。了解細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞的增殖活性。也可了解細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞的增殖活性。也可利用細(xì)胞周期蛋白（利用細(xì)胞周期蛋白（CYCLINCYCLIN）、）、Ki67Ki67、核增殖核增殖抗原（抗原（PCNAPCNA）等，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行精確的分期：等，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行精確的分期：G0G0、G1G1、S S、G2G2、M.M.DNA含量及細(xì)胞周期分析含量及細(xì)胞周期分析0 200 400 600 8001000DNA co