膜蛋白的三維結(jié)晶

1、膜蛋白三維結(jié)晶Three-dimensional Crystallization of Membrane Protein膜蛋白三維結(jié)晶原理第一章膜蛋白結(jié)晶方法研究進展第二章CONTENTS目 錄01 膜蛋白三維結(jié)晶原理The principle of three-dimensional membrane protein crystallization膜蛋白結(jié)構(gòu)的特殊性，使其一旦脫離天然磷脂雙分子結(jié)構(gòu)就會發(fā)生聚集變性，導致其三維結(jié)構(gòu)改變和功能的喪失因此，要保證膜蛋白的結(jié)晶，首先必須找到一種能夠高效地從天然環(huán)境中提取膜蛋白并能穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)功能的方法使用兩親性分子諸如去垢劑、脂類分子是目前最主要的手段

2、，其中去垢劑應用最為廣泛，但近年來脂類分子也逐漸受到了研究者越來越廣泛的關(guān)注1.1 兩親性分子自組裝原理兩親性分子自組裝原理兩親性分子的親水基與疏水基與水有相反的作用傾向：親水基傾向于進入水中，而疏水基則傾向于遠離水相二者平衡的結(jié)果是：兩親性分子將在水的表面聚集并覆蓋在水面上，其中每個分子的親水基都伸入水中，而疏水基則指向水相之外但當兩親性分子的濃度進一步增大，水表面完全被單層兩親性分子覆蓋此時繼續(xù)增加濃度，將迫使這些分子不得不在水中開始發(fā)生自組裝，形成親水基與疏水基隔離的膠團結(jié)構(gòu)形成這種膠團的最低濃度被稱為臨界膠束濃度(critical micelle concentration,CMC)超

3、過了 CMC 后，兩親性分子通常能進行分子自組裝形成圓柱狀、圓錐狀、鍥子狀等結(jié)構(gòu)，這些組裝成的微團按照形狀的不同可分為三種類型單擊此處輸入標題Type 0 (Lamellar phase)、 Type 1 (Normal micelle)、Type 2(Inverse micelle)為了滿足能量最小原理滿足能量最小原理，這些類型的微團分別將其分子的疏水部分與水相隔離起來Type 1、Type 2 分別是以去垢劑和脂類分子為典型代表，Type 0 則兩者都可以裝配形成其中 Type1 去垢劑分子去垢劑分子包圍的區(qū)域是被去垢劑烷基尾巴所充滿而不是真空的區(qū)域，去垢劑分子通常有一個單鏈烷基，其含有大

4、量的親水基促進了去垢劑組裝成. Type 1 微團微團，反之脂類分子脂類分子含有單鏈或者雙鏈烷基，因此有比去垢劑更強的疏水性質(zhì)，這樣促使其自組裝成 Type 2 微團單擊此處輸入標題1.2 膜蛋白提取原理及其晶體分類去垢劑分子的結(jié)構(gòu)特征是具有一個親水的頭部和一個疏水的尾巴當把去垢劑加入到含有脂雙層的溶液中后，去垢劑分子首先進入膜表面和水相之間，導致局部膜組分變形當越來越多的去垢劑進入后，膜組分被去垢劑飽和最終崩塌與去垢劑分子一起形成蛋蛋白質(zhì)白質(zhì) - 去垢劑混合微團復合物去垢劑混合微團復合物(proteindetergent complex, PDC)，膜蛋白包裹于 PDC 之中后被提取出來.單

5、擊此處輸入標題根據(jù)后續(xù)結(jié)晶實驗中使用的方法可將膜蛋白晶體分為 3 類：二維晶體二維晶體(2-D crystal)、三維晶體三維晶體(3-D crystal type )三維晶體三維晶體(3-D crystal type )二維晶體 實質(zhì)上是在脂類分子重新裝配成脂雙層的膜平面上形成的，因此只能通過2-D 電子顯微鏡觀察三維晶體 具有典型的層狀結(jié)構(gòu)，主要通過基于脂類分子的方法獲得，其膜蛋白分子間的相互作用靠疏水表面來介導，因此增加了膜蛋白間的相互接觸而可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子的密集堆積，通常能得到很好的衍射數(shù)據(jù).對于 X 射線單晶衍射來說需要膜蛋白的三維晶體，最通常的晶體類型是三維晶體單擊此處輸入標題除

6、上述膜蛋白三維晶體基本類型外，Liu 和Chang 等在研究菠菜主要捕光復合物(LHC-)結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了膜蛋白三維晶體堆膜蛋白三維晶體堆積的第三種方式積的第三種方式：首先由 60 個膜蛋白 LHC-分子、脂分子及色素分子組裝成一個正二十面體的空心球體結(jié)構(gòu)，然后將該二十面體結(jié)構(gòu)作為基本單位進行晶體的周期排列這種全新的堆積方式完全不同于前面所述的型和型膜蛋白晶體，可作為第三類膜蛋白三維晶體類型(3-D crystal type ).該重大研究發(fā)現(xiàn)不但豐富了膜蛋白晶體結(jié)構(gòu)研究內(nèi)容，而且為光合作用捕光機制和光保護機制的研究奠定了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)02 膜蛋白結(jié)晶方法研究進展2 膜蛋白結(jié)晶方法研究進展基于兩親

7、性分子自組裝以及能與膜蛋白分子裝配成復合物結(jié)晶的原理，膜蛋白結(jié)晶研究目前主要有兩種方法基于去垢劑的 in surfo 結(jié)晶法和基于脂類的 in cubo 結(jié)晶法2.1 基于去垢劑的結(jié)晶研究(in surfo methods)去垢劑也稱表面活性劑(surfactant)，一般情況下其親水性質(zhì)要比脂類分子強，因此形成的微團類型屬于 Type 1，其結(jié)構(gòu)特征為微團的烷基尾巴聚集在一起，被親水的頭部所包裹在膜蛋白結(jié)晶方法學中， 以去垢劑結(jié)晶為代表的 In surfo 結(jié)晶法是最為經(jīng)典也最為傳統(tǒng)的方法2.1.1 去 垢 劑 微 團 結(jié) 晶 法 (detergent micellesmethod)In s

8、urfo 結(jié)晶法中去垢劑微團結(jié)晶法是最常用的方法，Michel 等應用此方法獲得了世界上第一個膜蛋白結(jié)構(gòu)紫細菌光反應中心結(jié)構(gòu)該方法的原理簡單來說是利用去垢劑提取膜蛋白，使膜蛋白與其形成的復合物 PDC 可以像可溶性蛋白那樣直接用氣相擴散(懸滴法和坐滴法)和透析等方法來結(jié)晶PDC 是一個很復雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，包括膜蛋白分子、去垢劑和水緩沖液，其中去垢劑分子會貫穿在晶格中形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而膜蛋白分子間的相互作用是形成晶格的最重要因素晶格對于PDC 的大小和形狀有嚴格的要求，小的 PDC 一般可以形成有序的膜蛋白晶格堆積，因此去垢劑在結(jié)晶過程中的選擇至關(guān)重要非離子型去垢劑和兩性去垢劑已成功應用于膜蛋白結(jié)晶

9、中，其中前者的應用更為廣泛裝配 PDC 過程中也可添加一種或幾種去垢劑，有時根據(jù)靶蛋白的性質(zhì)也可以添加一些脂類分子或者其他化學分子2.1.2 抗 體 片 段 共 結(jié) 晶 法 (antibody fragment method)2002 年Michel 等探索了特異性的抗體片段與靶蛋白結(jié)合方法(圖 3，即通過去垢劑提取膜蛋白后，再與抗體片段結(jié)合，進行結(jié)晶)，在同一體系中共結(jié)晶并成功得到了晶體該方法的原理是通過與抗體片段的結(jié)合，增大靶蛋白的親水表面，在晶格中形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)極性相互作用，進而可以得到高質(zhì)量的有序的 Type 晶體靶蛋白結(jié)合抗體片段后柔性降低，其構(gòu)象的均一度得到提高，且因

10、整個抗體的結(jié)構(gòu)很大而且有更多的分子柔性，所以利用抗體片段要比整個抗體更有利于結(jié)晶目前至少有三種膜蛋白(細胞色素 c 氧化酶、細胞色素 bc1 復合物、Kcs A 鉀離子通道)已經(jīng)應用該方法成功結(jié)晶2.2 基于脂類的結(jié)晶研究(in cubo methods)如前文所述，脂類分子與去垢劑相比通常具有更強的疏水性質(zhì)，因此自組裝形成的微團結(jié)構(gòu)為Type 2，也稱反向微團如圖 1 所示，其疏水尾巴將水包圍形成水核脂類分子包括磷脂、甘油脂和鞘脂類等，由于其種類、親水區(qū)域、脂鏈長度以及溶劑組分等因素不同，可分別自組裝成各種類型的一維、二維、三維空間結(jié)構(gòu)，包括薄層相、六角相和立方相等形式，但其中的薄層相和六角

11、相微團并不適合膜蛋白結(jié)晶，立方相則在膜蛋白結(jié)晶中受到了越來越多的關(guān)注雙連續(xù)脂分子層的立方相是具有立體對稱性、黏性、半固態(tài)的液晶，其尺寸大小在 625 nm 范圍內(nèi)，根據(jù)晶體學空間群不同有三種類型的立方相：Im3m、Pn3m、Ia3d這三種立方相分別有 6、4、3 個水通道并且夾角為90、109.28、120(圖 4)，它們具有相似的幾何基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，其中 Ia3d 的彎曲度最大，Pn3m 居中，Im3m 最小 研究表明 Pn3m 適用于幾乎所有的蛋白質(zhì)結(jié)晶，但 Im3m 更適合作為膜蛋白結(jié)晶的中間相2.2.1 脂立方相結(jié)晶(lipid cubic phase，LCP)基于脂類的脂立方相結(jié)晶方法早在

12、 1996 年就被 Landau 和 Rasenbusch 提出，但直到近年來才開始逐漸成為一種廣泛接受的膜蛋白結(jié)晶方法脂立方相由一定比例的脂、緩沖液和蛋白質(zhì)組成，形成一個結(jié)構(gòu)化、周期性的三維脂立方排列，其中充滿相互溝通的水通道(圖 5)在這一體系中膜蛋白鑲嵌在雙連續(xù)膜脂層中形成三維立方格結(jié)構(gòu)，這與它在生物膜中的構(gòu)象十分相似，也稱 in cubo 結(jié)晶法膜蛋白在脂立方相中的結(jié)晶分為 4 個基本過程基本過程：a選擇合適的去垢劑提取并純化目標膜蛋白，形成可溶的 PDCb膜蛋白嵌入脂立方相，PDC 溶液與脂類分子按照 4 6 的比例混合后通過離心作用形成立方相(也可以使用預先自組裝的立方相與 PDC

13、 溶液混合)c鹽誘導結(jié)晶的起始，在 20下，添加沉淀劑鹽溶液來誘導晶體的形核和生長過程d數(shù)小時或者數(shù)周得到晶體后，用溶解液(去垢劑或者酯酶)將立方相中的晶體分離并保存在合適條件下以備后續(xù)的 X 射線晶體衍射研究. LCP 也存在一些缺點缺點：首先，LCP所形成的水通道很窄，這樣可能會阻礙膜蛋白親水基間的相互作用，其次，LCP 的高黏度使得操作和觀察晶體很不方便，而且 LCP 經(jīng)低溫冷卻后會變得不透明，獲得晶體尺寸小，為晶體定位帶來麻煩2.2.2 脂海綿相結(jié)晶(lipid sponge phase，LSP)LSP 和 LCP 都有三維的雙連續(xù)分子層，唯一不同的是脂海綿相的形成過程中添加了聚乙二醇

14、(polyethyleneglycol，PEG)、2- 甲基 -2, 4 戊二醇(2-methyl-2, 4-pentanediol，MPD)等溶劑相比 LCP 結(jié)晶，LSP 有以下幾個優(yōu)點：aLSP 形成的水通道比 LCP 的水通道增加了 3 倍(圖 5)，因此它能允許更大的膜蛋白很容易地進入 LSP 水通道中，也可以看做是一種溶脹的脂立方相；bLSP在室溫下是液態(tài)的，具有更好的流動性和更小的黏度，能直接使用懸滴法或者坐滴法進行結(jié)晶實驗；c便于使用商業(yè)化結(jié)晶移液系統(tǒng)，目前已經(jīng)被應用 在 高 通 量 膜 蛋 白 結(jié) 晶 篩 選 研 究 中 單擊此處輸入標題2.3 基于脂類和去垢劑混合物的結(jié)晶研

15、究2.3.1 脂類 - 去垢劑混合微團結(jié)晶法(lipid-detergent mixed micelles method) 除了 LSP 結(jié)晶法， 2002年 Faham 等發(fā)展了脂類 - 去垢劑混合微團結(jié)晶法，也稱雙層膜微團法(bicelles methods)這也是一種基于 LCP 方法的改進方法，該法在最近幾種重要膜蛋白的結(jié)構(gòu)研究中獲得了成功.Bicelles 是按一定濃度比例的脂類 / 去垢劑混合而形成的雙分子層圓盤結(jié)構(gòu)與單一去垢劑微團相比，bicelles 的雙分子層環(huán)境將更接近膜蛋白天然的脂雙分子層單擊此處輸入標題隨著溫度的升高 bicelles 的黏度會增加，因此可以調(diào)節(jié)溫度來得到許多種雙分子層脂膜結(jié) 構(gòu) 的 bicelles 利 用 bicelles 結(jié) 晶 的 方