獸用疫苗生產(chǎn)與檢驗技術(shù)

1、 獸用生物制品系指用天然或人工改造的微生物獸用生物制品系指用天然或人工改造的微生物（細(xì)菌、病毒、衣原體、鉤端螺旋體等）及其代謝產(chǎn)（細(xì)菌、病毒、衣原體、鉤端螺旋體等）及其代謝產(chǎn)物、寄生蟲、動物血液或組織等為原材料，采用生物物、寄生蟲、動物血液或組織等為原材料，采用生物學(xué)、分子生物學(xué)或生物化學(xué)等相應(yīng)技術(shù)制成的生物制學(xué)、分子生物學(xué)或生物化學(xué)等相應(yīng)技術(shù)制成的生物制劑，用于預(yù)防、治療或診斷畜禽疫病。劑，用于預(yù)防、治療或診斷畜禽疫病。 1 1、按照性質(zhì)和制造方法、按照性質(zhì)和制造方法 疫（菌）苗、類毒素、疫（菌）苗、類毒素、抗血清、診斷制劑和微生態(tài)制劑等。抗血清、診斷制劑和微生態(tài)制劑等。 2 2、按照作用與

2、用途、按照作用與用途 預(yù)防、診斷和治療用生物制預(yù)防、診斷和治療用生物制品。品。 將細(xì)菌、病毒、寄生蟲等接種于特殊基質(zhì)進(jìn)行培將細(xì)菌、病毒、寄生蟲等接種于特殊基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，收獲其抗原單位或亞單位，或用人工合成的抗原單位養(yǎng)，收獲其抗原單位或亞單位，或用人工合成的抗原單位或亞單位制備而成的活的或滅活的、具有特異性和免疫原或亞單位制備而成的活的或滅活的、具有特異性和免疫原性的生物制品，用于預(yù)防靶動物的疾病。性的生物制品，用于預(yù)防靶動物的疾病。 預(yù)防用獸用生物制品包括：滅活疫苗、活疫苗、重預(yù)防用獸用生物制品包括：滅活疫苗、活疫苗、重組亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、重組活載體組亞單位疫苗、合成肽疫苗

3、、基因缺失疫苗、重組活載體疫苗和核酸（疫苗和核酸（DNADNA）疫苗。）疫苗。 1) 1)強(qiáng)毒強(qiáng)毒( (菌菌) )或弱毒（菌）或弱毒（菌）培養(yǎng)培養(yǎng)滅活或加熱滅活或加熱純化或濃縮純化或濃縮佐劑或防腐佐劑或防腐劑。劑。 2)2)滅活的毒素或提取的亞單位或滅活的毒素或提取的亞單位或rDNArDNA產(chǎn)生亞單位。產(chǎn)生亞單位。 滅活疫苗穩(wěn)定、安全，便于運(yùn)輸和滅活疫苗穩(wěn)定、安全，便于運(yùn)輸和保存，易于提純純化和制備多價、多聯(lián)保存，易于提純純化和制備多價、多聯(lián)苗。苗。但用量較大、接種次數(shù)多、免疫力但用量較大、接種次數(shù)多、免疫力產(chǎn)生慢、注射困難、注射局部可能有反產(chǎn)生慢、注射困難、注射局部可能有反應(yīng)等。應(yīng)等。 1

4、1）致弱的弱毒（菌、蟲）株）致弱的弱毒（菌、蟲）株 動物、動物、組織、細(xì)胞、雞胚或培養(yǎng)基組織、細(xì)胞、雞胚或培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)降降低毒力、保留免疫原性低毒力、保留免疫原性篩選。篩選。 2 2）自然弱（無）毒（菌、蟲）株。）自然弱（無）毒（菌、蟲）株。 3 3）異種毒（菌、蟲）株。）異種毒（菌、蟲）株。 4 4）基因工程改造弱毒株。）基因工程改造弱毒株。 活疫苗對原宿主動物無致病性或引起活疫苗對原宿主動物無致病性或引起亞臨床感染，能產(chǎn)生主動免疫力，用量少、亞臨床感染，能產(chǎn)生主動免疫力，用量少、成本低、免疫力產(chǎn)生快、免疫期長。但可成本低、免疫力產(chǎn)生快、免疫期長。但可能存在不安全風(fēng)險能存在不安全風(fēng)險。 1

5、 1）微生物）微生物物理和化學(xué)方法物理和化學(xué)方法提取有效抗原成分。提取有效抗原成分。 2 2）病原）病原基因工程技術(shù)基因工程技術(shù)保護(hù)保護(hù)性抗原基因序列插入合適的表達(dá)質(zhì)性抗原基因序列插入合適的表達(dá)質(zhì)粒粒高效穩(wěn)定表達(dá)高效穩(wěn)定表達(dá)生產(chǎn)抗原生產(chǎn)抗原亞亞單位疫苗。單位疫苗。用化學(xué)方法人工合成多肽作為抗原。用化學(xué)方法人工合成多肽作為抗原。純度高、穩(wěn)定，但只能線性表達(dá)，不純度高、穩(wěn)定，但只能線性表達(dá)，不能折疊，免疫原性較差。能折疊，免疫原性較差。 病原體病原體基因工程方法基因工程方法缺失致缺失致病性基因或非必要糖蛋白病性基因或非必要糖蛋白保持免疫保持免疫原性原性降低致病性。疫苗毒力不易恢降低致病性。疫苗毒力

6、不易恢復(fù)，穩(wěn)定性好，可配合鑒別診斷方法，復(fù)，穩(wěn)定性好，可配合鑒別診斷方法，區(qū)別免疫動物和自然感染動物。區(qū)別免疫動物和自然感染動物。病原保護(hù)性抗原基因序列病原保護(hù)性抗原基因序列插入另一插入另一種無毒或弱毒的微生物基因組種無毒或弱毒的微生物基因組表達(dá)表達(dá)構(gòu)建重組活載體疫苗株?？梢酝瑫r構(gòu)建重組活載體疫苗株?？梢酝瑫r表達(dá)多種抗原，制成多價或多聯(lián)疫苗，表達(dá)多種抗原，制成多價或多聯(lián)疫苗，毒力不返強(qiáng)。毒力不返強(qiáng)。 病原保護(hù)性抗原基因病原保護(hù)性抗原基因連接細(xì)菌連接細(xì)菌或病毒或病毒DNA DNA 直接導(dǎo)入動物體直接導(dǎo)入動物體表表達(dá)抗原達(dá)抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)。制造誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)。制造簡便、成本低、安全、免疫期長

7、、簡便、成本低、安全、免疫期長、熱穩(wěn)定性好，但仍未商品化生產(chǎn)。熱穩(wěn)定性好，但仍未商品化生產(chǎn)。1 1、常規(guī)免疫、常規(guī)免疫血清學(xué)診斷技術(shù)血清學(xué)診斷技術(shù) （1 1）凝集試驗抗原：）凝集試驗抗原： 直接凝集試驗（平板法、試管法）：抗原和直接凝集試驗（平板法、試管法）：抗原和抗體混合后直接發(fā)生凝集反應(yīng)?？贵w混合后直接發(fā)生凝集反應(yīng)。 間接凝集試驗（間接凝集試驗（間接血凝、膠乳凝集和反相間接血凝、膠乳凝集和反相間接血凝試驗間接血凝試驗）。）。 （2）免疫沉淀試驗抗原：包括試管沉淀法、單相免疫擴(kuò)免疫沉淀試驗抗原：包括試管沉淀法、單相免疫擴(kuò)散試驗和雙相免疫擴(kuò)散試驗、免疫電泳、對流免疫電泳等。散試驗和雙相免疫擴(kuò)散

8、試驗、免疫電泳、對流免疫電泳等。（3 3）中和試驗：將特異性血清與相應(yīng)病原混合，用血）中和試驗：將特異性血清與相應(yīng)病原混合，用血清清病毒混合物接種靶動物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)，觀察感染病毒混合物接種靶動物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)，觀察感染情況進(jìn)行疾病診斷。情況進(jìn)行疾病診斷。（4 4）補(bǔ)體結(jié)合試驗抗原：抗原抗體復(fù)合物可以激活補(bǔ)體，）補(bǔ)體結(jié)合試驗抗原：抗原抗體復(fù)合物可以激活補(bǔ)體，出現(xiàn)各種生物學(xué)反應(yīng)。出現(xiàn)各種生物學(xué)反應(yīng)。（5 5）酶聯(lián)免疫吸附試驗（）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISAELISA）：包括直接法、間接法、）：包括直接法、間接法、雙抗體夾心、競爭雙抗體夾心、競爭ELISAELISA等。等。（6 6）熒光抗體染

9、色技術(shù)：直接法、間接法、競爭法等。）熒光抗體染色技術(shù)：直接法、間接法、競爭法等。 （7 7）膠體金免疫檢測技術(shù)。）膠體金免疫檢測技術(shù)。（8 8）免疫組化診斷試劑。）免疫組化診斷試劑。（1 1）生物技術(shù)：單克隆抗體技術(shù)（熒光抗體染色技術(shù)或）生物技術(shù)：單克隆抗體技術(shù)（熒光抗體染色技術(shù)或酶聯(lián)免疫染色技術(shù)）。酶聯(lián)免疫染色技術(shù)）。 （2 2）分子生物學(xué)技術(shù)。）分子生物學(xué)技術(shù)。PCRPCR（RTRTPCRPCR）擴(kuò)增技術(shù)。）擴(kuò)增技術(shù)。熒光定量熒光定量PCRPCR（RTRTPCRPCR）。）?；诤怂嵝蛄袛U(kuò)增技術(shù)（基于核酸序列擴(kuò)增技術(shù)（NASBANASBA）。）。核酸探針。核酸探針。1 1、抗血清：用抗原多

10、次免疫動物，提取血清制成，用于、抗血清：用抗原多次免疫動物，提取血清制成，用于治療或預(yù)防動物疾病。治療或預(yù)防動物疾病。2 2、微生態(tài)制劑：含活菌的制劑，具有調(diào)節(jié)機(jī)體菌群、增、微生態(tài)制劑：含活菌的制劑，具有調(diào)節(jié)機(jī)體菌群、增強(qiáng)免疫力、促生長等。強(qiáng)免疫力、促生長等。3 3、卵黃抗體：用抗原多次免疫禽類，提取卵黃抗體制成，、卵黃抗體：用抗原多次免疫禽類，提取卵黃抗體制成，用于治療或預(yù)防動物疾病。用于治療或預(yù)防動物疾病。4 4、干擾素：用病毒等誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素。、干擾素：用病毒等誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素。5 5、轉(zhuǎn)移因子：用動物臟器或組織提取制成，作為非特異轉(zhuǎn)移因子：用動物臟器或組織提取制成，作為非特異性免疫調(diào)節(jié)劑

11、，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高生產(chǎn)性能。性免疫調(diào)節(jié)劑，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高生產(chǎn)性能。（一）獸用滅活疫苗的制備技術(shù)（一）獸用滅活疫苗的制備技術(shù) 滅活疫苗是用菌（毒）種培養(yǎng)物或含毒組織滅活疫苗是用菌（毒）種培養(yǎng)物或含毒組織或細(xì)胞培養(yǎng)物，經(jīng)化學(xué)滅活劑滅活或加熱處理，或細(xì)胞培養(yǎng)物，經(jīng)化學(xué)滅活劑滅活或加熱處理，使微生物失去活性而保持免疫原性，再加入適當(dāng)使微生物失去活性而保持免疫原性，再加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎┗蚣尤朊庖咦魟┲瞥?。的防腐劑或加入免疫佐劑制成?1.11.1、菌（毒）種菌（毒）種標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)歷史清楚；歷史清楚；生物學(xué)性狀明顯；生物學(xué)性狀明顯；遺傳穩(wěn)定；遺傳穩(wěn)定；優(yōu)良的免疫原性與反應(yīng)原性；優(yōu)良的免疫原性與反應(yīng)原性

12、；毒力在規(guī)定的范圍內(nèi)。毒力在規(guī)定的范圍內(nèi)。原種原種 細(xì)菌原種應(yīng)規(guī)定其培養(yǎng)特性、生化特性、血清學(xué)特性、毒力和細(xì)菌原種應(yīng)規(guī)定其培養(yǎng)特性、生化特性、血清學(xué)特性、毒力和免疫原性等，并作純粹檢查。病毒原種應(yīng)規(guī)定其生物學(xué)特性、理化特免疫原性等，并作純粹檢查。病毒原種應(yīng)規(guī)定其生物學(xué)特性、理化特性、血清學(xué)特性、最小感染量、最小免疫量、安全性等，并純粹。性、血清學(xué)特性、最小感染量、最小免疫量、安全性等，并純粹?；A(chǔ)種子基礎(chǔ)種子 基礎(chǔ)種子由原種制備而來，基礎(chǔ)種子為企業(yè)生產(chǎn)獸用生物基礎(chǔ)種子由原種制備而來，基礎(chǔ)種子為企業(yè)生產(chǎn)獸用生物制品提供種子來源，應(yīng)作系統(tǒng)鑒定，并規(guī)定代次。制品提供種子來源，應(yīng)作系統(tǒng)鑒定，并規(guī)定代次

13、。生產(chǎn)種子生產(chǎn)種子 生產(chǎn)種子由生產(chǎn)企業(yè)用基礎(chǔ)種子進(jìn)行復(fù)壯、繁殖。細(xì)菌等生產(chǎn)種子由生產(chǎn)企業(yè)用基礎(chǔ)種子進(jìn)行復(fù)壯、繁殖。細(xì)菌等生產(chǎn)種子應(yīng)作純粹檢查。病毒生產(chǎn)種子應(yīng)作含量測定和純凈檢查。生產(chǎn)種子應(yīng)作純粹檢查。病毒生產(chǎn)種子應(yīng)作含量測定和純凈檢查。菌種的選育菌種的選育 分離病原分離病原純粹檢驗純粹檢驗致病性鑒定和致病性鑒定和抗原性測定抗原性測定設(shè)計制成滅活疫苗設(shè)計制成滅活疫苗接種實驗室動物接種實驗室動物攻毒攻毒用本動物進(jìn)行保護(hù)率測定用本動物進(jìn)行保護(hù)率測定以確定疫苗候以確定疫苗候選株。選株。毒種的選育毒種的選育 弱毒毒種有天然弱毒株或人工致弱毒弱毒毒種有天然弱毒株或人工致弱毒株；強(qiáng)毒毒株分離株；強(qiáng)毒毒株分離

14、系統(tǒng)鑒定（無污染、毒力強(qiáng)而系統(tǒng)鑒定（無污染、毒力強(qiáng)而穩(wěn)定、免疫原性好、抗原譜廣、與流行毒血清型相穩(wěn)定、免疫原性好、抗原譜廣、與流行毒血清型相符）符）疫苗候選株。疫苗候選株。冷凍真空干燥法冷凍真空干燥法 凍干的菌種一般在凍干的菌種一般在2 28 8 C C保存；凍保存；凍干的毒種一般在干的毒種一般在-20-20 C C以下保存，以下保存，溫度越低保存期越長。溫度越低保存期越長。結(jié)凍保存結(jié)凍保存 有些病毒可用含毒組織在低溫條件下（有些病毒可用含毒組織在低溫條件下（- -2020 C C以下）。以下）。液氮保存液氮保存 有些細(xì)胞結(jié)合毒須在有些細(xì)胞結(jié)合毒須在196196 C C的液氮中保存。的液氮中保

15、存。動物繼代保存動物繼代保存 蟲種一般通過動物繼代保存。蟲種一般通過動物繼代保存。生產(chǎn)檢驗用菌（毒）種實行分級管理制度，種子分生產(chǎn)檢驗用菌（毒）種實行分級管理制度，種子分三級（原種、基礎(chǔ)種子和生產(chǎn)種子）。三級（原種、基礎(chǔ)種子和生產(chǎn)種子）。原種和由國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心或分中心負(fù)原種和由國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心或分中心負(fù)責(zé)保管；基礎(chǔ)種子由菌種中心或分中心負(fù)責(zé)制備、責(zé)保管；基礎(chǔ)種子由菌種中心或分中心負(fù)責(zé)制備、鑒定、保管和供應(yīng)；生產(chǎn)種子由生產(chǎn)企業(yè)自行制備、鑒定、保管和供應(yīng)；生產(chǎn)種子由生產(chǎn)企業(yè)自行制備、鑒定和保管。鑒定和保管。供應(yīng)：菌種中心及分中心統(tǒng)一供應(yīng)。供應(yīng)：菌種中心及分中心統(tǒng)一供應(yīng)。索?。?/p>

16、須持有相應(yīng)級別機(jī)構(gòu)出具的正式公函，說明索?。喉毘钟邢鄳?yīng)級別機(jī)構(gòu)出具的正式公函，說明菌種名稱、型別、數(shù)量及用途。一、二類菌種時，菌種名稱、型別、數(shù)量及用途。一、二類菌種時，必須由?。ㄊ?、自治區(qū)）獸醫(yī)行政主管部門審核，必須由?。ㄊ?、自治區(qū)）獸醫(yī)行政主管部門審核，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)后，方可供應(yīng)。有產(chǎn)品批準(zhǔn)文號者，可農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)后，方可供應(yīng)。有產(chǎn)品批準(zhǔn)文號者，可由生產(chǎn)企業(yè)直接向菌種中心或分中心領(lǐng)取。由生產(chǎn)企業(yè)直接向菌種中心或分中心領(lǐng)取。要求：其他任何單位不得轉(zhuǎn)發(fā)生產(chǎn)用菌（毒）種。要求：其他任何單位不得轉(zhuǎn)發(fā)生產(chǎn)用菌（毒）種。烈性傳染病或人畜共患傳染病的強(qiáng)毒菌（毒）種，烈性傳染病或人畜共患傳染病的強(qiáng)毒菌（毒）種，必

17、須有專職技術(shù)人員領(lǐng)取。必須有專職技術(shù)人員領(lǐng)取。 1.2.1 1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)細(xì)菌的繁殖是以二分裂法進(jìn)行，分四個時期：遲細(xì)菌的繁殖是以二分裂法進(jìn)行，分四個時期：遲緩期（細(xì)菌處于靜止適應(yīng)狀態(tài)）；對數(shù)增殖期緩期（細(xì)菌處于靜止適應(yīng)狀態(tài)）；對數(shù)增殖期（以恒定的速度增殖）；穩(wěn)定期（細(xì)菌增加數(shù)與（以恒定的速度增殖）；穩(wěn)定期（細(xì)菌增加數(shù)與死亡數(shù)保存平衡）；衰退期（活菌數(shù)下降）。死亡數(shù)保存平衡）；衰退期（活菌數(shù)下降）。 需氧菌的培養(yǎng)需氧菌的培養(yǎng) 平板培養(yǎng)法平板培養(yǎng)法 有平板劃線培養(yǎng)法和傾注培養(yǎng)法。有平板劃線培養(yǎng)法和傾注培養(yǎng)法。需氧芽孢菌的培養(yǎng)需氧芽孢菌的培養(yǎng) 將接種材料先接種于液體培養(yǎng)將接種

18、材料先接種于液體培養(yǎng)基中，置水浴加入至基中，置水浴加入至8080 C C，維持，維持15152020分鐘，以殺分鐘，以殺死非芽孢菌，然后在死非芽孢菌，然后在3737 C C作增菌培養(yǎng)。作增菌培養(yǎng)。抑菌分離培養(yǎng)抑菌分離培養(yǎng) 利用某些化學(xué)藥品對某類細(xì)菌的抑利用某些化學(xué)藥品對某類細(xì)菌的抑制或殺滅作用，而對另一些細(xì)菌不生產(chǎn)明顯的作用，制或殺滅作用，而對另一些細(xì)菌不生產(chǎn)明顯的作用，來分離培養(yǎng)某些細(xì)菌。來分離培養(yǎng)某些細(xì)菌。接種試驗動物進(jìn)行培養(yǎng)。接種試驗動物進(jìn)行培養(yǎng)。厭氧菌的培養(yǎng)厭氧菌的培養(yǎng) 生物學(xué)方法生物學(xué)方法 在培養(yǎng)基中加入植物或動物組在培養(yǎng)基中加入植物或動物組織（如馬鈴薯、發(fā)芽谷物、滅菌的新鮮動物織（

19、如馬鈴薯、發(fā)芽谷物、滅菌的新鮮動物組織塊），以消耗養(yǎng)氣或使氧化還原電勢下組織塊），以消耗養(yǎng)氣或使氧化還原電勢下降。用這些培養(yǎng)基培養(yǎng)厭氧菌時，先將培養(yǎng)降。用這些培養(yǎng)基培養(yǎng)厭氧菌時，先將培養(yǎng)基煮沸基煮沸15153030分鐘，降溫后在培養(yǎng)基表面加分鐘，降溫后在培養(yǎng)基表面加一層滅菌的液體石蠟，然后接種培養(yǎng)。一層滅菌的液體石蠟，然后接種培養(yǎng)?；瘜W(xué)方法化學(xué)方法 利用還原作用強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，吸收環(huán)境或利用還原作用強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，吸收環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的養(yǎng)氣或還原氧化型物質(zhì)，降低氧化還原電培養(yǎng)基內(nèi)的養(yǎng)氣或還原氧化型物質(zhì)，降低氧化還原電勢。勢。物理學(xué)方法物理學(xué)方法 利用加熱、密封、抽氣等物理學(xué)方法，利用加熱、密封、抽氣

20、等物理學(xué)方法，以驅(qū)除或隔絕培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基中的養(yǎng)氣，形成無氧以驅(qū)除或隔絕培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基中的養(yǎng)氣，形成無氧狀態(tài)，以利于厭氧菌的生長。常用的有厭氧罐法。狀態(tài)，以利于厭氧菌的生長。常用的有厭氧罐法。有些細(xì)菌特別是初次分離培養(yǎng)，在含有有些細(xì)菌特別是初次分離培養(yǎng)，在含有5 51010CO2CO2環(huán)境下生環(huán)境下生長良好，培養(yǎng)時，可直接利用二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照需要長良好，培養(yǎng)時，可直接利用二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照需要調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱內(nèi)二氧化碳的濃度。調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱內(nèi)二氧化碳的濃度。在沒有條件的實驗室，簡便的做法是用有蓋玻璃容器，放入接在沒有條件的實驗室，簡便的做法是用有蓋玻璃容器，放入接種的培養(yǎng)物后，點燃蠟燭，

21、加蓋密閉容器，由于燃燒耗氧產(chǎn)生種的培養(yǎng)物后，點燃蠟燭，加蓋密閉容器，由于燃燒耗氧產(chǎn)生二氧化碳，蠟燭即熄滅。此時容器內(nèi)含有較高濃度的二氧化碳，二氧化碳，蠟燭即熄滅。此時容器內(nèi)含有較高濃度的二氧化碳，將容器放入適宜溫度培養(yǎng)。將容器放入適宜溫度培養(yǎng)。 病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物，由于病毒缺乏自主復(fù)制的酶病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物，由于病毒缺乏自主復(fù)制的酶系統(tǒng)，不能獨自進(jìn)行物質(zhì)代謝，必須依賴宿主細(xì)胞或細(xì)胞系統(tǒng)，不能獨自進(jìn)行物質(zhì)代謝，必須依賴宿主細(xì)胞或細(xì)胞的某些成分合成核酸和蛋白質(zhì)，所以只能在易感的細(xì)胞內(nèi)的某些成分合成核酸和蛋白質(zhì)，所以只能在易感的細(xì)胞內(nèi)以復(fù)制的方式進(jìn)行增殖，而不能在任何無細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)以復(fù)

22、制的方式進(jìn)行增殖，而不能在任何無細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)生長。生長。除少數(shù)病毒外，大多數(shù)動物病毒能在試驗動物、受除少數(shù)病毒外，大多數(shù)動物病毒能在試驗動物、受精卵和細(xì)胞培養(yǎng)中增殖。精卵和細(xì)胞培養(yǎng)中增殖。病毒細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求病毒細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求1 1）無機(jī)離子）無機(jī)離子 維持滲透壓、提供細(xì)胞酶與代謝活動所需維持滲透壓、提供細(xì)胞酶與代謝活動所需要的物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞貼壁等。常用弱碳酸氫鹽來調(diào)節(jié)培養(yǎng)要的物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞貼壁等。常用弱碳酸氫鹽來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的液的pHpH值，培養(yǎng)液的值，培養(yǎng)液的pHpH值一般維持在值一般維持在7.2-7.47.2-7.4。2) 2) 碳水化合物碳水化合物 常用的碳水化合物是葡萄糖。有些

23、復(fù)雜常用的碳水化合物是葡萄糖。有些復(fù)雜的培養(yǎng)基，還需添加其它糖類或簡單的化合物如乳酸、丙的培養(yǎng)基，還需添加其它糖類或簡單的化合物如乳酸、丙酮酸及醋酸，或代替葡萄糖。酮酸及醋酸，或代替葡萄糖。3) 3) 氨基酸氨基酸 細(xì)胞培養(yǎng)所用的氨基酸為左旋異構(gòu)體。維持細(xì)胞培養(yǎng)所用的氨基酸為左旋異構(gòu)體。維持細(xì)胞生長的最低營養(yǎng)要求需要以下細(xì)胞生長的最低營養(yǎng)要求需要以下1313種氨基酸。種氨基酸。4) 4) 維生素維生素 大部分維生素與細(xì)胞代謝有關(guān)。使用較多的大部分維生素與細(xì)胞代謝有關(guān)。使用較多的維生素主要是維生素主要是B B族維生素，復(fù)雜的培養(yǎng)液中還含有還原劑、族維生素，復(fù)雜的培養(yǎng)液中還含有還原劑、谷胱甘肽、抗

24、壞血酸及谷胱甘肽、抗壞血酸及L L半胱氨酸。在不含血清的培養(yǎng)半胱氨酸。在不含血清的培養(yǎng)液中，常含有脂溶性維生素。液中，常含有脂溶性維生素。5) 5) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 動物血清是蛋白質(zhì)的主要來源，常用的有胎牛動物血清是蛋白質(zhì)的主要來源，常用的有胎牛血清或犢牛血清。血清起營養(yǎng)作用，保護(hù)細(xì)胞或去毒，抑血清或犢牛血清。血清起營養(yǎng)作用，保護(hù)細(xì)胞或去毒，抑制蛋白溶解酶，促進(jìn)細(xì)胞在玻璃上附著和鋪開。制蛋白溶解酶，促進(jìn)細(xì)胞在玻璃上附著和鋪開。6 6）抗生素）抗生素 控制細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)菌的污染，常用的抗生素控制細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)菌的污染，常用的抗生素有青霉素、鏈霉素、制霉菌素或兩性霉素有青霉素、鏈霉素、制霉菌素或兩性霉素

25、B B。 細(xì)胞培養(yǎng)類型細(xì)胞培養(yǎng)類型 （1 1）原代細(xì)胞）原代細(xì)胞 原代細(xì)胞是用動物新鮮組織如胚胎或幼原代細(xì)胞是用動物新鮮組織如胚胎或幼畜的組織或受精卵，經(jīng)胰蛋白酶消化分散后制備而成。病畜的組織或受精卵，經(jīng)胰蛋白酶消化分散后制備而成。病毒對原代細(xì)胞易感，繁殖滴度高，且無致瘤性等。但原代毒對原代細(xì)胞易感，繁殖滴度高，且無致瘤性等。但原代細(xì)胞不能在體外多次傳代，組織原材料的來源不固定，易細(xì)胞不能在體外多次傳代，組織原材料的來源不固定，易混入外源病原，造成外源病毒污染，不易控制其質(zhì)量，影混入外源病原，造成外源病毒污染，不易控制其質(zhì)量，影響產(chǎn)品的純凈和安全性。響產(chǎn)品的純凈和安全性。 2 2） 二倍體細(xì)胞

26、株二倍體細(xì)胞株 原代細(xì)胞原代細(xì)胞次代細(xì)胞次代細(xì)胞多次連續(xù)傳代多次連續(xù)傳代成為二倍體細(xì)胞。二倍體細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)可能發(fā)生變化，成為二倍體細(xì)胞。二倍體細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)可能發(fā)生變化，但細(xì)胞染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣。不能在體外無限制傳代，但細(xì)胞染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣。不能在體外無限制傳代，從幾代至幾十代，兼有原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的優(yōu)點，病毒從幾代至幾十代，兼有原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的優(yōu)點，病毒對其易感，質(zhì)量可控，適用于繁殖病毒。對其易感，質(zhì)量可控，適用于繁殖病毒。 3 3）傳代細(xì)胞系）傳代細(xì)胞系 由腫瘤組織培養(yǎng)而成或由細(xì)胞株轉(zhuǎn)化而由腫瘤組織培養(yǎng)而成或由細(xì)胞株轉(zhuǎn)化而來?？稍隗w外無限制的傳代，其染色體數(shù)不正常，成

27、為異來?？稍隗w外無限制的傳代，其染色體數(shù)不正常，成為異倍體。適宜于許多動物病毒的生長，易于培養(yǎng)，可以建立倍體。適宜于許多動物病毒的生長，易于培養(yǎng)，可以建立種子庫，質(zhì)量易控制。但存在潛在的致瘤性，要求背景情種子庫，質(zhì)量易控制。但存在潛在的致瘤性，要求背景情況應(yīng)詳細(xì)，并作系統(tǒng)鑒定合格后，方可用于繁殖病毒生產(chǎn)況應(yīng)詳細(xì)，并作系統(tǒng)鑒定合格后，方可用于繁殖病毒生產(chǎn)滅活疫苗。滅活疫苗。檢驗項目檢驗項目主細(xì)胞庫主細(xì)胞庫工作工作細(xì)胞庫細(xì)胞庫最高限制最高限制代次細(xì)胞代次細(xì)胞高于最高代次高于最高代次1010代的細(xì)胞代的細(xì)胞顯微鏡檢查顯微鏡檢查細(xì)菌和霉菌細(xì)菌和霉菌支原體支原體病毒病毒細(xì)胞鑒別細(xì)胞鑒別胞核學(xué)檢查胞核學(xué)檢

28、查致瘤和致癌性致瘤和致癌性1) 1) 細(xì)胞保存細(xì)胞保存 收集新鮮細(xì)胞，用細(xì)胞冷凍保護(hù)液收集新鮮細(xì)胞，用細(xì)胞冷凍保護(hù)液( (含含2020犢牛血犢牛血清、清、5 51010二甲基亞砜的營養(yǎng)液二甲基亞砜的營養(yǎng)液) )調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)100100萬一萬一200200萬萬個細(xì)胞個細(xì)胞m1m1，分裝于安瓿中，封口，分裝于安瓿中，封口， 44預(yù)冷預(yù)冷30min30min，封口嚴(yán)密的，封口嚴(yán)密的安瓿移至安瓿移至-50-507070 C C冰箱中預(yù)冷，然后移至液氮罐內(nèi)貯存，可保冰箱中預(yù)冷，然后移至液氮罐內(nèi)貯存，可保存數(shù)年。存數(shù)年。 2) 2) 細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇 將安瓶自液氮罐取出后立即放入將安瓶自液

29、氮罐取出后立即放入37374040溫水中，溫水中，在在lminlmin之內(nèi)使細(xì)胞融化，換液培養(yǎng)至形成細(xì)胞單層。之內(nèi)使細(xì)胞融化，換液培養(yǎng)至形成細(xì)胞單層。3) 3) 細(xì)胞運(yùn)輸細(xì)胞運(yùn)輸 單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶裝滿生長液，以防液體振蕩沖脫細(xì)單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶裝滿生長液，以防液體振蕩沖脫細(xì)胞，或只留少量生長液能覆蓋單層，以防細(xì)胞干燥。細(xì)胞懸液裝于胞，或只留少量生長液能覆蓋單層，以防細(xì)胞干燥。細(xì)胞懸液裝于冰盒保持溫度在冰盒保持溫度在15152525左右。左右。1 1）靜止培養(yǎng)）靜止培養(yǎng) 靜止培養(yǎng)是指將制備好的細(xì)胞懸液分裝在靜止培養(yǎng)是指將制備好的細(xì)胞懸液分裝在適宜的培養(yǎng)瓶中，密閉瓶口，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)或適宜的培養(yǎng)

30、瓶中，密閉瓶口，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)或以松口的容器通入二氧化碳或在含二氧化碳的培養(yǎng)箱中靜以松口的容器通入二氧化碳或在含二氧化碳的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，形成細(xì)胞單層后，接種病毒懸液，止培養(yǎng)，形成細(xì)胞單層后，接種病毒懸液，37373838 C C左右左右繼續(xù)培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)。2 2）轉(zhuǎn)動培養(yǎng)）轉(zhuǎn)動培養(yǎng) 將制備好的細(xì)胞懸液分裝在玻璃或塑料轉(zhuǎn)將制備好的細(xì)胞懸液分裝在玻璃或塑料轉(zhuǎn)瓶中，密閉瓶口，置轉(zhuǎn)瓶機(jī)上，以每小時瓶中，密閉瓶口，置轉(zhuǎn)瓶機(jī)上，以每小時5 51010轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)動培轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)動培養(yǎng)，細(xì)胞在轉(zhuǎn)動培養(yǎng)時，貼附于瓶壁四周，長成細(xì)胞單層養(yǎng)，細(xì)胞在轉(zhuǎn)動培養(yǎng)時，貼附于瓶壁四周，長成細(xì)胞單層后，接種病毒懸液，后，接種病毒

31、懸液，37373838 C C左右繼續(xù)轉(zhuǎn)動培養(yǎng)。左右繼續(xù)轉(zhuǎn)動培養(yǎng)。3 3）懸浮培養(yǎng)）懸浮培養(yǎng) 在懸浮培養(yǎng)罐中通過不斷攪拌，并隨時補(bǔ)在懸浮培養(yǎng)罐中通過不斷攪拌，并隨時補(bǔ)充營養(yǎng)液和校正充營養(yǎng)液和校正pHpH值，使細(xì)胞在懸浮的條件下培養(yǎng)生長。值，使細(xì)胞在懸浮的條件下培養(yǎng)生長。由于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞能及時得到充足的營養(yǎng)和養(yǎng)氣，細(xì)胞生由于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞能及時得到充足的營養(yǎng)和養(yǎng)氣，細(xì)胞生長速度快，產(chǎn)量高，可以得到大量的細(xì)胞。長速度快，產(chǎn)量高，可以得到大量的細(xì)胞。4 4）微載體培養(yǎng)）微載體培養(yǎng) 通過攪拌使微載體懸浮在培養(yǎng)液中，細(xì)通過攪拌使微載體懸浮在培養(yǎng)液中，細(xì)胞通過貼附在微載體固體顆粒表面上生長形成細(xì)胞單層，胞通

32、過貼附在微載體固體顆粒表面上生長形成細(xì)胞單層，細(xì)胞的濃度較大、生長快。微載體培養(yǎng)可采用通氣攪拌法，細(xì)胞的濃度較大、生長快。微載體培養(yǎng)可采用通氣攪拌法，也可采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法進(jìn)行。也可采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法進(jìn)行。雞胚的選擇雞胚的選擇 必須是來源于健康易感的種雞群，其種蛋必必須是來源于健康易感的種雞群，其種蛋必須新鮮，清潔。種雞群必須定期監(jiān)測，不得含有繁殖病毒須新鮮，清潔。種雞群必須定期監(jiān)測，不得含有繁殖病毒的相應(yīng)抗體。的相應(yīng)抗體。雞胚接種途徑和接種方法雞胚接種途徑和接種方法1 1）尿囊腔途徑）尿囊腔途徑 取取9 91111日齡的雞胚，在燈光照射下，在日齡的雞胚，在燈光照射下，在離氣室約離氣室約0.30.30

33、.5cm0.5cm處無大血管的位置作一標(biāo)記，作為接處無大血管的位置作一標(biāo)記，作為接種部位，在氣室和待接種部位各打一小孔，將受精卵橫放種部位，在氣室和待接種部位各打一小孔，將受精卵橫放在蛋盤上，在待接種處垂直刺入針頭約在蛋盤上，在待接種處垂直刺入針頭約0.5cm0.5cm，接種，接種0.050.050.2ml0.2ml病毒溶液，用石蠟封口，繼續(xù)孵化。也可將氣室病毒溶液，用石蠟封口，繼續(xù)孵化。也可將氣室向上放于蛋盤中，在氣室距邊緣約向上放于蛋盤中，在氣室距邊緣約0.5cm0.5cm處打一小孔。沿處打一小孔。沿受精卵長徑平行方向刺入針頭約受精卵長徑平行方向刺入針頭約1cm1cm，注入接種物，注入接種

34、物0.050.050.2ml0.2ml，用石蠟封孔，繼續(xù)孵化。，用石蠟封孔，繼續(xù)孵化。2 2）絨毛尿囊膜途徑）絨毛尿囊膜途徑 在氣室中心鉆一小孔，直接從氣室在氣室中心鉆一小孔，直接從氣室處刺入針頭約處刺入針頭約0.5cm0.5cm，滴入，滴入0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，繼續(xù)垂病毒溶液，繼續(xù)垂直刺入針頭，穿過卵膜和絨毛尿囊膜，拔出針頭。也可用直刺入針頭，穿過卵膜和絨毛尿囊膜，拔出針頭。也可用人工氣室法進(jìn)行，在胚胎附近處和氣室處各打一小孔，然人工氣室法進(jìn)行，在胚胎附近處和氣室處各打一小孔，然后用吸球緊貼氣室小孔處輕輕吸氣，造成負(fù)壓，形成人工后用吸球緊貼氣室小孔處輕輕吸氣，造成負(fù)壓，形

35、成人工氣室，接種氣室，接種0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，用石蠟封孔。病毒溶液，用石蠟封孔。3 3）卵黃囊途徑）卵黃囊途徑 在氣室中心鉆一小孔，垂直刺入針頭約在氣室中心鉆一小孔，垂直刺入針頭約3cm3cm，注入接種物，注入接種物0.20.20.5ml0.5ml，用石蠟封口，繼續(xù)孵化。，用石蠟封口，繼續(xù)孵化。也可在氣室外和卵長徑的也可在氣室外和卵長徑的1/21/2處各打一小孔，并在中間孔處各打一小孔，并在中間孔處刺入針頭約處刺入針頭約1.5cm1.5cm，接種，接種0.10.10.5ml0.5ml病毒溶液，用石蠟病毒溶液，用石蠟封孔。封孔。 4 4）羊膜腔途徑）羊膜腔途徑 將氣室端靠近

36、胚胎側(cè)的卵殼鋸穿，在卵將氣室端靠近胚胎側(cè)的卵殼鋸穿，在卵膜上滴入一滴無菌液體石蠟或生理鹽水，避開血管，在氣膜上滴入一滴無菌液體石蠟或生理鹽水，避開血管，在氣室處刺入針頭約室處刺入針頭約0.5cm0.5cm，在氣室內(nèi)的卵膜上滴入，在氣室內(nèi)的卵膜上滴入0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，繼續(xù)垂直刺入針頭，穿過卵膜和絨毛尿病毒溶液，繼續(xù)垂直刺入針頭，穿過卵膜和絨毛尿囊膜，拔出針頭。或在人工氣室孔處呈囊膜，拔出針頭?；蛟谌斯馐铱滋幊?030 角刺入針頭約角刺入針頭約0.5cm0.5cm，接種，接種0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，用石蠟封孔。病毒溶液，用石蠟封孔。5 5）靜脈途徑）靜脈

37、途徑 畫出直而粗的靜脈處位置，卵殼，加一滴畫出直而粗的靜脈處位置，卵殼，加一滴液體石蠟，使卵膜透明。用長約液體石蠟，使卵膜透明。用長約1.5cm1.5cm的的4 4號針頭插入血管號針頭插入血管內(nèi)注射接種物內(nèi)注射接種物0.02-0.05ml0.02-0.05ml。接種后一般在接種后一般在3737 C C左右繼續(xù)孵化左右繼續(xù)孵化2 27 7天，不必翻天，不必翻蛋。每日照蛋蛋。每日照蛋1 12 2次，棄去接種后次，棄去接種后2424小時內(nèi)非特小時內(nèi)非特異死亡的雞胚，異死亡的雞胚，2424小時后死亡的雞胚隨時撿出，小時后死亡的雞胚隨時撿出，置置4 48 8 C C冷卻冷卻4 42424小時。小時。觀察

38、期結(jié)束，所有活胚同樣冷卻處理。分別收獲觀察期結(jié)束，所有活胚同樣冷卻處理。分別收獲收獲胚體、卵黃囊、尿囊液、絨毛尿囊膜等。收收獲胚體、卵黃囊、尿囊液、絨毛尿囊膜等。收獲期間注意檢查胚胎、絨毛尿囊膜的病變情況、獲期間注意檢查胚胎、絨毛尿囊膜的病變情況、尿囊液是否渾濁等。尿囊液是否渾濁等。病毒病毒胚齡胚齡接種接種途徑途徑培養(yǎng)培養(yǎng)溫度溫度培養(yǎng)培養(yǎng)時間時間雞胚雞胚變化變化收獲收獲材料材料雞新城疫雞新城疫9 91111尿囊腔尿囊腔3737左右左右3 35 5天天出血、死出血、死亡、血凝亡、血凝尿囊液尿囊液雞痘雞痘10101111CAMCAM3737左右左右5 5天天膜上痘皰膜上痘皰CAMCAM雞傳染性雞傳

39、染性喉氣管炎喉氣管炎10101111CAMCAM3737左右左右5 5天天膜上痘皰膜上痘皰CAMCAM狂犬狂犬6 67 7卵黃囊卵黃囊3737左右左右8 81010天天卵黃囊卵黃囊乙腦乙腦6 68 8卵黃囊卵黃囊3737左右左右3 3天天死亡死亡雞胚雞胚 2.4.1 2.4.1 動物接種途徑和接種方法動物接種途徑和接種方法1 1）腦內(nèi)接種）腦內(nèi)接種 給小鼠和地鼠腦內(nèi)接種時，用左手大拇指和食指固定給小鼠和地鼠腦內(nèi)接種時，用左手大拇指和食指固定頭部，消毒左側(cè)眼與耳之間上部注射部位，并于眼后角、耳前緣及顱頭部，消毒左側(cè)眼與耳之間上部注射部位，并于眼后角、耳前緣及顱前后中線所構(gòu)成之位置中間刺入針頭前后

40、中線所構(gòu)成之位置中間刺入針頭2 23mm3mm，乳鼠接種，乳鼠接種0.01-0.02ml0.01-0.02ml，成年鼠和地鼠為成年鼠和地鼠為0.03-0.05ml0.03-0.05ml。給豚鼠和家兔進(jìn)行腦內(nèi)接種時，先作。給豚鼠和家兔進(jìn)行腦內(nèi)接種時，先作麻醉或人工固定，在顱前后中線旁邊麻醉或人工固定，在顱前后中線旁邊5mm5mm平行線與動物瞳孔橫線交叉平行線與動物瞳孔橫線交叉處消毒，用錐刺穿顱骨，然后用針頭刺入處消毒，用錐刺穿顱骨，然后用針頭刺入4 410mm10mm，接種，接種0.1-0.025ml0.1-0.025ml。綿羊腦內(nèi)接種時，先固定在接種臺上，剪去頭頂部的毛，并用硫化鋇綿羊腦內(nèi)接種

41、時，先固定在接種臺上，剪去頭頂部的毛，并用硫化鋇脫毛，碘酊消毒后，在顱頂部中線左或右側(cè)，用錐鉆一小孔，硬腦膜脫毛，碘酊消毒后，在顱頂部中線左或右側(cè)，用錐鉆一小孔，硬腦膜下或腦內(nèi)接種下或腦內(nèi)接種1ml1ml，立即用火棉膠封閉接種孔。，立即用火棉膠封閉接種孔。2 2）皮內(nèi)接種）皮內(nèi)接種 常用于大動物。在背部、頸部、腹部、耳部及尾根部常用于大動物。在背部、頸部、腹部、耳部及尾根部先剪毛，碘酊消毒，以左手拇指和食指提起注射部位皮膚，用針頭斜先剪毛，碘酊消毒，以左手拇指和食指提起注射部位皮膚，用針頭斜面向外，與皮膚面平行刺入面向外，與皮膚面平行刺入2 23mm3mm，接種，接種0.1-0.2ml0.1-

42、0.2ml。注射劑量較大。注射劑量較大時，可分點注射。牛、羊舌面皮內(nèi)注射時，先固定動物，抓住動物舌時，可分點注射。牛、羊舌面皮內(nèi)注射時，先固定動物，抓住動物舌頭并固定，然后接種。頭并固定，然后接種。3 3）皮下注射）皮下注射 豚鼠和家兔可選擇腹部及大腿內(nèi)側(cè)皮膚松弛處，小鼠豚鼠和家兔可選擇腹部及大腿內(nèi)側(cè)皮膚松弛處，小鼠可選擇尾根部或背部，碘酊消毒皮膚處，用針頭水平方向挑起皮膚，可選擇尾根部或背部，碘酊消毒皮膚處，用針頭水平方向挑起皮膚，刺入刺入1.5-2cm1.5-2cm，緩慢注入接種物，緩慢注入接種物0.2-1ml0.2-1ml。4 4）靜脈接種）靜脈接種 小鼠尾靜脈注射時，先將小鼠尾巴在小鼠

43、尾靜脈注射時，先將小鼠尾巴在50505555 C C水中浸泡水中浸泡1 1分鐘，使尾靜脈擴(kuò)張，用鼠缸扣住鼠體，分鐘，使尾靜脈擴(kuò)張，用鼠缸扣住鼠體，露出尾部，用左手拇指和中指將鼠尾拉直，以食指托住尾露出尾部，用左手拇指和中指將鼠尾拉直，以食指托住尾部，消毒注射部位后由靠近尾尖端處平行刺入針頭，再向部，消毒注射部位后由靠近尾尖端處平行刺入針頭，再向下刺入靜脈，慢慢注入下刺入靜脈，慢慢注入0.1-1ml0.1-1ml接種物。家兔耳靜脈注射接種物。家兔耳靜脈注射時，先固定在特制固定器上或人工固定，剃耳毛，用酒精時，先固定在特制固定器上或人工固定，剃耳毛，用酒精棉球涂擦注射部位靜脈棉球涂擦注射部位靜脈1

44、 1分鐘，使靜脈擴(kuò)張，再用左手拇分鐘，使靜脈擴(kuò)張，再用左手拇指及中食指抓住耳尖部，刺入針頭緩慢注射指及中食指抓住耳尖部，刺入針頭緩慢注射1 15ml5ml接種物。接種物。雞翅下肱靜脈注射時，側(cè)臥固定，張開翅膀，拔去注射部雞翅下肱靜脈注射時，側(cè)臥固定，張開翅膀，拔去注射部位的羽毛，碘酊消毒，用針頭斜面朝上刺入靜脈注射位的羽毛，碘酊消毒，用針頭斜面朝上刺入靜脈注射1 15ml5ml接種物。接種物。5 5）腹腔接種）腹腔接種 家兔和豚鼠先在腹股溝處刺入皮家兔和豚鼠先在腹股溝處刺入皮下，進(jìn)針少許后再刺入腹腔注射下，進(jìn)針少許后再刺入腹腔注射0.5-5ml0.5-5ml。小鼠。小鼠腹腔接種時，用右手提起鼠

45、尾，左手拇指和食指腹腔接種時，用右手提起鼠尾，左手拇指和食指捏其頭背部，翻轉(zhuǎn)鼠體使腹部向上，把鼠尾和右捏其頭背部，翻轉(zhuǎn)鼠體使腹部向上，把鼠尾和右后腳夾于小指和無名指之間，右手將針頭平行刺后腳夾于小指和無名指之間，右手將針頭平行刺入腿根處腹部皮下，向下斜行刺入腹腔，注射入腿根處腹部皮下，向下斜行刺入腹腔，注射0.5-1ml0.5-1ml。動物接種后應(yīng)每天觀察，注意動物的活動、飲食、糞便與動物接種后應(yīng)每天觀察，注意動物的活動、飲食、糞便與尿液及皮毛體表等情況，還應(yīng)根據(jù)接種微生物的特性及動尿液及皮毛體表等情況，還應(yīng)根據(jù)接種微生物的特性及動物性別、年齡等的不同而有所側(cè)重，如體溫曲線、特征性物性別、年齡

46、等的不同而有所側(cè)重，如體溫曲線、特征性臨床癥狀的出現(xiàn)及注射部位的特征性變化等。根據(jù)觀察結(jié)臨床癥狀的出現(xiàn)及注射部位的特征性變化等。根據(jù)觀察結(jié)果，選出接種后符合要求的反應(yīng)特征的動物，按照規(guī)定方果，選出接種后符合要求的反應(yīng)特征的動物，按照規(guī)定方法剖殺動物，收集含毒血液或采集含毒組織、器官等。法剖殺動物，收集含毒血液或采集含毒組織、器官等。大量培養(yǎng)細(xì)菌的方法大量培養(yǎng)細(xì)菌的方法 （1 1） 固體培養(yǎng)基表面培養(yǎng)法固體培養(yǎng)基表面培養(yǎng)法 此法是將溶此法是將溶化的肉湯瓊脂培養(yǎng)基，分裝于大扁瓶化的肉湯瓊脂培養(yǎng)基，分裝于大扁瓶( (大型克氏大型克氏瓶瓶) )，滅菌后平放使凝固，經(jīng)培養(yǎng)觀察無污染，滅菌后平放使凝固，經(jīng)

47、培養(yǎng)觀察無污染，在無菌室接入種子液，使均勻分布于表面，平放在無菌室接入種子液，使均勻分布于表面，平放溫室靜置培養(yǎng)，然后傾去凝集水，收集菌苔制成溫室靜置培養(yǎng)，然后傾去凝集水，收集菌苔制成菌懸浮液。菌懸浮液。 （2 2） 液體靜置培養(yǎng)法液體靜置培養(yǎng)法 此法適于一般菌苗的生產(chǎn)，培養(yǎng)此法適于一般菌苗的生產(chǎn)，培養(yǎng)容器可用大玻瓶也可用培養(yǎng)罐容器可用大玻瓶也可用培養(yǎng)罐( (或稱發(fā)酵罐或稱發(fā)酵罐) )，按容器的深，按容器的深度，裝入適量培養(yǎng)基，一般是容器深度的度，裝入適量培養(yǎng)基，一般是容器深度的1 12 22 23 3為宜，為宜，經(jīng)高壓蒸汽滅菌之后，冷至室溫接入細(xì)菌種子，保持適宜經(jīng)高壓蒸汽滅菌之后，冷至室溫接

48、入細(xì)菌種子，保持適宜溫度靜置培養(yǎng)。溫度靜置培養(yǎng)。 （3 3）液體深層通氣培養(yǎng)法）液體深層通氣培養(yǎng)法 使用培養(yǎng)罐（反應(yīng)缸），使用培養(yǎng)罐（反應(yīng)缸），帶有攪拌器和通氣系統(tǒng)，或自動控制裝置，用人工控制培帶有攪拌器和通氣系統(tǒng)，或自動控制裝置，用人工控制培養(yǎng)溫度和通氣量。培養(yǎng)基與佐劑（氫氧化鋁膠、油佐劑等）養(yǎng)溫度和通氣量。培養(yǎng)基與佐劑（氫氧化鋁膠、油佐劑等）均可在缸內(nèi)消毒，在缸內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)及滅活、加佐劑均可在缸內(nèi)消毒，在缸內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)及滅活、加佐劑配苗與分裝等，可大量生產(chǎn)出質(zhì)量較好的菌苗。配苗與分裝等，可大量生產(chǎn)出質(zhì)量較好的菌苗。（1 1） 單層轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)單層轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 是在轉(zhuǎn)鼓條件下發(fā)展起來的，是在

49、轉(zhuǎn)鼓條件下發(fā)展起來的，專用于大量生產(chǎn)細(xì)胞的一種設(shè)備，能自動調(diào)溫、調(diào)專用于大量生產(chǎn)細(xì)胞的一種設(shè)備，能自動調(diào)溫、調(diào)速和報警，靠一臺馬達(dá)驅(qū)動，轉(zhuǎn)瓶架分上、中、下速和報警，靠一臺馬達(dá)驅(qū)動，轉(zhuǎn)瓶架分上、中、下幾層，每層可放一排幾層，每層可放一排1 1萬萬1.51.5萬萬m1m1的轉(zhuǎn)瓶，轉(zhuǎn)瓶是的轉(zhuǎn)瓶，轉(zhuǎn)瓶是擱置在滾軸上，以每小時擱置在滾軸上，以每小時9 91515轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動。國際轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動。國際上普遍使用無毒塑料轉(zhuǎn)瓶，直徑為上普遍使用無毒塑料轉(zhuǎn)瓶，直徑為151520cm20cm，長度，長度為為303080cm80cm，多為一次性使用。，多為一次性使用。（2 2） 培養(yǎng)罐培養(yǎng)培養(yǎng)罐培養(yǎng) 培養(yǎng)罐罐體結(jié)構(gòu)均

50、為不銹培養(yǎng)罐罐體結(jié)構(gòu)均為不銹鋼質(zhì)，可以自動調(diào)溫、調(diào)鋼質(zhì)，可以自動調(diào)溫、調(diào)pHpH值，用無級馬達(dá)、磁值，用無級馬達(dá)、磁攪拌、消泡、控制氧壓、自動補(bǔ)液、換液、自動攪拌、消泡、控制氧壓、自動補(bǔ)液、換液、自動高壓滅菌、自動計算呼吸商等。深層懸浮培養(yǎng)法高壓滅菌、自動計算呼吸商等。深層懸浮培養(yǎng)法能控制一致的細(xì)胞培養(yǎng)條件，可大規(guī)模生產(chǎn)，細(xì)能控制一致的細(xì)胞培養(yǎng)條件，可大規(guī)模生產(chǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)物可通過高速離心棄去培養(yǎng)液，使病毒更胞培養(yǎng)物可通過高速離心棄去培養(yǎng)液，使病毒更加純凈，可減少異性蛋白質(zhì)的含量。加純凈，可減少異性蛋白質(zhì)的含量。（3 3）微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)）微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 微載體的直徑在微載體的直徑在606

51、0250 m250 m，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。此的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。此法兼有懸浮培養(yǎng)法和單層培養(yǎng)法的優(yōu)點，容易大法兼有懸浮培養(yǎng)法和單層培養(yǎng)法的優(yōu)點，容易大量培養(yǎng)細(xì)胞，特別是適合那些不能被懸浮培養(yǎng)法量培養(yǎng)細(xì)胞，特別是適合那些不能被懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞和原代細(xì)胞。培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞和原代細(xì)胞。（4 4） 生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器 反應(yīng)器控制系統(tǒng)由高性能、智能化的反應(yīng)器控制系統(tǒng)由高性能、智能化的微機(jī)控制儀及附屬功能電路和器件所組成，實現(xiàn)了空氣、微機(jī)控制儀及附屬功能電路和器件所組成，實現(xiàn)了空氣、氧氣、氮氣和

52、氧氣、氮氣和C02C02氣體與氣體與pHpH值、溶氧的關(guān)聯(lián)控制，能準(zhǔn)確值、溶氧的關(guān)聯(lián)控制，能準(zhǔn)確控制溫度、轉(zhuǎn)速、控制溫度、轉(zhuǎn)速、pHpH值、溶解氧濃度和液位。細(xì)胞培養(yǎng)用值、溶解氧濃度和液位。細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器可連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，隨時采樣觀察，生產(chǎn)效率提生物反應(yīng)器可連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，隨時采樣觀察，生產(chǎn)效率提高高200200300300，大大降低產(chǎn)品的成本；有完善的由計算，大大降低產(chǎn)品的成本；有完善的由計算機(jī)控制的檢測及培養(yǎng)系統(tǒng)，保證了運(yùn)行的安全；體積小，機(jī)控制的檢測及培養(yǎng)系統(tǒng)，保證了運(yùn)行的安全；體積小，減少了生產(chǎn)車間所需的凈化空間面積；自動化程度高，大減少了生產(chǎn)車間所需的凈化空間面積；自動化程度高，大

53、大降低了污染率。大降低了污染率。 3.1 3.1、 滅活劑滅活劑（1 1） 甲醛溶液甲醛溶液 （福爾馬林）（福爾馬林） 常用的甲醛溶液約含常用的甲醛溶液約含37%37%甲醛氣體甲醛氣體（重量計），為強(qiáng)還原劑，能與微生物蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)合，形成具（重量計），為強(qiáng)還原劑，能與微生物蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)合，形成具有其它性質(zhì)的化合物，而擾亂微生物的代謝，適當(dāng)濃度可使微生物喪有其它性質(zhì)的化合物，而擾亂微生物的代謝，適當(dāng)濃度可使微生物喪失增殖力或毒力，保持其抗原性和免疫原性。用于滅活細(xì)菌的濃度為失增殖力或毒力，保持其抗原性和免疫原性。用于滅活細(xì)菌的濃度為0.1%0.1%0.8%0.8%，用于滅活病毒時濃度為，

54、用于滅活病毒時濃度為0.05%0.05%0.2%0.2%。必要時在甲醛滅。必要時在甲醛滅活后加入焦亞硫酸鈉以終止反應(yīng)?；詈蠹尤虢箒喠蛩徕c以終止反應(yīng)。（2 2） 烷化劑類烷化劑類 為一類含有烷基分子去一個氫原子的化合物，它為一類含有烷基分子去一個氫原子的化合物，它能與另一種化合物作用，將烷基引入形成烷基取代物，其滅活作用主能與另一種化合物作用，將烷基引入形成烷基取代物，其滅活作用主要是烷化病毒要是烷化病毒DNADNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤，引起單鏈斷裂、雙螺旋分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤，引起單鏈斷裂、雙螺旋鏈交聯(lián)，防礙鏈交聯(lián)，防礙RNARNA的合成，從而抑制細(xì)胞的有絲分裂，使病毒完全喪的合成，從而抑

55、制細(xì)胞的有絲分裂，使病毒完全喪失感染力，但不損傷保護(hù)性抗原，廣泛用于病毒的滅活。常用的為失感染力，但不損傷保護(hù)性抗原，廣泛用于病毒的滅活。常用的為BEIBEI和和AEIAEI。（3 3） 丙烯內(nèi)脂（丙烯內(nèi)脂（BPLBPL） 本品為無色有刺激氣味的液本品為無色有刺激氣味的液體，對皮膚、粘膜有強(qiáng)刺激性，并具有致癌性。水中溶解體，對皮膚、粘膜有強(qiáng)刺激性，并具有致癌性。水中溶解度度3737（V/VV/V），能與丙酮、醚和氯仿混合。吸入空氣中），能與丙酮、醚和氯仿混合。吸入空氣中的水分子時緩緩分解成羥基丙酸，其水溶液迅速全部分解，的水分子時緩緩分解成羥基丙酸，其水溶液迅速全部分解，密封保存在玻璃瓶中于密

56、封保存在玻璃瓶中于4 48 8 C C保存較穩(wěn)定。保存較穩(wěn)定。（4 4）硫柳汞鈉鹽）硫柳汞鈉鹽 又稱乙基汞硫代水楊酸鈉，本品為劇又稱乙基汞硫代水楊酸鈉，本品為劇毒品，能溶于水和醇，在空氣中穩(wěn)定，在日光下不穩(wěn)定。毒品，能溶于水和醇，在空氣中穩(wěn)定，在日光下不穩(wěn)定。對細(xì)菌、霉菌和病毒有一定的滅活作用，用于滅活疫苗的對細(xì)菌、霉菌和病毒有一定的滅活作用，用于滅活疫苗的抑菌劑、消毒劑或滅活劑，常用終濃度為抑菌劑、消毒劑或滅活劑，常用終濃度為0.02%0.02%0.01%0.01%。（5 5）苯酚）苯酚 又名石炭酸，為羥基與芳烴族（苯環(huán)與稠丙又名石炭酸，為羥基與芳烴族（苯環(huán)與稠丙環(huán)）直接連接的化合物，其中苯

57、的一部分被酚取代。本品環(huán)）直接連接的化合物，其中苯的一部分被酚取代。本品有毒、腐蝕性及特殊氣味，其滅活機(jī)制是使微生物蛋白質(zhì)有毒、腐蝕性及特殊氣味，其滅活機(jī)制是使微生物蛋白質(zhì)變性和抑制特異酶系統(tǒng)，使其失去活性或感染性。常作為變性和抑制特異酶系統(tǒng)，使其失去活性或感染性。常作為細(xì)菌滅活疫苗的抑菌劑、消毒劑或滅活劑，用量為細(xì)菌滅活疫苗的抑菌劑、消毒劑或滅活劑，用量為0.30.30.5%0.5%。（6 6）結(jié)晶紫）結(jié)晶紫 別名甲基青蓮或甲紫，為一種堿性染料，別名甲基青蓮或甲紫，為一種堿性染料，易溶于醇，能溶于氯仿，不溶于水或醚。其陽離子與微生易溶于醇，能溶于氯仿，不溶于水或醚。其陽離子與微生物蛋白質(zhì)帶陰

58、電的羥基形成弱電力的化合物，防礙微生物物蛋白質(zhì)帶陰電的羥基形成弱電力的化合物，防礙微生物的正常代謝，也可擾亂微生物的氧化還原作用，使電勢太的正常代謝，也可擾亂微生物的氧化還原作用，使電勢太高，不利于微生物的增殖。高，不利于微生物的增殖。1 1）物理滅活方法）物理滅活方法 有熱滅活、射線照射滅活和超聲波有熱滅活、射線照射滅活和超聲波裂解等方法。采用熱滅活方法牛副結(jié)核滅活疫苗和草裂解等方法。采用熱滅活方法牛副結(jié)核滅活疫苗和草魚出血病滅活疫苗。超聲波裂解應(yīng)放冰浴中間斷進(jìn)行，魚出血病滅活疫苗。超聲波裂解應(yīng)放冰浴中間斷進(jìn)行，以免升溫過高影響微生物的抗原性。以免升溫過高影響微生物的抗原性。60Co60Co

59、照射處理，照射處理，應(yīng)根據(jù)被照射物的容量大小選擇照射物與鈷源的距離應(yīng)根據(jù)被照射物的容量大小選擇照射物與鈷源的距離和劑量。和劑量。2 2）化學(xué)滅活方法）化學(xué)滅活方法 早在早在2020世紀(jì)初，就開始用甲醛減毒世紀(jì)初，就開始用甲醛減毒制備破傷風(fēng)類毒素，之后有用甲醛或苯酚滅活制成犬制備破傷風(fēng)類毒素，之后有用甲醛或苯酚滅活制成犬瘟熱疫苗。瘟熱疫苗。2020世紀(jì)世紀(jì)3030年代，用結(jié)晶紫成功地研制出豬年代，用結(jié)晶紫成功地研制出豬瘟疫苗。瘟疫苗。19571957年，采用年，采用 丙烯內(nèi)脂研制成功了口蹄疫丙烯內(nèi)脂研制成功了口蹄疫滅活疫苗等。滅活疫苗等。4.14.1、佐劑作用、佐劑作用 對抗原的作用對抗原的作用

60、 佐劑吸附抗原后增加抗原的表佐劑吸附抗原后增加抗原的表面積，并改變活性基因的構(gòu)型，因而增強(qiáng)抗原的免面積，并改變活性基因的構(gòu)型，因而增強(qiáng)抗原的免疫原性；佐劑和抗原被巨噬細(xì)胞吞噬，對抗原加工疫原性；佐劑和抗原被巨噬細(xì)胞吞噬，對抗原加工處理，賦予較強(qiáng)的免疫原性，增強(qiáng)處理，賦予較強(qiáng)的免疫原性，增強(qiáng)T T細(xì)胞和細(xì)胞和B B細(xì)胞的細(xì)胞的協(xié)同作用；延長抗原在組織內(nèi)的貯存時間，是抗原協(xié)同作用；延長抗原在組織內(nèi)的貯存時間，是抗原緩慢降解和緩慢釋放。緩慢降解和緩慢釋放。對機(jī)體的作用對機(jī)體的作用 引起巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞等細(xì)胞引起巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞等細(xì)胞浸潤，促進(jìn)其繁殖，增強(qiáng)其活性；加速淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化