溶菌酶的制備酶活力和蛋白濃的測定

1、溶菌酶的制備、蛋白質(zhì)的測定及該酶比活力的測定Lysozyme preparation, protein determination and the determination of enzyme specific activity生物制藥工藝學(xué)期末考核討論：溶菌酶的來源： 1922年的一天，正在感冒的英國細(xì)菌學(xué)家Alexander Fleming發(fā)現(xiàn)，把一些鼻粘液加入細(xì)菌的培養(yǎng)基后會引起細(xì)胞的溶解。而這種存在于鼻粘液中的能殺死細(xì)菌的重要物質(zhì)被認(rèn)為是一種酶， Fleming命名其為溶菌酶（ Lysozyme ）。 那時(shí)，溶菌酶不能證明有臨床價(jià)值。但是在酶機(jī)制的研究學(xué)習(xí)方面，溶菌酶扮演了一個(gè)很重要

2、的角色。溶菌酶的結(jié)構(gòu)在1965年,David Phillips和他在牛津的同事以0.2nm分辨率的X射線晶體（X-ray crystallography）結(jié)構(gòu)分析法闡明了溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)(tertiary structure)。溶菌酶的作用機(jī)制： 溶菌酶是一種N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，該酶可以催化水解細(xì)菌細(xì)胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的-1，4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，使內(nèi)容物溢出而是細(xì)菌溶解，阻礙致病細(xì)菌的活性繁殖，并殺死細(xì)菌。溶菌酶的制備 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)看法溶菌酶的制備 本實(shí)驗(yàn)主要是以雞蛋清作為實(shí)驗(yàn)材料，采用D

3、152型樹脂柱層析法除去雜蛋白及等電點(diǎn)法提取溶菌酶的粗品溶菌酶的制備： 雞蛋清中約含有0.3的溶菌酶，分子量為14，000，等電點(diǎn)為11.1，最適溶菌溫度為50，最適pH值為7。雞蛋清溶菌酶化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，當(dāng)pH值在1.211.3范圍內(nèi)劇烈變化時(shí)，其結(jié)構(gòu)仍穩(wěn)定不變，遇熱時(shí)該酶也很穩(wěn)定，在pH47的范圍內(nèi)，100處理lmin，仍保持原酶活性。但在堿性環(huán)境中，該酶對熱穩(wěn)定性較差。其一級結(jié)構(gòu)由129個(gè)氨基酸殘基組成的一條多肽鏈，其穩(wěn)定性主要與多級結(jié)構(gòu)中的4對二硫鍵、氫鍵及疏水鍵相互作用。 人溶菌酶的溶菌活性比雞蛋清溶菌酶高3倍。 溶菌酶的制備 實(shí)驗(yàn)主要儀器、材料及試劑：（一）主要儀器： 高速冷凍離

4、心機(jī)、恒流泵、部分收集器（二）材料及儀器： D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂，新鮮雞蛋，0.1mol/L磷酸鹽緩沖劑，pH7.0 , 氯化鈉，硫酸銨，0.5mol/L NaOH, 0.5mol/L HCl,層析柱（2.6cm*30cm）, 無水乙醇 ， 聚乙二醇溶菌酶的制備實(shí)驗(yàn)步驟：蛋清樣品的制備： 取出蛋清，加入1.5倍體積的0.1mol/L磷酸鹽緩沖劑，攪拌均勻，將pH值調(diào)至8左右，然后用八層紗布過濾，去濾液，量取體積并記錄。溶菌酶的制備 實(shí)驗(yàn)步驟： 陽離子交換層析的制備：1、D152樹脂的處理：將D152樹脂先將蒸餾水洗去雜物，濾除，用1mol/L NaOH攪拌浸泡并攪拌48h，抽濾干N

5、aOH,用蒸餾水洗近pH7.5左右，抽濾干，再用1mol/L HCl按上述方法處理樹脂，知道全部轉(zhuǎn)變?yōu)闅湫停闉V干HCl，用2mol/ L NaOH處理樹脂，是指轉(zhuǎn)變?yōu)殁c型，pH值不低于6.5。吸干溶液，加0.02mol/L的磷酸鹽緩沖劑（pH6.5）平衡樹脂。2、裝柱：取直徑為2.6cm，長度為30cm的層析柱，自頂部注入經(jīng)處理過的上述樹脂懸浮液，關(guān)閉層析柱出口，帶樹脂沉降后，放過量的溶液，再加上一些樹脂，至樹脂沉積至1520cm高度即可。與柱子頂部繼續(xù)加入0.02mol/L的磷酸鹽緩沖劑（pH6.5）平衡樹脂。最終是流出液pH為6.5為止，關(guān)閉柱子出口，保持頁面高出樹脂表面1cm。溶菌酶的

6、制備 裝柱吸附：將上述蛋清液仔細(xì)加入到樹脂頂部，打開出口使其緩慢流如注內(nèi)，流速為1ml/min。 去雜蛋白：取出樹脂，用柱平衡液洗去樹脂上可能有的雜蛋白。在手機(jī)洗脫液的過程中，逐管用紫外分光光度計(jì)檢測雜蛋白的洗脫情況，當(dāng)基線開始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5、濃度為0.02mol/L 磷酸鈉緩沖液洗脫收集洗脫液！ 聚乙二醇濃縮：將上訴洗脫液合并裝入透析袋內(nèi)，至容器外，外面附以聚乙二醇，容器加蓋。酶液中的水分很快就透析到膜外，被聚乙二醇所吸收。然后所得濃縮液之后的透析袋用蒸餾水洗去透析袋膜外的聚乙二醇！小心取的濃縮版的溶菌酶溶液實(shí)驗(yàn)看法： 與教科書P488頁制備方法不同的

7、是：教材所選用的吸附方法使用磁力攪拌器攪拌蛋清液和樹脂，個(gè)人覺得此方法可以用于樣品較小的情況下，大約在300毫升以下！溶菌酶活力、蛋白濃度的測定 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)儀器、材料及試劑 試劑配制 實(shí)驗(yàn)步驟溶菌酶活力、蛋白濃度的測定 實(shí)驗(yàn)儀器、材料及試劑： （一）儀器：721分光光度計(jì) (二) 材料及試劑： 溶菌酶，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，溶壁微球菌干粉，氯化鈉，考馬斯亮藍(lán)G-250, 95%乙醇，85%磷酸，牛血清蛋白（BSA）溶菌酶蛋白濃度的測定 實(shí)驗(yàn)原理： 棕紅色的染料考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后，形成藍(lán)色的復(fù)合物最大吸光度由465nm變?yōu)?95nm。在一定蛋白濃度范圍內(nèi)，蛋白和染料的結(jié)合符

8、合比爾定律。通過測定595nm處的光吸收值的增加量，可對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量測定。 溶菌酶活力、蛋白濃度的測定 試劑的配制：1、測活緩沖液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6.2。2、底物濃度：40mg溶壁微球菌干粉，榮譽(yù)100mL測活緩沖液中。3、考馬斯亮藍(lán)G-250試劑;考馬斯亮藍(lán)G-250 100mL 95%乙醇中，加入100mL 85%鹽酸，用蒸餾水稀釋至1000mL,濾紙過濾。4、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用含有0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0(緩沖液A)配制1mg/mL牛血清蛋白溶液。5、溶菌酶液配制：取上述實(shí)驗(yàn)中所獲得的溶菌酶粗品液，榮譽(yù)100mL的測

9、活緩沖液。溶菌酶蛋白濃度的測定 實(shí)驗(yàn)步驟 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定： 取14支試管按下表，分兩組進(jìn)行平行操作：管號管號0 01 12 23 34 45 56 6標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液溶液/mL/mL0.00 0.00 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03 0.03 0.04 0.04 0.05 0.05 0.06 0.06 緩沖液緩沖液A/mLA/mL0.10 0.10 0.09 0.09 0.08 0.08 0.07 0.07 0.06 0.06 0.05 0.05 0.04 0.04 考馬斯亮考馬斯亮藍(lán)藍(lán)G-G-250/mL250/mL5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.

10、00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 搖勻，搖勻，1h1h內(nèi)以內(nèi)以0 0號管為空白對照，在號管為空白對照，在595nm595nm處比色處比色A A295295溶菌酶蛋白濃度的測定 按上表的數(shù)據(jù)，以A595為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度：測定方法同上。去合適的未知樣品提及，使其測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。根據(jù)所測定的A595值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查處相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的Laing，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）溶菌酶蛋白濃度的測定 實(shí)驗(yàn)備注： 若樣品濃度超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，則適當(dāng)加以稀釋，稀釋至

11、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍之內(nèi)的濃度！溶菌酶活力的測定 實(shí)驗(yàn)原理： 本實(shí)驗(yàn)以溶壁微球菌為底物，通過測定細(xì)菌懸液濁度的變化（OD600）來測定溶菌酶的活性溶菌酶活力的測定 酶活力的測定： 在室溫下，取2個(gè)試管，分別在1號管中加入3.0mL測活緩沖液，2.5mL底物濃度；2號管中加入2.5mL測活緩沖液，2.5mL酶液。以2號管為對照，根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)在721分光光度計(jì)上每隔30s測定1號650nm處的吸光值。按下列表格記錄是按結(jié)果：時(shí)間時(shí)間/s/s0 0303060609090120120150150180180ODOD650650溶菌酶活力的測定 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理酶活力單位（U）：沒在溫室pH6.2條件

12、下，OD650每分鐘強(qiáng)大0.001為1個(gè)酶活力單位U。 比活力=活力單位/mg蛋白根據(jù)測得結(jié)果，計(jì)算各步數(shù)據(jù)填入下表：組分組分體積體積/mL/mL蛋白蛋白/mg/mg* *mLmL-1-1總蛋白總蛋白/mL/mL活力活力/U/U* *mgmg-1-1比活力比活力/U/U* *mgmg-1-1提純倍提純倍數(shù)數(shù)回收率回收率1 1100%100%參考文獻(xiàn)： 生物與制藥工程實(shí)驗(yàn) 主編：萬海同 浙江大學(xué)出版社 P89-94 生物制藥工藝學(xué) 主編：吳梧桐 中國醫(yī)藥科技出版社 P488-489溶菌酶的制備 實(shí)驗(yàn)主要儀器、材料及試劑：（一）主要儀器： 高速冷凍離心機(jī)、恒流泵、部分收集器（二）材料及儀器： D1

13、52大孔弱酸性陽離子交換樹脂，新鮮雞蛋，0.1mol/L磷酸鹽緩沖劑，pH7.0 , 氯化鈉，硫酸銨，0.5mol/L NaOH, 0.5mol/L HCl,層析柱（2.6cm*30cm）, 無水乙醇 ， 聚乙二醇溶菌酶蛋白濃度的測定 實(shí)驗(yàn)原理： 棕紅色的染料考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后，形成藍(lán)色的復(fù)合物最大吸光度由465nm變?yōu)?95nm。在一定蛋白濃度范圍內(nèi)，蛋白和染料的結(jié)合符合比爾定律。通過測定595nm處的光吸收值的增加量，可對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量測定。 溶菌酶活力、蛋白濃度的測定 試劑的配制：1、測活緩沖液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6.2。2、底物濃度：40mg溶壁微球菌干粉，榮譽(yù)100mL測活緩沖液中。3、考馬斯亮藍(lán)G-250試劑;考馬斯亮藍(lán)G-250 100mL 95%乙醇中，加入100mL 85%鹽酸，用蒸餾水稀釋至1000mL,濾紙過濾。4、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用含有0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0(緩沖液A)配制1mg/mL牛血清蛋白溶液。5、溶菌酶液配制：取上述實(shí)驗(yàn)中所獲得的溶菌酶粗品液，榮譽(yù)100mL的測活緩沖液。溶菌酶活力的測定 實(shí)驗(yàn)原理： 本實(shí)驗(yàn)以溶壁微球菌為底物，通過測定細(xì)