試劑盒說明書

1、Cell Counting Kit（CCK試劑盒）目錄號產(chǎn)品名稱規(guī)格包裝025Cell Counting Kit100次1mL026Cell Counting Kit500次5mL027Cell Counting Kit1000次10mL028Cell Counting Kit3000次30mL產(chǎn)品簡介：Cell Counting Kit簡稱CCK 試劑盒，為MTT法的替代方法，是一種基于WST（水溶性四唑鹽，化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。CCK法與其它檢測方法之間

2、的比較：細胞計數(shù)方法MTT法XTT法WST-1法CCK法形成的formazan的水溶性差好好好產(chǎn)品性狀粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用無需預制無需預制檢測靈敏度高很高很高高檢測時間較長較短較短最短檢測波長560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm細胞毒性高，細胞形態(tài)完全消失很低，細胞形態(tài)不變很低，細胞形態(tài)不變很低，細胞形態(tài)不變試劑穩(wěn)定性一般較差一般很好大批量樣品檢測可以非常適合非常適合非常適合便捷程度一般便捷便捷非常便捷CCK用途：藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗操作說明：一、制作標準曲線（測定細胞具體數(shù)量時）1、先用細胞計

3、數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量，然后接種細胞。2、按比例（例如：1/2比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每組3-6個復孔。3、接種后培養(yǎng)2-4小時使細胞貼壁，然后加CCK試劑培養(yǎng)一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標（X軸），OD值為縱坐標（Y軸）的標準曲線。根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量（試用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數(shù)量以及加入CCK后的培養(yǎng)時間。）二、細胞活性檢測1、在96孔板中接種細胞懸液（100L/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)（在37,5% CO2的條件下）。2、向每孔加入10 L

4、的CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。5、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 L 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。三、細胞增值-毒性檢測1、在96孔板中配置100L的細胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24小時（在37，5% CO2的條件下）。2、向培養(yǎng)板加入10L不同濃度的待測物質(zhì)。3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間（例如：6、12、24或48小時）。12后/24h4、想每孔加入1

5、0L CCK溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。（2h后）6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。7、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 L 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。 備注：建議先做

6、幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入CCK試劑后的培養(yǎng)時間。（怎么判斷哪個時間好？）有條件的情況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔減的差異。加入CCK試劑時，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基頁面下加，容易產(chǎn)生氣泡，會干擾OD值讀數(shù)。白細胞可能需要培養(yǎng)較長時間。當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 L 培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 L 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK溶液。如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在43

7、0-490 nm之間的濾光片，但是450nm濾光片的檢測靈敏度最高。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。活力計算：細胞活力*（）=A(加藥)-A（空白）/A（0加藥）-A（空白） ×100A（加藥）：具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度A（0加藥）：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度*細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力1.一個孔中應接種多少個細胞當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 l 培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈

8、敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 l 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。2.能否用384孔板進行試驗？可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養(yǎng)基體積20%的量。3.能否用24孔板進行試驗？可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液。4.酚紅會影響檢測嗎？不會。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。5.CCK-8與胸苷結(jié)合檢測之間是否有

9、相關(guān)性？有。然而，請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此結(jié)果可能不同。6.CCK-8能否檢測細菌細胞？可以檢測E.coli，但不能檢測酵母細胞。向100 l E.coli培養(yǎng)液中加入10 l CCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4個小時或過夜。7.CCK-8穩(wěn)定嗎？CCK-8在0-5下能夠保存至少6個月，在-20下避光可以保存1年。如果需要長期保存，我們推薦-20的儲藏條件。8.如果沒有450 nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？還可使用450 nm到490 nm之間的濾光片。9.如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差？可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并

10、混勻后加樣。10.CCK-8是什么顏色？應該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會影響測定。11.CCK8能否對活細胞進行染色？不能。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8)，并通過電子載體1Methoxy PMS將活細胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲也是高度水溶性的，因此CCK8不能對細胞進行染色。12.CCK8檢測溶液對細胞是否有毒？CCK8溶液自身因為高濃度的1Methoxy PMS的存在而具有一點毒性。但是，加到培養(yǎng)基中的CCK8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長時間的培養(yǎng)，如過夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一個細胞培養(yǎng)液在CCK8檢測后還可以用于其他細

11、胞增殖檢測，如結(jié)晶紫檢測，中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進行長時間培養(yǎng)時，先檢測一下細胞在加入CCK8培養(yǎng)后的活力。13.在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？有時會有影響。如果藥物具有還原性，會和CCK8發(fā)生顯色反應，增加吸光度。解決辦法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基 (加CCK8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。14.每次測定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？可能會有以下幾個原因： 1. 當在培

12、養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。 一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。 2. 有可能會因為CCK8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。 3. 每孔的細胞數(shù)量過多或過少。請預先在1,000100,000個/孔范圍內(nèi)摸索條件。15.如何設定空白對照？在不含細胞的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。16.哪些物質(zhì)會影響CC

13、K8的測定？當有還原性物質(zhì)存在時會影響CCK8的測定，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。17.在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細胞數(shù)量，如何解決？可以縮短加入CCK8后的培養(yǎng)時間。例如：可以把加入CCK8試劑后的培養(yǎng)時間由2小時縮短為1小時。18.設定參比波長的目的是什么？必須設定嗎？不一定要設定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。19.說明書上僅寫了96孔板的測定方法，如果使用24孔板貨12孔板，應該加多少量CCK-

14、8試劑？一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10。20.在CCK-8顯色過程中，如何終止反應？有一下幾種方法（96孔板）： 1、 在顯色反應后，將培養(yǎng)板仿佛4冰箱內(nèi)。 2、 每孔加10 l 0.1 M HCL溶液。 3、 每孔加10 l 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應停止后，應在24小時之內(nèi)測定。21.必須預培養(yǎng)細胞嗎？不一定。如果要向保持細胞的最好狀態(tài)，建議預培養(yǎng)細胞。如果不做細胞預培養(yǎng)，細胞內(nèi)的脫氫酶可能會不穩(wěn)定。也有人不做細胞預培養(yǎng)，但在做標準曲線和檢測時需要統(tǒng)一檢測條件。22.如果加入的藥物中含有金屬，是否會有影響？金屬對CCK-8顯色有影響

15、。當終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話，將會100%抑制。23.CCK-8試劑的保存條件？在避光條件下CCK-8試劑在4可保存一年。如果需要保存較長時間的話，推薦在-20下保存。但是CCK-8若反復解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4冰箱內(nèi)保存。24.預培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細胞計數(shù)嗎？一般情況下用胰蛋白酶處理對數(shù)增長期的細胞，用血球計數(shù)盤計數(shù)，制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數(shù)細胞的話，可以預培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計數(shù)盤進行計數(shù)。25.CCK-8對于不同的細胞，

16、靈敏度是否一樣？不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數(shù)量來解決。26.懸浮細胞和貼壁細胞在數(shù)量上有何區(qū)別？懸浮細胞由于染色比較困那，一般需要增加細胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數(shù)量過大，有時吸光度會超過酶標儀的讀數(shù)。27.應該每次做標準曲線嗎？建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態(tài)不一定一樣，對于狀態(tài)不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標準曲線。28.有時在藥物

17、作用情況下，細胞已經(jīng)死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計算細胞數(shù)量？不能。由于CCK-8是通過和細胞內(nèi)的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數(shù)量，如果細胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測定的細胞數(shù)量將會比真實值高，不能真實反映活細胞數(shù)量，建議采用別的方法測定。29.實驗之前，是否需要先檢測一下培養(yǎng)基和CCK-8是否會反應？建議使用一個孔作一下檢測，因為有培養(yǎng)基中可能含有氧化還原反應的物質(zhì)，在正式實驗之前有必要先確認培養(yǎng)基和CCK-8是否反應。一般正常在的OD值應該在0.4以下。Heterozygosity with respect to Zfp148 causes complete loss o

18、f fetal germ cells during mouse embryogenNature Genetics 33, 172 - 176 (01 Feb 2003)SMYD3 encodes a histone methyltransferase involved in the proliferation of cancer cellsNature Cell Biology 6, 731 - 740 (01 Aug 2004)DEAD-box RNA helicase subunits of the Drosha complex are required for processing of

19、 rRNA and a subsetNature Cell Biology 9, 604-611 (2007)A Vital Role for Ape1/Ref1 Protein in Repairing Spontaneous DNA Damage in Human CellsMolecular Cell 2005 17: 463-470.Blockade of the natriuretic peptide receptor guanylyl cyclase-A inhibits NF-?B activation and alleviThe Journal of Clinical Inve

20、stigation July 2001 Vol. 108 Number 2Cannabinoids promote embryonic and adult hippocampus neurogenesis and produce anxiolytic- and antidepJ. Clin. Invest., Nov 2005; 115: 3104 - 3116c-Fos protein as a target of anti-osteoclastogenic action of vitamin D, and synthesis of new analogsJ. Clin. Invest. F

21、eb 2006; 116: 528 - 535.Autotaxin has lysophospholipase D activity leading to tumor cell growth and motility by lysophosphatiJ. Cell Biol., 158(2), 227-233 (2002)Involvement of autophagy in trypsinogen activation within the pancreatic acinar cellsJ. Cell Biol. Vol. 181 No. 7 10651072 2008Pioglitazon

22、e Prevents Acute and Chronic Cardiac Allograft RejectionCirculation, Jun 2006; 113: 2613 - 2622.NF- B inhibits TNF-induced accumulation of ROS that mediate prolonged MAPK activation and necrotic ceThe EMBO Journal 22, 3898 - 3909 (01 Aug 2003)Novel nuclear and mitochondrial glycosylases revealed by

23、disruption of the mouse Nth1 gene encoding aThe EMBO Journal 21, 3486 - 3493 (01 Jul 2002)Abnormal accumulation of hyaluronan matrix diminishes contact inhibition of cell growth and promotes PNAS 2002 99: 3609-3614A rescue factor abolishing neuronal cell death by a wide spectrum of familial Alzheime

24、rs disease gePNAS May 22, 2001 vol. 98 no. 11 63366341Inhibition of apoptosis in acute promyelocytic leukemia cells leads to increases in levels of oxidizePNAS 2004 101: 11560-11565Interaction between the Alzheimers survival peptide humanin and insulin-like growth factor-binding PNAS October 28, 200

25、3 vol. 100 no. 22 1304213047Mapping dominant-negative mutations of anthrax protective antigen by scanning mutagenesisPNAS 2003 100: 13803-13808Nitric oxide-induced apoptosis in pancreatic cells is mediated by the endoplasmic reticulum stressPNAS 2001 98: 10845-10850Normotonic cell shrinkage because

26、of disordered volume regulation is an early prerequisite to apoptosPNAS 2000 97: 9487-9492Signals transducers and activators of transcription (STAT)-induced STAT inhibitor-1 (SSI-1)/suppressoPNAS 2000 97: 5405-5410Targeted deletion of apoptosis signal-regulating kinase 1 attenuates left ventricular

27、remodelingPNAS 2003 100: 15883-15888Toxin-induced resistance in Bacillus anthracis lethal toxin-treated macrophagesPNAS 2003 100: 12426-12431AML1-ETO and C-KIT mutation/overexpression in t(8;21) leukemia: Implication in stepwise leukemogenesiPNAS January 25, 2005 vol. 102 11041109Mitochondrial Antis

28、ense RNA for Cytochrome C Oxidase (MARCO) Can Induce Morphologic Changes and Cell Blood,Vol 90, No 11 (December 1), 1997: pp 4567-4577Hydrogen peroxide generated extracellularly by receptorligand interaction facilitates cell signalinPNAS 2005 April 5; 102(14): 50445049Alteration of phosphatidylinosi

29、tol 3-kinase cascade in the multilobulated nuclear formation of adult PNAS 2005 102: 15213-15218Honokiol overcomes conventional drug resistance in human multiple myeloma by induction of caspase-depBlood, Sep 2005; 106: 1794 - 1800Identification of Clostridium difficile toxin B cardiotoxicity using a

30、 zebrafish embryo model of intoPNAS, 2006 103: 14176-14181Age-dependent cell death and the role of ATP in hydrogen peroxide-induced apoptosis and necrosisPNAS, 2006 103: 1727-1731Ligand-induced internalization selects use of common receptor neuropilin-1 by VEGF165 and semaphorin3Blood, May 2006; 107

31、: 3892 - 3901.Oridonin, a diterpenoid extracted from medicinal herbs, targetsAML1-ETO fusion protein and shows poteBLOOD, 15 APRIL 2007, 109, NUMBER 8, 3441-3450Expression of Livin, an antiapoptotic protein, is an independent favorable prognostic factor in childBLOOD, 15 JANUARY 2007, VOLUME 109, NUMBER 2, 471-477Cholera toxin induces malignant glioma celldifferentiation via the PKA/CREB pathwayPNAS, 2007, Vol.