課題3--血紅蛋白的提取和分離1

1、 體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過(guò)體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過(guò)程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。物大分子的基本原理。凝膠色譜法凝膠色譜法 電泳法電泳法 緩沖溶液緩沖溶液 它們?cè)谘t蛋白的提取中分別起到什么作用。它們?cè)谘t蛋白的提取中分別起到什么作用。 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 電泳法分離樣品的原理電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機(jī)理緩沖溶液的組成和作用機(jī)理凝膠色譜法的原理和方法凝膠色譜法的原理和方法 樣品的處理樣品的處理 色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。色譜柱填料的處理和色譜柱的

2、裝填。血血每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血紅蛋白因含有血紅蛋白因含有血紅素血紅素而而呈呈紅色。紅色。選用一定的選用一定的物理或化學(xué)物理或化學(xué)的方法分離具有不同物的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子生物大分子。根據(jù)蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性各種特性的差異，如的差異，如分子的形狀和分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離等等，可以用來(lái)分離不同種不同種類(lèi)類(lèi)

3、的蛋白質(zhì)。的蛋白質(zhì)。 大多數(shù)凝膠是由大多數(shù)凝膠是由多糖類(lèi)化合物多糖類(lèi)化合物（如（如葡聚糖或葡聚糖或瓊脂糖瓊脂糖）構(gòu)成的）構(gòu)成的多孔多孔小球體，小球體，內(nèi)部有許多貫穿的內(nèi)部有許多貫穿的通道通道。 根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量的大的大 小，利用具有小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來(lái)進(jìn)行分離。的凝膠，來(lái)進(jìn)行分離。 當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢移動(dòng)速度較慢; ;而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入

4、而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。分離。分離蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì) 在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿酸或強(qiáng)堿的影響使原來(lái)溶液的影響使原來(lái)溶液pHpH值基本保持值基本保持不變的混不變的混合溶液。合溶液。 能夠抵制能夠抵制外界的酸和堿外界的酸和堿對(duì)溶液對(duì)溶液PHPH值值的影響，的影響，維持維持pHpH基本不變?；静蛔?。 通常由通常由1 12 2 種緩沖劑種緩

5、沖劑溶解于水溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不同同PHPH范圍內(nèi)范圍內(nèi)使用的緩沖液。使用的緩沖液。, , 利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的pHpH環(huán)境，保證環(huán)境，保證 血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察( () )和科和科 學(xué)研究學(xué)研究( () )磷酸緩沖液磷酸緩沖液帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。 許多重要的生物大分子，如多肽、許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pHpH下，下，這

6、些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳、凝膠電泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝膠電泳。凝膠電泳。 1 1、在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用、在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用十二烷基硫酸十二烷基硫酸

7、鈉（鈉（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-N,N-亞甲基雙丙亞甲基雙丙烯酰胺在烯酰胺在引發(fā)劑引發(fā)劑和和催化劑催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）丙烯酰胺和交聯(lián)劑丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng)亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng) 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率遷移率取決取決于它所帶于它所帶凈電荷凈電荷的多少以及的多少以及分子的大

8、小分子的大小等因素。等因素。 （為了消除為了消除凈電荷對(duì)遷移率的影響，凈電荷對(duì)遷移率的影響，可以在凝膠中加入可以在凝膠中加入SDSSDS。 。由幾條肽鏈組成。由幾條肽鏈組成的的蛋白質(zhì)復(fù)合體蛋白質(zhì)復(fù)合體在在SDSSDS的作用下會(huì)的作用下會(huì)，因此測(cè)定的結(jié)果只是因此測(cè)定的結(jié)果只是。SDSSDS能與各能與各種蛋白質(zhì)形成種蛋白質(zhì)形成，SDSSDS所帶負(fù)電荷所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子。因而掩。因而掩蓋了蓋了，使電泳遷移率完，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。全取決于分子的大小。用用SDSSDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法教學(xué)反饋教學(xué)反饋 1凝膠色譜法是根據(jù)（

9、凝膠色譜法是根據(jù)（ ）分離蛋白質(zhì)的有效方法。）分離蛋白質(zhì)的有效方法。 A分子的大小分子的大小 B相對(duì)分子質(zhì)量的大小相對(duì)分子質(zhì)量的大小 C帶電荷的多少帶電荷的多少 D溶解度溶解度2緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來(lái)緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來(lái)維持（維持（ ）基本不變。）基本不變。 A溫度溫度 B pH C滲透壓滲透壓 D氧氣濃度氧氣濃度3電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷（ ）的電極移動(dòng)。）的電極移動(dòng)。 A相同相同 B相反相反 C相對(duì)相對(duì) D相向相向4. 哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（ ）與氧氣的）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。運(yùn)輸有關(guān)。 A血紅蛋白血紅蛋白 B肌紅蛋白肌紅蛋白 C肌動(dòng)蛋白肌動(dòng)蛋白 D肌球蛋白肌球蛋白BBBA5血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（血液由血漿和各種血