高中生物競賽輔導(dǎo)課件—DNA復(fù)制1

1、復(fù)制概況復(fù)制概況復(fù)制體系復(fù)制體系復(fù)制的起始復(fù)制的起始、延伸延伸與與終止終止其他原核生物的復(fù)制體系其他原核生物的復(fù)制體系其他形式的復(fù)制其他形式的復(fù)制真核生物的復(fù)制過程真核生物的復(fù)制過程DNA復(fù)制復(fù)制本講內(nèi)容提綱本講內(nèi)容提綱1 DNA復(fù)制的基本機理半保留復(fù)制復(fù)制的基本機理半保留復(fù)制2 DNA復(fù)制的起點、方向和方式復(fù)制的起點、方向和方式3 DNA聚合酶和聚合酶和DNA聚合反應(yīng)聚合反應(yīng)4 復(fù)制的基本過程復(fù)制的基本過程5 DNA復(fù)制的半不連續(xù)性復(fù)制的半不連續(xù)性第一組：復(fù)制概況第一組：復(fù)制概況 1 、DNA復(fù)制的基本機理半保留復(fù)制復(fù)制的基本機理半保留復(fù)制半保留復(fù)制：半保留復(fù)制： DNADNA在復(fù)制時，以親

2、代在復(fù)制時，以親代DNADNA的每的每一條鏈作模板，合成完全相同的兩個雙鏈一條鏈作模板，合成完全相同的兩個雙鏈子代子代DNADNA，每個子代，每個子代DNADNA中都含有一條親代中都含有一條親代DNADNA鏈。鏈。全保留復(fù)制半保留復(fù)制混合復(fù)制 DNA半保留復(fù)制的實驗依據(jù)：半保留復(fù)制的實驗依據(jù)： 1958年年 Meselson & Stahl E.coli 放射性同位素（放射性同位素（15N）標(biāo)記）標(biāo)記 CsCl密度梯度離心密度梯度離心StahlMeselson培養(yǎng)一代培養(yǎng)一代培養(yǎng)二代培養(yǎng)二代培養(yǎng)三代培養(yǎng)三代親代子一代子二代輕帶重帶混合帶 DNA半保留復(fù)制的半保留復(fù)制的意義：保證意義：保

3、證DNA代謝的穩(wěn)代謝的穩(wěn)定性。定性。 經(jīng)過多代的復(fù)制，經(jīng)過多代的復(fù)制，親代的遺傳特征完整無誤的親代的遺傳特征完整無誤的傳遞給子代，傳遞給子代，子代子代DNA仍可以保持與最初親本仍可以保持與最初親本的一致性。的一致性。 穩(wěn)定性是相對的，變異是絕對的穩(wěn)定性是相對的，變異是絕對的在各種理化因素的作用下，在各種理化因素的作用下，DNA會發(fā)生損傷；會發(fā)生損傷；在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的過程中，在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的過程中，DNA會發(fā)生錯誤；會發(fā)生錯誤；在生長發(fā)育的過程中，在生長發(fā)育的過程中，DNA可能進行修飾、刪可能進行修飾、刪除、擴增和重排。除、擴增和重排。2 、DNA復(fù)制的起點、方向和方式復(fù)制的起點、方向和方式2.1

4、DNA復(fù)制的起點復(fù)制的起點 原核生物原核生物DNA的復(fù)制是在的復(fù)制是在DNA分子的特分子的特定位點開始的，這一位點稱為復(fù)制起點定位點開始的，這一位點稱為復(fù)制起點（ori ）。）。 原核生物的染色體只有一個復(fù)制起點，原核生物的染色體只有一個復(fù)制起點，復(fù)制從起點開始，進行到終點結(jié)束，完復(fù)制從起點開始，進行到終點結(jié)束，完成整個染色體成整個染色體DNA分子的復(fù)制。分子的復(fù)制。復(fù)制子復(fù)制子(replicon)或復(fù)制單元：或復(fù)制單元： DNA分子上一個獨立的復(fù)制單位，分子上一個獨立的復(fù)制單位，DNA復(fù)復(fù)制從起點開始，進行到終點結(jié)束。制從起點開始，進行到終點結(jié)束。 一個復(fù)制子包括一個復(fù)制起點和復(fù)制終點。一個

5、復(fù)制子包括一個復(fù)制起點和復(fù)制終點。n 原核生物單復(fù)制起點，整個染色體只有一個復(fù)原核生物單復(fù)制起點，整個染色體只有一個復(fù)制子制子n 真核生物真核生物: 多復(fù)制起點，一個多復(fù)制起點，一個genome中有多中有多個復(fù)制子。個復(fù)制子。復(fù)制起點具有特征性：復(fù)制起點具有特征性： 細(xì)菌、酵母以及葉綠體、線粒體等的細(xì)菌、酵母以及葉綠體、線粒體等的DNA復(fù)制復(fù)制起點已經(jīng)被克隆，其核酸序列的共同特點是起點已經(jīng)被克隆，其核酸序列的共同特點是富富含含A-T序列序列。2.2 DNA復(fù)制的方向：復(fù)制的方向：p 多數(shù)多數(shù)DNA雙向復(fù)制雙向復(fù)制p 單向進行：單向進行：有些病毒（如腺病毒等）、有些病毒（如腺病毒等）、質(zhì)粒質(zhì)粒D

6、NA及線粒體及線粒體DNA。 圖：圖：DNA復(fù)制的方向性復(fù)制的方向性復(fù)制起點復(fù)制起點復(fù)制起點復(fù)制起點復(fù)制叉復(fù)制叉 復(fù)制叉復(fù)制叉（Replication fork）：染色體中參與復(fù)制的）：染色體中參與復(fù)制的活性區(qū)域，即復(fù)制正在發(fā)生的位點?；钚詤^(qū)域，即復(fù)制正在發(fā)生的位點。 復(fù)制眼（復(fù)制眼（replication eye）：）：電子顯微鏡下觀察正在復(fù)制電子顯微鏡下觀察正在復(fù)制的的DNA，復(fù)制的區(qū)域形如一，復(fù)制的區(qū)域形如一只眼睛。只眼睛。 復(fù)復(fù) 制制 起起 點點 復(fù)復(fù) 制制 叉叉 親親 代代 鏈鏈 子子 代代 鏈鏈 復(fù)復(fù) 制制 叉叉真核生物真核生物DNA分子復(fù)制具有多個復(fù)制子，多個復(fù)制眼分子復(fù)制具有多

7、個復(fù)制子，多個復(fù)制眼2.3 DNA復(fù)制的方式復(fù)制的方式 雙向等速復(fù)制：大多數(shù)生物體內(nèi)雙向等速復(fù)制：大多數(shù)生物體內(nèi)DNA。 不等速復(fù)制：如枯草桿菌。不等速復(fù)制：如枯草桿菌。 對稱復(fù)制：大多數(shù)生物體內(nèi)的對稱復(fù)制：大多數(shù)生物體內(nèi)的DNA的兩條鏈同的兩條鏈同時復(fù)制。時復(fù)制。 不對稱復(fù)制：在一定時期內(nèi)不對稱復(fù)制：在一定時期內(nèi)DNA只復(fù)制一條鏈只復(fù)制一條鏈的情況。的情況。 如線粒體的如線粒體的D-環(huán)復(fù)制和噬菌體的滾環(huán)復(fù)制方式。環(huán)復(fù)制和噬菌體的滾環(huán)復(fù)制方式。 3 DNA聚合酶聚合酶和和DNA聚合反應(yīng)聚合反應(yīng) DNA的復(fù)制是由的復(fù)制是由DNA聚合酶負(fù)責(zé)完聚合酶負(fù)責(zé)完成的，按照模板催化成的，按照模板催化合成新合

8、成新DNA鏈。鏈。 Poly(核苷酸核苷酸)n3-OH dNTP Poly(核苷酸核苷酸)n+13-OH 2Pi 4 DNA復(fù)制的半不連續(xù)性復(fù)制的半不連續(xù)性DNA在復(fù)制時如何同時作為模板合成其互補鏈在復(fù)制時如何同時作為模板合成其互補鏈? 岡崎片段的大?。簩槠蔚拇笮。涸松餅樵松餅?000-2000bp，真核生真核生物物100bp。前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈（leading strand）后隨鏈（后隨鏈（lagging strand）岡崎片段岡崎片段（Okazaki fragment）復(fù)制叉移動的方向復(fù)制叉移動的方向半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制:1. DNA聚合酶聚合酶2. DNA連接酶連接酶3. 螺旋

9、酶螺旋酶4. 單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白5. DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶第二組：第二組：復(fù)制體系復(fù)制體系 1 DNA聚合酶聚合酶 DNA的復(fù)制是由的復(fù)制是由DNA聚合酶負(fù)責(zé)完聚合酶負(fù)責(zé)完成的，按照模板催化成的，按照模板催化合成新合成新DNA鏈。鏈。 共同性質(zhì)共同性質(zhì):1 以脫氧核苷酸三磷酸以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為原料為原料;2 需要模板需要模板;3 不能起始合成新的不能起始合成新的DNA鏈鏈, 需要引物需要引物;4 合成方向合成方向53 。DNA聚合酶聚合酶（DNA polymerase） 1 DNA聚合酶聚合酶 1.1 大腸桿菌的大腸桿菌的DNA聚合酶聚合酶 1.2 DNA聚合酶和復(fù)制

10、的忠實性聚合酶和復(fù)制的忠實性 1.3 其它生物的聚合酶其它生物的聚合酶 1.4 DNA聚合酶的引物聚合酶的引物1.1 大腸桿菌的大腸桿菌的DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶: 主要參與損傷主要參與損傷DNA的修復(fù)，同的修復(fù)，同時在半保留復(fù)制中有輔助作用，時在半保留復(fù)制中有輔助作用， DNA聚合酶聚合酶II：主要參與主要參與DNA修復(fù)，修復(fù)， DNA聚合酶聚合酶III：DNA合成的主要復(fù)制酶。合成的主要復(fù)制酶。1.1.1 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 DNA polymerase，DNApol1956年，年，Arthur Kornberg(1)理化性質(zhì)：理化性質(zhì)： 一條多肽鏈，一條多肽

11、鏈，103KD。 含一個含一個Zn2+ 400個分子個分子/細(xì)胞，細(xì)胞， 37催化約催化約1000bp/min, （2）功能特點功能特點 1） 5 3聚合功能聚合功能 2） 3 5外切活性外切活性 3） 5 3外切活性外切活性 4） 5 3內(nèi)切酶活性內(nèi)切酶活性 5 3 G T A A G T C G C T C A G C 5 3 35外切 核 酸酶水解部位圖 11-20 DNA 聚合酶的 35外切酶活性 (仿 D.Freifelder: MOLECULAR BIOLOGY 1983,Fig.8-16) 5 3 G T A 3 5 G G A C A A G A G A C G T T C T

12、 5 3 內(nèi)切酸酶水解部位 圖 11-22 DNA 聚合酶的內(nèi)切酸活性 (仿 D.Freifelder: MOLECULAR BIOLOGY 1983,Fig.8-20)切口移位反應(yīng)缺口平移標(biāo)記缺口平移標(biāo)記DNA探針探針 枯草桿菌蛋白酶處理后，成兩個片段，枯草桿菌蛋白酶處理后，成兩個片段，大片段大片段68KD，稱為，稱為Klenow片段。片段。 1.1.2 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶(DNApol)：(1) 理化性質(zhì)：理化性質(zhì)： 120KD， 100個酶分子個酶分子/細(xì)胞，細(xì)胞， 活性只有活性只有DNA pol的的5%。（2）功能特點：）功能特點： 53聚合活性聚合活性 35外切活性，

13、外切活性， 沒有沒有53外切活性外切活性 不是復(fù)制的主要聚合酶不是復(fù)制的主要聚合酶, 與與DNA損傷損傷修復(fù)有關(guān)。修復(fù)有關(guān)。1.1.3 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 (DNApol)(1) 理化性質(zhì)：理化性質(zhì)：10-20個酶分子個酶分子/細(xì)胞。細(xì)胞?；钚允腔钚允荄NA pol I的的15倍倍, pol II300倍。倍。聚合反應(yīng)需要聚合反應(yīng)需要ATPATP的存在。的存在。反應(yīng)有很高的速度和高度的進行性。反應(yīng)有很高的速度和高度的進行性。進行性：聚合酶結(jié)合于單鏈模板不解離的能力進行性：聚合酶結(jié)合于單鏈模板不解離的能力。DNApol 全酶有十種共全酶有十種共18個亞基個亞基（2）結(jié)構(gòu)組成和功能

14、特點）結(jié)構(gòu)組成和功能特點 DNA聚合酶聚合酶含有以下含有以下4個不同的功能組分：個不同的功能組分：1）核心聚合酶）核心聚合酶: 由由、三種亞基組成。三種亞基組成。功能：功能： 亞基具有亞基具有5-3方向合成方向合成DNA的催化活性。的催化活性。 亞基具有亞基具有3 -5外切核酸酶的校對功能，外切核酸酶的校對功能， 亞基促進亞基促進亞基的作用。亞基的作用。 2）二聚體二聚體 亞基以二聚體、環(huán)狀的形式環(huán)繞著亞基以二聚體、環(huán)狀的形式環(huán)繞著DNA并在并在DNA自由滑動，構(gòu)成一個滑動鉗。自由滑動，構(gòu)成一個滑動鉗。 功能：滑動鉗把全酶束縛在模板功能：滑動鉗把全酶束縛在模板DNA上，上，保證高度的進行性。保

15、證高度的進行性。 3）復(fù)合物復(fù)合物 含有含有5種亞基：種亞基：21111。 功能功能:復(fù)合物是復(fù)合物是滑動鉗的載體，幫助滑動鉗的載體，幫助滑動鉗結(jié)滑動鉗結(jié)合到合到DNA上。上。 復(fù)合物有依賴復(fù)合物有依賴DNA的的ATP酶活性。酶活性。 二聚體自己并不能組裝到二聚體自己并不能組裝到DNA上，通過上，通過復(fù)合物復(fù)合物與與ATP協(xié)同作用催化協(xié)同作用催化ATP的水解而組裝到的水解而組裝到DNA上上的。的。 4）二聚體二聚體 功能：功能：2 將兩個核心酶分子和一個將兩個核心酶分子和一個復(fù)合復(fù)合物連接起來。物連接起來。 亞基是一個依賴于亞基是一個依賴于DNA的的ATP酶。酶。 表表 E.coli 中的三種

16、中的三種DNA多聚酶多聚酶 DNApolDNApol DNA pol 結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)分子量分子量 103 KD120KD850 KD構(gòu)成構(gòu)成 單體單體單體單體異多聚體異多聚體分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞 40010010-20功功能能53聚合聚合酶酶 +（新生鏈合成）新生鏈合成）35外切外切酶酶 +53外切外切酶酶 + 1生物學(xué)活性生物學(xué)活性核苷酸數(shù)核苷酸數(shù)min100050約約50,0000.0515 1.2 DNA聚合酶和復(fù)制的忠實性聚合酶和復(fù)制的忠實性 復(fù)制過程的忠實性是保證生物體遺傳信息復(fù)制過程的忠實性是保證生物體遺傳信息準(zhǔn)確傳遞的一個必要條件，它取決于堿基準(zhǔn)確傳遞的一個必要條件，它取決于堿基配對

17、的專一性。配對的專一性。 DNA聚合酶可以通過以下方式提高互補堿聚合酶可以通過以下方式提高互補堿基選擇的專一性?；x擇的專一性。1）堿基配對原則維持）堿基配對原則維持DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性：復(fù)制的準(zhǔn)確性：2） DNA聚合酶本身的校對作用聚合酶本身的校對作用 DNApol的的35外切酶活性外切酶活性可切除錯配堿可切除錯配堿基，使得基，使得DNA復(fù)制錯誤的機會只有復(fù)制錯誤的機會只有10-8-10-10。 3) 需要需要RNA引物起始引物起始DNA復(fù)制，復(fù)制，DNApol只能從只能從引物的引物的3 端延伸端延伸DNA 堿基配對協(xié)同性使得最初幾個堿基錯配率高，堿基配對協(xié)同性使得最初幾個堿基錯配率高，而而R

18、NA引物最終被降解而避免錯誤。引物最終被降解而避免錯誤。4）后隨鏈的不連續(xù)合成）后隨鏈的不連續(xù)合成 因其有利于錯配堿基的校正因其有利于錯配堿基的校正 1.3 其他生物的聚合酶其他生物的聚合酶 噬菌體也編碼噬菌體也編碼DNA聚合酶，它們是聚合酶，它們是T4、T5、T7、SPIO1。這些酶都有這些酶都有5-3合成酶活合成酶活性和性和3-5外切校正活性。外切校正活性。 真核生物中發(fā)現(xiàn)了真核生物中發(fā)現(xiàn)了5種不同的種不同的DNA聚合酶，聚合酶，分別為分別為、。 前四個位于細(xì)胞核中，而前四個位于細(xì)胞核中，而是是線粒體酶。線粒體酶。1.4 DNA聚合酶的引物聚合酶的引物(primer) DNA復(fù)制為什么需要

19、引物？復(fù)制為什么需要引物？ DNA聚合酶只能催化聚合酶只能催化dNTP到已有核酸鏈到已有核酸鏈的游離的游離3-OH上，而不能從游離核苷酸上，而不能從游離核苷酸起始起始DNA鏈的合成。鏈的合成。 DNA聚合酶需要引物來提供聚合酶需要引物來提供3-OH末端，末端，然后在其上加入核苷酸來延伸然后在其上加入核苷酸來延伸DNA鏈。鏈。DNA復(fù)制需要合成引物復(fù)制需要合成引物 通常細(xì)胞先在模板上合成一段通常細(xì)胞先在模板上合成一段RNA序列，序列，然后通過然后通過DNA聚合酶延伸聚合酶延伸RNA鏈的鏈的3-OH。 為什么需要一段為什么需要一段RNA序列作為引物來進序列作為引物來進行行DNA復(fù)制呢復(fù)制呢? 這可

20、能盡量減少這可能盡量減少DNA復(fù)制起始處的突變復(fù)制起始處的突變有關(guān)。有關(guān)。引物合成引物合成1）大部分生物利用模板上合成一段大部分生物利用模板上合成一段RNA序列序列作為作為引物；引物；2）環(huán)狀）環(huán)狀DNA在內(nèi)部在內(nèi)部形成一個缺口形成一個缺口產(chǎn)生引物末端，產(chǎn)生引物末端，如滾環(huán)復(fù)制如滾環(huán)復(fù)制3）直接引發(fā)合成，）直接引發(fā)合成，特殊蛋白質(zhì)特殊蛋白質(zhì)把核苷酸直接引入到把核苷酸直接引入到聚合酶的催化位點。如腺病毒。聚合酶的催化位點。如腺病毒。2 DNA連接酶（連接酶（ DNA Ligase ） 1967年，世界上數(shù)個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)該酶。年，世界上數(shù)個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)該酶。 2.1 基本性質(zhì)：能將兩段

21、基本性質(zhì)：能將兩段DNA拼接起來的酶，催化拼接起來的酶，催化DNA相鄰的相鄰的5磷酸基團和磷酸基團和3羥基末斷之間形成磷羥基末斷之間形成磷酸二酯鍵，封閉酸二酯鍵，封閉DNA單鏈缺口。單鏈缺口。 1）EATPEAMPppi（動物細(xì)胞和噬菌體）動物細(xì)胞和噬菌體） ENADEAMPNMN（E.coli 等細(xì)菌）等細(xì)菌） 2）E-AMP上的上的AMP轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到DNA的的5-PO4上使其活化上使其活化3）活化的）活化的5-PO4與相鄰的與相鄰的3-OH作用形成作用形成35 磷酸二酯鍵，并釋放出磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。2.2 功能特點：功能特點：3 解旋酶解旋酶 (helicase)功能特點：功能特

22、點： 解旋酶可以促使解旋酶可以促使DNA在復(fù)制叉處打開雙鏈，解在復(fù)制叉處打開雙鏈，解開氫鍵，開氫鍵，形成單鏈形成單鏈。 利用利用ATP水解獲得的能量來打斷氫鍵水解獲得的能量來打斷氫鍵 二聚體或六聚體形式存在二聚體或六聚體形式存在表11-3 E.coli及噬菌體的解旋酶 解 旋 酶 結(jié) 構(gòu) 功 能DnaB330 K 六聚體結(jié)合與 OriC,Ori參與前引發(fā)分離雙鏈，水解ATP ,提供能量。rep 蛋白66 K 單體ATP 依賴性解旋酶，在X174 滾環(huán)復(fù)制中推進復(fù)制叉PriA(w 蛋白)82 K 單體X174Rf 形成中參與前引發(fā)體 35移動取代SSB，識別特異位點。TraY/I多聚體F 因子滾環(huán)復(fù)制中解鏈?；? 蛋白58 KT7 噬菌體復(fù)制中延 5 3解鏈。4 單鏈結(jié)合蛋白（單鏈結(jié)合蛋白（SSBP）功能特點：功能特點： 在在E.coli 中以四聚體存在中以四聚體存在 177個個aa組成組成 74KDa SSBP與螺旋酶不一樣，不具備酶的活性，不和與螺旋酶不一樣，不具備酶的活性，不和ATP結(jié)合。結(jié)合。 SSBP可以重復(fù)使用