第八章 重組DNA與現(xiàn)代生物技術(shù)

1、第八章 重組DNA與現(xiàn)代生物技術(shù)第一節(jié) 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)主要用于提高農(nóng)作物的抗逆能力,以及改良農(nóng)作物的品質(zhì)和利用植物生產(chǎn)藥物等方面.1.抗蟲轉(zhuǎn)基因植物2.抗病轉(zhuǎn)基因植物 3.其他抗逆轉(zhuǎn)基因植物抗除草劑抗凍番茄 4.利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)轉(zhuǎn)基因賴氨酸玉米變色矮牽?；蚬こ淘谵r(nóng)業(yè)上的應(yīng)用：1）高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和具優(yōu)良品質(zhì)的品種 用基因工程的方法可以改善糧食作物的蛋白質(zhì)含量。如“轉(zhuǎn)基因高賴氨酸玉米”植株。 2）抗逆性品種 將細(xì)菌的抗蟲、抗病毒、抗除草劑、抗鹽堿、抗干旱、抗高寒等抗性基因轉(zhuǎn)移到作物體內(nèi)，將從根本上改變作物的特性。如轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。 第二節(jié) 重組DNA與藥品生產(chǎn)美國批準(zhǔn)上市的基因

2、工程藥品有人類胰島素、人類生長因子、白介素、干擾素、牛型生長激素疫苗等。我國自1986年“863”計(jì)劃實(shí)施以來，至2000年已有15種基因工程藥物，3個(gè)基因工程疫苗和數(shù)十個(gè)重組診斷試劑投放市場。人用蛋白質(zhì)藥物傳統(tǒng)生產(chǎn)的弊端： 成本高；產(chǎn)率和產(chǎn)量低；原料易污染，不安全。 基因工程藥物可以克服傳統(tǒng)方法生產(chǎn)蛋白藥物的困難，原因： 可解決蛋白藥物的產(chǎn)量問題，只需生長旺盛的表達(dá)系統(tǒng)；微生物容易大量培養(yǎng)，能夠降低成本；基因工程生產(chǎn)人源的蛋白質(zhì)藥物安全、有效；通過基因工程隊(duì)編碼基因改造以改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使之更穩(wěn)定，活性更高，副作用更低?；蚬こ趟幬锷a(chǎn)的主要步驟一、分離編碼蛋白藥物的DNA或cDNA：提取蛋

3、白，純化，測部分序列，推測編碼序列，合成探針，從文庫中篩選基因； 用已經(jīng)純化的蛋白質(zhì)制備抗體，然后從表達(dá)文庫中篩選二、優(yōu)化基因表達(dá)的條件： 表達(dá)蛋白的功能； 表達(dá)量的多少一、人生長激素的生產(chǎn) 人生長激素（hGH）是腦下垂體前葉分泌的蛋白質(zhì)類激素，對人體除神經(jīng)組織以外的所有組織（包括骨骼、肌肉、結(jié)締組織、毛發(fā)和皮膚等）都有促進(jìn)生長的功能。間接地還能促進(jìn)脂肪和糖類的降解，增強(qiáng)蛋白質(zhì)和核酸的合成作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，生長激素在治療侏儒癥、燒傷、肥胖、出血性潰瘍及在維持肌肉的活力、改善心臟功能、延緩衰老、防治骨質(zhì)疏松、促進(jìn)傷口愈合等方面均具有重要的作用。此外，對免疫系統(tǒng)也具有一定的增強(qiáng)作用。 以前，

4、要獲得生長激素，需解剖尸體，從大腦的底部摘取垂體，并從中提取生長激素。 1979年，人類首次利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)了人的生長激素，1985年美國FDA首先批準(zhǔn)了重組人生長激素上市。人們從 450 L大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長激素，相當(dāng)于6萬具尸體的全部產(chǎn)量。 應(yīng)用DNA重組技術(shù)，在大腸桿菌中表達(dá)人生長激素，有兩條不同的技術(shù)路線“其一是生產(chǎn)胞內(nèi)型的重組人生長激素；其二是生產(chǎn)分泌型的重組人生長激素。技術(shù)關(guān)鍵是：構(gòu)建能夠在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)人生長激素的表達(dá)載體二、影響我國生物制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素1.研發(fā)投入 國外：23億美元/基因藥物 國內(nèi)：10多年來，對生物制藥的總投入僅有40多億元 2.

5、投融資與產(chǎn)業(yè)化模式 國外：政府、企業(yè)、科研院所三位一體，大、中小企業(yè)結(jié)成戰(zhàn)略聯(lián)盟 國內(nèi)：政府、企業(yè)、科研院所各自為政或偶爾兩兩結(jié)合，投融資機(jī)制不健全3.市場競爭環(huán)境 國外：市場競爭激烈，但秩序較好，市場份額 多為大公司所壟斷 國內(nèi)：仿制與重復(fù)建設(shè)、重復(fù)生產(chǎn)現(xiàn)象非常嚴(yán) 重，出現(xiàn)了一哄而上的過熱現(xiàn)象，市場惡 性競爭，無法實(shí)現(xiàn)規(guī)模效益4.產(chǎn)品信譽(yù) 國外：產(chǎn)品信譽(yù)較好 國內(nèi)：產(chǎn)品信譽(yù)低，“出現(xiàn)信洋不信中，買洋不 買中”現(xiàn)象5.創(chuàng)新與知識產(chǎn)權(quán) 國外：創(chuàng)新意識高，特別注重知識產(chǎn)權(quán)（主要 是專利、商標(biāo)）保護(hù) 國內(nèi)：創(chuàng)新意識低，嚴(yán)重缺乏自主知識產(chǎn)權(quán)產(chǎn)品，當(dāng)前，我國已產(chǎn)業(yè)化的21種基因工程藥物和疫苗中只有3種擁

6、有自主知識產(chǎn)權(quán)，其他均為仿制產(chǎn)品第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程所謂蛋白質(zhì)工程，就是利用基因工程手段，包括基因的定點(diǎn)突變和基因表達(dá)對蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，以期獲得性質(zhì)和功能更加完善的蛋白質(zhì)分子?；緝?nèi)容包括：一、按實(shí)際要求，周密審慎地設(shè)計(jì)新型蛋白質(zhì)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)；二 、通過基因克隆等程序，在適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞中表達(dá)比天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和特性更加優(yōu)良的新型蛋白質(zhì)；三、分離純化符合商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的新型蛋白質(zhì)目前，主要集中在改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)這一領(lǐng)域。一般步驟：（1）分離純化需改造的目的蛋白（2）對純化的蛋白進(jìn)行氨基酸測序、x射線晶體衍射分析、核磁共振分析等。3）通過蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)核酸引物或探針，從文庫中獲取編碼該蛋白的基因。（4）設(shè)計(jì)

7、改造方案并進(jìn)行改造基因序列。（5）把改造的基因片斷插入適當(dāng)?shù)妮d體，表達(dá)產(chǎn)物。（6）分離純化產(chǎn)物并進(jìn)行功能檢測。一、定點(diǎn)誘變策略定義：指在DNA水平上改變氨基酸的編碼序列。 實(shí)施前提： 要改變的基因編碼區(qū)精確的核苷酸序列 要引入的氨基酸變化1. 用M13DNA進(jìn)行的寡核苔酸介導(dǎo)誘變這是進(jìn)行定點(diǎn)誘變最常用的方法，利用了M13噬菌體生活周期中單鏈形式的存在。由于技術(shù)上的原因，采用這種方法通常只有I一5的噬茵斑含有突變的基因。因此，人們又對它做了各種改進(jìn)。改進(jìn)的用M13DNA進(jìn)行的寡核苷酸介導(dǎo)的誘變2. 寡核苷酸介導(dǎo)的PCR誘變此方法不用把基因克隆到M13載體上，也不用為了提高突變率而使用dut-、u

8、ng-系統(tǒng)，而且不用將M13上的突變基因再亞克隆到表達(dá)載體上。但是需要合成兩對引物。3. 改進(jìn)型雙引物誘變把PCR技術(shù)應(yīng)用于M13噬菌體上進(jìn)行基因誘變。 這種方法較為簡便易行，且得到突變體的機(jī)率較高，因此是現(xiàn)在較常用的一種獲得突變體的方法。4.重疊延伸誘變以線性DNA為模板，進(jìn)行兩次PCR。1.5 簡并寡核苷酸引物如果不知道要將原來的氨基酸突變?yōu)槟囊环N新的氨基酸，那么人們通常都采用在一點(diǎn)引入突變，產(chǎn)生所有可能的氨基酸的方法。這種方法有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：不要求知道特定氨基酸的功能；可能有意想不到的收獲。1.6 隨機(jī)誘變隨機(jī)誘變就是在突變位置上隨機(jī)地引入一種突變。缺點(diǎn)，即對每一個(gè)克隆都需要檢測其蛋白的活性

9、，找到所需蛋白后，再對其基因進(jìn)行測序，只有這時(shí)才能確知是哪一個(gè)核苷酸發(fā)生了突變。寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變應(yīng)注意的各種因素（1）關(guān)于單鏈DNA模板的制備（2）關(guān)于寡核苷酸突變因誤的設(shè)計(jì)和選擇：a.引物盡可能避免重復(fù)序列及形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)；b.引物突變堿基的兩側(cè)有足夠長的互補(bǔ)序列；c.選用的寡核苷酸突變引物不能與載體上其他未點(diǎn)形成穩(wěn)定雜合體；（3）關(guān)于突變引物與模板DNA的退火和引物延伸的條件：a.突變引物與模板DNA的比率；b.延伸反應(yīng)（4）關(guān)于DNA聚合酶的選擇二、定點(diǎn)誘變在蛋白質(zhì)工程中的應(yīng)用人們對酶、對蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，目的是使它們更適合于工業(yè)生產(chǎn)。 提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是工業(yè)生產(chǎn)中很重要的課題

10、。一般來說提高蛋白的穩(wěn)定性包括以下幾個(gè)方面： 延長酶的半壽期； 提高酶的熱穩(wěn)定性： 延長藥用蛋白的保存期； 抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失。 1.提高T4溶菌酶的熱穩(wěn)定性理論上，在沒有二硫鍵的蛋白分子中導(dǎo)入二硫鍵可以提高蛋白熱穩(wěn)定性。在T4溶菌酶中只有兩個(gè)半胱氨酸（Cys54和Cys97），但這兩個(gè)半胱氨酸不能形成二硫鍵，經(jīng)三維分析發(fā)現(xiàn)，第3位的異亮氨酸與第97位的半胱氨酸距離非常近，所以把異亮氨酸突變?yōu)榘腚装彼帷?.對干擾素（IFN）的改造人的干擾素（IFN）的cDNA在大腸桿菌中表達(dá)，產(chǎn)物的抗病毒活性為106U/mg，只有天然糖基化蛋白的10%，而且雖然合成的干擾素量很多，但多數(shù)以無

11、活性的二聚體形式存在。人們分析發(fā)現(xiàn)，IFN有3個(gè)Cys，因此推測可能形成了不正確的二硫鍵。根據(jù)已知結(jié)構(gòu)的類似蛋白IFN，其分子中Cys29和Cys138形成了二硫鍵，該位置與IFN分子中Cys31和Cys141位置類似，所以推測IFN分子中的另一個(gè)Cys17可能帶有游離的巰基，于是把它突變?yōu)镾er。3.改進(jìn)1抗胰蛋白酶1抗胰蛋白酶是一種在肝臟中合成后被釋放到血液的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其生理功能是保護(hù)組織免受彈性蛋白酶的消化作用。彈性蛋白酶是由嗜中性白細(xì)胞分泌的一種產(chǎn)物，可對肺造成損害，甚至發(fā)展成肺氣腫。健康人體中，當(dāng)1抗胰蛋白酶通過與彈性蛋白酶發(fā)生不可逆的結(jié)合，便會(huì)在其358位的甲硫氨酸和35

12、9位的絲氨酸間被切割，同時(shí)使后者活性受到抑制，經(jīng)過這種切割后，復(fù)合物便難以解離，從而通過血液排出體外。1抗胰蛋白酶358位的甲硫氨酸非常容易氧化成甲硫氨酸亞砜，氧化后由于分子過大無法嵌到彈性蛋白酶的活性部位，失去了結(jié)合能力。應(yīng)用定點(diǎn)誘變技術(shù)把1抗胰蛋白酶的第358位的甲硫氨酸置換成纈氨酸，便可獲得抗氧化的1抗胰蛋白酶突變。4.組織型纖溶酶原激活劑的改造組織型纖溶酶原激活劑（tPA）是人體各種組織均可合成的一種絲氨酸蛋白酶。它能切割纖溶酶原形成纖溶酶，來分解血栓。所以重組的人tPA在臨床上用作溶栓劑。天然的tPA半壽期僅有5分鐘，在治療中難以持續(xù)地發(fā)揮藥效。作為一種糖基化蛋白，很容易為肝臟受體所

13、特異識別，于是將其分子中120位的天冬酰胺換成谷氨酰胺，半壽期大大延長。5.對其他的定點(diǎn)改造a. 改變酶的活性b. 對水蛭素的改造c. 對人的生長激素的改造d. 胰島素的蛋白質(zhì)工程第四節(jié) 抗體工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有一套復(fù)雜的防御系統(tǒng)保護(hù)自己不受有毒物質(zhì)和病原物的侵害，其中一部分防御反應(yīng)就是淋巴細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的蛋白，這些蛋白可以在其他免疫系統(tǒng)蛋白的幫助下與外來物質(zhì)結(jié)合，并抵消其生物學(xué)功能。這些特異的蛋白，就是抗體(antibody)；相對于抗體，誘發(fā)產(chǎn)生抗體的外來物質(zhì)即稱為抗原(antigen)?？贵w：由B細(xì)胞識別抗原后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的一類與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合，具有免疫功能的球蛋白。免

14、疫球蛋白IgG的基本結(jié)構(gòu)圖抗 體 分 子 的 酶 切 片 段一、抗體的結(jié)構(gòu)一個(gè)抗體分子(即免疫球蛋白)通常包括兩個(gè)完全相同的輕鏈分子(L)和兩個(gè)完全相同的重鏈分子(H)，這4條鏈在氫鍵和二硫鍵共同作用下連在一起，形成一個(gè)“Y”字型結(jié)構(gòu)。可變區(qū)（V區(qū)），恒定區(qū)（C區(qū)）二、抗體的功能Fab片段保存有抗原結(jié)合活性和特異性，與Fab片段不同，F(xiàn)c片段沒有抗原結(jié)合活性，但它是抗體結(jié)合上抗原后激活機(jī)體免疫反應(yīng)的主要部位，它主要激活以下免疫反應(yīng)：激活補(bǔ)償功能系統(tǒng)，該系統(tǒng)可分解細(xì)胞膜，激活巨噬細(xì)胞，并且產(chǎn)生信號以激活免疫反應(yīng)系統(tǒng)的其他組分。產(chǎn)生抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)毒性（ADCC）。Fab區(qū)域結(jié)合一個(gè)可溶性抗原后

15、，抗體的Fc部分可結(jié)合巨噬細(xì)胞的Fc受體，使巨噬細(xì)胞吞食并毀滅抗原抗體復(fù)合體。三、單克隆抗體抗原決定簇：抗原的某些部分，比大分子小得多的有特異性的化學(xué)基團(tuán)，有的僅有6、7個(gè)氨基酸組成。由于一個(gè)抗原通常都有幾個(gè)不同的抗原決定簇，因此每個(gè)免疫淋巴細(xì)胞都可能產(chǎn)生一種針對某一個(gè)抗原決定簇的抗體，這些由同一抗原而產(chǎn)生的不同的抗體統(tǒng)稱為多克隆抗體。單克隆抗體：由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的針對某一特定抗原決定簇的單一類型的抗體。1. 雜交瘤細(xì)胞系的產(chǎn)生注意：在制備單克隆抗體時(shí)，提供骨髓瘤細(xì)胞的動(dòng)物和進(jìn)行免疫反應(yīng)制備B細(xì)胞的動(dòng)物最好來自同一品系。篩選標(biāo)記:HAT培養(yǎng)基；次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）選擇系

16、統(tǒng)2.雜交瘤細(xì)胞的鑒定收集培養(yǎng)基加到另一個(gè)預(yù)先包埋好目標(biāo)抗原的培養(yǎng)板上，清洗，加入二抗，通常在二抗上連有一個(gè)酶，可使一種無色底物變成有色物質(zhì)，如果某個(gè)培養(yǎng)孔出現(xiàn)了顏色，就說明該培養(yǎng)基中含有對抗原特異的抗體。三、單克隆抗體的改造及應(yīng)用人們可以利用雜交瘤技術(shù)連續(xù)生產(chǎn)純化的單克隆抗體，抗體現(xiàn)在已被人們視為是一種有效的藥物。面臨的問題：交叉反應(yīng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)及過敏反應(yīng) ?，F(xiàn)在的目標(biāo)是獲得高藥效低免疫性的人類單克隆抗體。1.單克隆抗體靶向制劑靶向制劑：指借助載體、配體或抗體將藥物通過局部給藥、胃腸道或全身血液循環(huán)而選擇地濃集于靶組織、靶器官、靶細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的制劑。制備單克隆抗體靶向制劑的方法主要有三種

17、 a.藥物與抗體直接交聯(lián) b.藥物通過小分子交聯(lián)劑與抗體連接 c.藥物通過大分子載體與抗體相連2.雜交人鼠單克隆抗體鼠源單克隆抗體臨床應(yīng)用中會(huì)引起人的抗鼠反應(yīng)，產(chǎn)生人的抗鼠抗體（HAMA）,于是構(gòu)建嵌合抗體。嵌合抗體(chimeric antibody)從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體。 特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性，同時(shí)保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。3.人源單克隆抗體a. 分離出產(chǎn)生特殊抗體的人B細(xì)胞，用病毒轉(zhuǎn)化使之可以培養(yǎng)生長。b. 把人源免疫干細(xì)胞導(dǎo)入缺失大部分免疫細(xì)胞的小鼠體內(nèi)，使之產(chǎn)生人源抗體。c

18、. 將改造過的人的抗體基因?qū)胧笈咛ハ抵幸缘玫侥苌a(chǎn)人抗體的轉(zhuǎn)基因鼠4. 抗體酶（Abzyme)概念：抗體酶或催化抗體（Catalytic antibody)是一種新型人工酶制劑，是一種具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。它是利用現(xiàn)代生物學(xué)與化學(xué)的理論與技術(shù)交叉研究的成果，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。抗體酶的制備： a.使用與過渡態(tài)結(jié)構(gòu)相類似的半抗原通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生抗體酶。 b.定向催化。 c.對抗體進(jìn)行化學(xué)修飾，使之與催化基團(tuán)相連。5.單鏈抗體單鏈抗體：用基因工程方法，將抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)通過一個(gè)連接肽連接而成的重組蛋白。 特點(diǎn)：能保持與抗原結(jié)合的性

19、能，分子量小，穿透性強(qiáng)，體內(nèi)循環(huán)半衰期短，免疫原性低。不易引起人體的免疫排斥，滲透性好?？捎脕順?gòu)建雙功能分子。單域抗體：僅由單個(gè)抗體可變區(qū)域構(gòu)成的功能性抗體。一般只指單個(gè)VH功能區(qū)域。四、抗體的表達(dá)系統(tǒng)1.在重組噬菌體中篩選生產(chǎn)抗體 用雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)抗體，雜交瘤細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長相對較為緩慢，同時(shí)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞需要復(fù)雜且昂貴的培養(yǎng)基，因此使單克隆抗體技術(shù)受到了嚴(yán)重的阻礙。所以人們嘗試用重組菌為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)單克隆抗體。 a.組合抗體文庫b.隨機(jī)多肽文庫又稱人工合成抗原決定簇文庫，原理： 人工合成編碼隨機(jī)肽段的基因，克隆到絲狀噬菌體中表達(dá)多肽于噬菌體表面，構(gòu)建成一個(gè)多肽文庫，再通過特異免疫結(jié)合

20、反應(yīng)，從文庫中篩選出能模擬某些生物大分子生物功能與活性的短肽小分子。c.目的基因噬菌體抗原決定簇文庫與隨機(jī)多肽文庫原理相似，只是在獲取編碼隨機(jī)多肽的基因時(shí)，不是隨機(jī)合成，而是通過DNA酶降解一個(gè)特定的基因片斷形成隨機(jī)的DNA片斷。2.在植物中生產(chǎn)抗體用植物生產(chǎn)抗體有其獨(dú)特的優(yōu)越性：一、可用于大規(guī)模的大田種植，價(jià)格低廉；二、外源基因一般都可以整合進(jìn)植物的染色體中并穩(wěn)定遺傳；三、轉(zhuǎn)基因植物株系可以通過種子形式長期保存；四、屬于真核細(xì)胞，對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行正確的加工和修飾。第五節(jié) 重組DNA與醫(yī)學(xué)人類的疾病原因內(nèi)在因素（主要是遺傳因素） 外在因素（環(huán)境因素） 外在因素+內(nèi)在因素疾病的分類1. 由環(huán)

21、境因素決定的疾病2. 由遺傳因素決定的疾病3. 由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用引起的疾病囊性纖維病變:是一種嚴(yán)重隱性基因遺傳病. 其特征是頻發(fā)的呼吸道感染、呼吸困難和最終造成永久性的肺部損傷。糖尿病:糖尿病分1型糖尿?。╰ype 1 diabetes）和2型糖尿病(type 2 diabetes)和妊娠期糖尿病（gestational diabetes）。其中1型糖尿病多發(fā)生于青少年，其胰島素分泌缺乏，必須依賴胰島素治療維持生命。2型糖尿病多見于30歲以后中、老年人，其胰島素的分泌量并不低甚至還偏高，病因主要是機(jī)體對胰島素不敏感（即胰島素抵抗）。 妊娠期糖尿?。╣estational diabe

22、tes）是源于細(xì)胞的胰島素抵抗，不過其胰島素抵抗是由于妊娠期婦女分泌的激素（荷爾蒙）所導(dǎo)致的。妊娠期糖尿病通常在分娩后自愈。AIDS: 艾滋病，即獲得性免疫功能喪失綜合癥，英語縮寫AIDS的音譯, 是人體注射感染了“人類免疫缺陷病毒”（HIV - human immunodeficiency virus）所導(dǎo)致的傳染病。一、疾病的診斷現(xiàn)代分子診斷技術(shù)主要是指應(yīng)用免疫學(xué)和分子生物學(xué)的方法來對病原物質(zhì)進(jìn)行診斷檢測。有效的診斷方法都應(yīng)該具備以下3個(gè)條件： 專一性強(qiáng)； 靈敏度高 操作簡單 1.酶聯(lián)免疫吸附 a.酶聯(lián)免疫吸附的原理ELISA通常的檢測過程包括以下幾個(gè)步驟 ： 將待測樣品結(jié)合在固體支持物上

23、； 加入可以與目標(biāo)分子特異反應(yīng)的抗體，即一抗，反應(yīng)后沖洗，洗去未結(jié)合上的一抗；加入二抗。二抗通常只特異地識別一抗，而不識別目標(biāo)分子。二抗上還聯(lián)著一種酶，這些酶都能夠催化一種化學(xué)反應(yīng)將無色底物轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)。一抗與二抗反應(yīng)完成后，再次沖洗掉未與一抗結(jié)合的二抗； 加入無色底物b 酶聯(lián)免疫吸附的局限性酶聯(lián)免疫吸附測定法需要一抗有高的特異性，來提高酶聯(lián)免疫吸附檢測的準(zhǔn)確度，才不至于造成假陽性，因此酶聯(lián)免疫吸附檢測只能夠作為一種初步的檢測手段，要進(jìn)一步確診，還必須進(jìn)行western檢測。2.DNA診斷（gene diagnosis） 人類疾病的發(fā)生，除人體內(nèi)的內(nèi)源基因的突變外，還涉及到外源性基因的入侵，

24、各種微生物、病毒和寄生蟲感染機(jī)體，都會(huì)造成特異的外源基因引發(fā)疾病，所以，通過基因分析，找出內(nèi)源基因的異常和發(fā)現(xiàn)外源基因，從而快速、敏感地診斷有關(guān)疾病，這就是基因診斷的目的。利用基因探針、PCR等技術(shù)直接探查基因的存在和缺陷，對人體狀態(tài)和疾病作出診斷，稱為基因診斷或DNA診斷?；蛟\斷的目的物主要是DNA，其次也包括基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA?；?因 診 斷 的 特 點(diǎn)針對性強(qiáng) 以探測基因?yàn)槟繕?biāo)，屬于“病因診斷” 特異性高 以分子雜交技術(shù)為基本原理 靈敏度高 基因探針帶有十分敏感的檢測標(biāo)記，待測標(biāo)本微量 適應(yīng)性強(qiáng) 基因探針可為任何來源，任何種類；探針序列可為已知亦可未知，檢測目 標(biāo)可為特定的基因或基

25、因組合，可為內(nèi)源基因亦可外源基因，診斷范圍廣a. 核 酸 雜 交核酸雜交是DNA診斷分析方法的一種，其工作原理是兩條DNA鏈之間可以通過堿基配對而形成氫鍵。通常核酸雜交的檢測過程主要包括以下幾個(gè)步驟： 將單鏈目的DNA結(jié)合于膜上； 加入單鏈、標(biāo)記過的探針DNA ，在一定的溫度條件和離子濃度下使探針分子與目標(biāo)DNA分子堿基配對； 沖洗，洗去多余的未結(jié)合的標(biāo)記探針DNA； 檢測探針和目標(biāo)DNA形成的雜合分子； 雜 交 探 針 用作雜交的探針應(yīng)該是高度特異性的DNA或RNA片段，也就是說，探針DNA或RNA必須只與持定的目標(biāo)DNA序列雜交。雜交探針的分離:提取病原微生物染色體的DNA；酶解；克隆進(jìn)質(zhì)

26、粒載體，構(gòu)建質(zhì)粒文庫；與病原微生物和非病原微生物的核DNA進(jìn)行雜交；對有雜交信號的重組質(zhì)粒的插入片段作進(jìn)一步確定，并篩選。 非同位素標(biāo)記雜交探針原理：通過酶促反應(yīng)將某種底物轉(zhuǎn)變成生色物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)而達(dá)到放大信號的目的。非放射性檢測系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：壽命長，利于保存；靈敏度高；操作簡便，用時(shí)短；安全性好。用生物素標(biāo)記的雜交探針進(jìn)行雜交的過程： 將生物素標(biāo)記的探針與目標(biāo)DNA雜交； 加入抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白； 加入一種經(jīng)生物素標(biāo)記的酶； 加入生色或化學(xué)發(fā)光的底物，然后根據(jù)顏色變化或化學(xué)發(fā)光來檢測雜交的結(jié)果。b. 瘧疾的分子診斷傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法：對抽取的血樣進(jìn)行顯微鏡檢查。酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測：無

27、法區(qū)別感染過瘧原蟲的患者和正在感染者。DNA雜交診斷：檢測的是帶有DNA的瘧原蟲，而不是瘧原蟲的蛋白或其抗體。前提是：分離雜交的探針。3.遺傳疾病的分子診斷技術(shù)對于遺傳疾病上DNA診斷分析主要是針對產(chǎn)前診斷以及癥狀發(fā)生前的早期診斷，以防止出生缺陷來提高人口質(zhì)量。a. PCR酶解鑒定此法應(yīng)用的條件： 突變位點(diǎn)恰好位于一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)b. PCR/OLA鑒定它是把PCR同寡聚核苷酸連接分析(oligo-nucleotide ligation assay,OLA)結(jié)合起來的一種檢測方法。本質(zhì)：分辨兩個(gè)寡聚核苷酸探針是否實(shí)現(xiàn)了連接確定X和Y兩條探針是否實(shí)現(xiàn)了連接： 在探針X的5端標(biāo)記上生物素，在探

28、針Y的3端標(biāo)記上地高辛； 雜交和連接后，變性DNA,釋放探針，轉(zhuǎn)至鏈霉抗生物素蛋白的小孔中，沖洗； 加入連接有堿性磷酸酶的抗DIG的抗體，沖洗； 加入無色生色底物c. 連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR）鑒定注意：兩個(gè)引物量要大大過量；雜交系統(tǒng)中要加入一種耐熱的DNA連接酶。d. PCR-ELISA檢測在PCR擴(kuò)增以后，在酶標(biāo)板上借用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的原理，使用酶標(biāo)抗體，進(jìn)行固相雜交來實(shí)現(xiàn)定量。被稱為PCRELISA。 e. 同一基因中多個(gè)不同位點(diǎn)的突變的檢測多數(shù)情況下，基因內(nèi)的許多不同的位點(diǎn)都有可能發(fā)生突變，而每個(gè)突變可能導(dǎo)致同一種遺傳疾病。這樣只檢查一處核苷酸的突變是不夠的，但是對各突變

29、點(diǎn)依次檢查太繁瑣，費(fèi)用也太高。特異性等位基因寡核苷酸雜交（ASO）原理：對待測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)之后，擴(kuò)增產(chǎn)物分別與生物素標(biāo)記的野生型寡核苷酸探針和突變型寡核苷酸探針在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交帶的強(qiáng)弱來判斷是否有突變發(fā)生。 擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）人工引入酶切位點(diǎn)（AIRS）又名限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)引入PCR。原理：在突變位點(diǎn)引入一錯(cuò)配堿基，從而引入一個(gè)新的酶切位點(diǎn)，以便對突變體的檢測。直接測序法（DS） DS法是將測序技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合而形成的一種檢測方法，利用這種方法，PCR產(chǎn)物無需經(jīng)過克隆就可進(jìn)行測序。一般是通過不對稱PCR法獲得用于測序的單鏈與固定在尼龍膜上的寡核苷酸序列雜

30、交，根據(jù)雜交信號推測待測序列。引物延伸法（PEX）原理：利用引物延伸到突變位點(diǎn)的前一個(gè)堿基，然后將延伸產(chǎn)物分成兩管，分別與待測樣品的基因組DNA退火，然后在兩管中分別加入不同標(biāo)記的堿基，繼續(xù)進(jìn)行延伸反應(yīng)。根據(jù)標(biāo)記物的性質(zhì)，檢測哪一種堿基摻入到了新的延伸產(chǎn)物中，即可判斷待測樣品是否有突變。 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)想多態(tài)分析PCR-SSCP是利用不同構(gòu)象的單鏈DNA的遷移率不同而設(shè)計(jì)的。4. 癌癥的分子診斷技術(shù)美國前副總統(tǒng)漢弗萊<Humphrey) 在1967年發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)有一腫物，病理切 片未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞-良性“慢性增生性囊 腫”，未進(jìn)行手術(shù)治療。九年后，他被診斷為患有“膀朧癌”，兩年后死于該

31、病。1994年，研究者用靈敏的PCR技術(shù)對上述漢弗萊1967年的病理切片進(jìn)行了P53抑癌基因檢查，發(fā)現(xiàn)那時(shí)的組織細(xì)胞雖然在形態(tài)上還沒有表現(xiàn)出惡性變化，但其P53基因的第227個(gè)密碼子已經(jīng)發(fā)生了一個(gè)核苷酸的突變。就是這個(gè)基因的微小變化，使其抑癌功能受損，導(dǎo)致九年后細(xì)胞癌變的發(fā)生。這說明，在典型癥狀出現(xiàn)之前的很長時(shí)間，細(xì)胞癌變的信息已經(jīng)在基因上表現(xiàn)出來了現(xiàn)代生命科學(xué)飛速發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些較為成熟的治療癌癥的方法。但是，治療癌癥的關(guān)鍵是，在腫瘤尚未形成或還很小的時(shí)候就能檢測出異?；虻拇嬖?，在未出現(xiàn)任何癥狀之前即檢測出腫瘤的發(fā)生，這樣能夠比任何新型藥物療法挽救更多的生命。 此外，在癌癥發(fā)生時(shí)，端粒

32、酶會(huì)具有活性，它可以阻止端粒變短，防止細(xì)胞衰老和死亡，所以腫瘤細(xì)胞是不易死亡的。因此，人們可以通過對端粒酶的檢測來作為對癌癥的早期診斷標(biāo)準(zhǔn)。5. 環(huán)境微生物的檢測微生物的存在離不開環(huán)境，而微生物的數(shù)量分布和種群組成、理化性狀、遺傳變異等，又是環(huán)境狀況的綜合而客觀的反映。利用微生物監(jiān)測環(huán)境污染，可了解不同污染狀況及其近期、遠(yuǎn)期影響。新理論、新技術(shù)的滲透和應(yīng)用，使監(jiān)測方法不斷完善、革新，更為靈敏、快速、準(zhǔn)確。在環(huán)境微生物檢測中常用的方法是菌落原位雜交和從樣品中提取核酸進(jìn)行雜交二、 生物技術(shù)與疫苗注射或口服疫苗可以激活免疫系統(tǒng)，使接受者誘導(dǎo)產(chǎn)生致病物質(zhì)的抗體。以至于以后遇見同樣的致病物侵入，免疫系統(tǒng)

33、仍會(huì)被激活。典型的疫苗主要是滅活的和減毒的致病物質(zhì)，前提是：不能喪失引起免疫反應(yīng)的能力。疫 苗 的 發(fā) 展 歷 史第一代疫苗：利用減毒或弱化的病原體。第二代疫苗：基因工程疫苗（將病原體的抗原基因克隆在細(xì)菌或真核細(xì)胞內(nèi)，利用細(xì)菌或細(xì)胞生產(chǎn)病原體的抗原）。第三代疫苗：核酸疫苗（將含有編碼目的蛋白質(zhì)基因序列的質(zhì)粒載體，經(jīng)肌肉注射或微彈轟擊等方法導(dǎo)入體內(nèi)，通過宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答）。1. 基因工程疫苗a.亞基疫苗概念：利用病源物的某一部分制得的疫苗。優(yōu)點(diǎn)：避免了直接使用病源物而使接受者可能致病的危險(xiǎn)；避免由于外源蛋白、核酸的混雜而造成的種種副作用；增強(qiáng)免疫。

34、局限：純化單一蛋白十分昂貴；純化后的蛋白構(gòu)象與在體內(nèi)時(shí)可能不同；激活的免疫反應(yīng)一般較弱。b. 肽 疫 苗把類似于抗原決定簇的小肽當(dāng)作疫苗。利用小肽作疫苗的局限： 充當(dāng)抗原決定族的肽段不能太長，而且要連續(xù)； 要求肽段的構(gòu)象必須與完整病毒上的抗原決定簇構(gòu)象一致； 要求選定的單一的抗原決定簇必須要有足夠強(qiáng)的免疫原性。2. DNA 免 疫核酸疫苗(nucleic acid vaccines)是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接導(dǎo)入動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)，并通過宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。 DNA免疫的優(yōu)越性：DNA比蛋白質(zhì)更穩(wěn)定

35、，在制成干粉后可以保存的時(shí)間較長；DNA的提取純化比蛋白質(zhì)的提取純化要容易很多；免疫應(yīng)答持久，由于外源基因可以在體內(nèi)存在較長時(shí)間，并不斷表達(dá)外源蛋白，它可以持續(xù)地給免疫系統(tǒng)提供刺激 ；任何DNA片段都可以插入質(zhì)粒中制成疫苗，而且在同一個(gè)質(zhì)粒上可以同時(shí)容納一個(gè)以上的抗原基因；核酸疫苗具有相同的理化性質(zhì)，為聯(lián)合免疫提供了可能?；蛎庖咧粚Ρ磉_(dá)的抗原而不對載體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，故同一質(zhì)?？梢杂糜谵D(zhuǎn)運(yùn)不同的靶基因而多次使用，也可在一個(gè)載體上構(gòu)建表達(dá)多種抗原的被稱為"復(fù)合疫苗"或多價(jià)疫苗的多功能疫苗，達(dá)到一次免疫能取得多次不同免疫相同的免疫效果。 DNA疫苗對于一些目前難以用常規(guī)疫苗防治

36、的疾病的預(yù)防和治療有重要意義。DNA免疫的弊端普遍存在免疫效力較低的問題插入生殖細(xì)胞基因組可能引起下一代遺傳病 機(jī)體長期表達(dá)外源性抗原可能產(chǎn)生另一些不良的后果：產(chǎn)生抗DNA抗體、自身免疫、過敏反應(yīng)、超免疫力或自身攻擊。 3. 艾滋病疫苗獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)-艾滋病,是由人免疫缺陷病毒(HIV)所引起的體液傳播疾病。a.HIV病毒簡介HIV是一雙股單鏈RNA病毒，屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科，慢病毒亞科。分為兩型，即HIV1和HIV2。目前世界范圍內(nèi)流行的主要由HIV1所致。HIV2僅在西非部分地區(qū)流行。 HIV對熱敏感，56

37、30分鐘、25%以上乙醇、0.2%次氯酸鈉、1%戊二醛等處理后均可滅活。但對0.1%福爾馬林、電離輻射和紫外線等的抵抗力較強(qiáng)。人免疫缺陷病毒 HIV 結(jié)構(gòu)圖HIV病毒的生活史b. HIV病毒的致病機(jī)理HIV在繁殖過程中可以通過以下方式殺傷CD4，從而導(dǎo)致免疫功能受損： 感染的直接毒性作用 細(xì)胞融合 3干細(xì)胞受HIV感染 4自身免疫的破壞c. HIV疫苗 HIV蛋白亞單位疫苗 HIV亞單位疫苗是發(fā)展最早也是世界上唯一進(jìn)入臨床階段的艾滋病疫苗，其主要原理是利用酵母、稈狀病毒-昆蟲細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)并純化HIV病毒抗原蛋白，免疫人體后產(chǎn)生針對HIV病毒的免疫反應(yīng)。 HIV活載體疫苗 此類疫苗是將

38、以往作為人類疫苗應(yīng)用過多年的減毒病原體，如牛痘苗、禽痘病毒等進(jìn)行改造后作為載體，將HIV的重要抗原基因插入其內(nèi)，導(dǎo)入人體進(jìn)行表達(dá)。 活載體疫苗由于可在體內(nèi)復(fù)制而具有良好的免疫原性，活載體本身還可作為免疫佐劑，因而此類疫苗廣受國內(nèi)外研究者的重視。 HIV DNA 疫 苗 核酸疫苗是近年來興起的一類新型疫苗。它得益于成熟的基因工程技術(shù)以及多樣的載體系統(tǒng)和轉(zhuǎn)移技術(shù), 發(fā)展十分迅速,已躋身于HIV疫苗領(lǐng)域三、基因治療基因治療是指目的基因?qū)氚屑?xì)胞以后與宿主細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生重組，成為宿主細(xì)胞的一部分，從而可以穩(wěn)定地遺傳下去并達(dá)到對疾病進(jìn)行治療的目的。現(xiàn)代：目的基因和宿主細(xì)胞內(nèi)的基因不發(fā)生重組，目的基因也

39、能得到暫時(shí)的表達(dá)。目前人類基因治療主要集中在遺傳性疾病、腫瘤及某些傳染性疾病。至1997年初，全世界共記錄了2103例基因治療病例（美國1700例）。其中68%是治療腫瘤的，19%是治療遺傳病的，12%治療傳染性疾病等。第一例基因治療的疾病是1990年9月FDA批準(zhǔn)的用ada（腺苷脫氨酶）基因治療SCID（嚴(yán)重型聯(lián)合型免疫缺陷癥。第一例接受治療的是一位4歲的女孩，第二例是一位9歲的女孩。美國醫(yī)學(xué)家W·F·安德森等人對腺甘脫氨酶缺乏癥（ADA缺乏癥）的基因治療，是世界上第一個(gè)基因治療成功的范例。1990年9月14日，安德森對一例患ADA缺乏癥的4歲女孩謝德爾進(jìn)行基因治療。這個(gè)

40、4歲女孩由于遺傳基因有缺陷，自身不能生產(chǎn)ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在無菌的隔離帳里。他們將含有這個(gè)女孩自己的白血球的溶液輸入她左臂的一條靜脈血管中，這種白血球都已經(jīng)過改造，有缺陷的基因已經(jīng)被健康的基因所替代。在以后的10個(gè)月內(nèi)她又接受了7次這樣的治療，同時(shí)也接受酶治療。經(jīng)治療后，免疫功能日趨健全，過上了正常人的生活。轉(zhuǎn)基因治療血友病 導(dǎo)入凝血因子基因的轉(zhuǎn)基因綿羊，其分泌的乳汁中含有豐富的凝血因子，能有效地用于血友病的治療1994年，中國用導(dǎo)入人凝血因子基因的方法成功治療了乙型血友病的患者1. 基因治療的策略基因置換：用正常的基因整個(gè)地替代突變基因，使突變基因得到永久的更正；基因修正：

41、將突變基因的突變堿基序列用正常的序列加以糾正，而其余未突變的正常部分予以保留；基因修飾：將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物可以補(bǔ)償致病基因的功能，致病基因本身并未得到改變?；蚴Щ睿豪梅戳x技術(shù)來封閉某些基因的表達(dá)，以達(dá)到抑制有害基因表達(dá)的目的。因抑制：導(dǎo)入外源基因去干擾、抑制有害基因的表達(dá) 2. 基因治療的原則 必須分離出具有特定功能的特異性基因；必須能夠獲得足夠數(shù)量的攜帶有該基因的載體和細(xì)胞；必須建立一條有效的途徑將該外源基因?qū)塍w內(nèi)、轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞；轉(zhuǎn)染并進(jìn)入宿主細(xì)胞的目的基因必須能產(chǎn)生足夠量的產(chǎn)物，可以維持適當(dāng)長的時(shí)間，且不產(chǎn)生有害的副作用。a. 選擇目的基因的原則：待研

42、究基因的異常是疾病發(fā)生的根源；該基因遺傳的分子機(jī)制已經(jīng)研究清楚；基因已經(jīng)被克隆，且表達(dá)調(diào)控機(jī)制較為清楚；轉(zhuǎn)移的基因 在受體細(xì)胞內(nèi)最好能夠完整地、穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的染色體中，并能適時(shí)適量表達(dá)功能性蛋白質(zhì)?；蛑委熤羞x擇的目的基因可以來自染色體的基因組，也可以來自來源于mRNA的互補(bǔ)DNA（cDNA），而且以后者居多。另外，目的基因必須置于合適的啟動(dòng)子控制之下，且必須含有完整的信號肽，只有這樣，目的基因才可能獲得適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)。b. 選擇受體細(xì)胞的原則最好選擇組織特異性細(xì)胞；細(xì)胞要易于從體內(nèi)取出，有增殖趨勢，且生命周期較長；離體的細(xì)胞應(yīng)能接受外源基因轉(zhuǎn)染；細(xì)胞經(jīng)過體外基因操作后能夠存活下來，并能安

43、全輸送回體內(nèi)。3. 遺傳性疾病的基因治療遺傳病是指由人體內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變所引起的疾病。根據(jù)遺傳物質(zhì)的變異情況，遺傳病可以分為三類：（1）單基因遺傳?。褐赣蓡蝹€(gè)基因發(fā)生突變所引起的疾病。（2）多基因遺傳?。褐赣啥鄠€(gè)基因與環(huán)境因子共同作用所引起的遺傳性疾病。（3）染色體異常?。哼z傳物質(zhì)的突變涉及到染色體上的很大一部分，如染色體部分?jǐn)嗔押蟪霈F(xiàn)的染色體易位、缺失、倒位和重復(fù)等染色體畸變，均導(dǎo)致遺傳物質(zhì)偏離正常狀態(tài)，引起疾病。常見遺傳病的基因治療 血紅蛋白病血紅蛋白由珠蛋白和血紅素輔基組成。每個(gè)血紅蛋白分子是由個(gè)亞單位構(gòu)成的四聚體，每個(gè)亞單位由一條珠蛋白肽鏈和個(gè)血紅素輔基構(gòu)成。研究證實(shí)，在血紅蛋白病

44、中，鐮刀型貧血和地中海貧血都是由于成人珠蛋白活性水平很低所致，而珠蛋白的活性降低又與機(jī)體中鏈基因完全關(guān)閉有關(guān)，因此如果采用讓鏈基因持續(xù)開放或者使已經(jīng)關(guān)閉的鏈基因重新激活，就有可能解決珠蛋白表達(dá)比例失調(diào)的問題，進(jìn)而在基因水平上治療上述兩種貧血病。 血友病血友病是一種常見的遺傳性出血性疾病，它是由于血液中缺乏某種凝血因子而導(dǎo)致患者的凝血功能出現(xiàn)障礙?；蛑委熓菍⒄；蜣D(zhuǎn)入患者體內(nèi)替代缺陷基因，從基因水平上糾正基因的缺陷，從而達(dá)到治療的目的，為血友病的治療開辟了一條新途徑。 家族性高膽固醇血癥 家族性高膽固醇血癥是由于低密度脂蛋白受體缺陷而導(dǎo)致血中膽固醇水平過高，患者多死于冠心病。是一種多基因遺傳

45、病。通過基因治療可以表達(dá)更多的低密度脂蛋白受體，以便降低血液中膽固醇的水平。4.腫瘤的基因治療腫瘤基因治療（gene therapy of cancer）是指以適當(dāng)?shù)幕蜣D(zhuǎn)移技術(shù)將特定的外源基因?qū)肽[瘤細(xì)胞或患者體細(xì)胞內(nèi)，通過外源基因的表達(dá)產(chǎn)物或?qū)λ拗骷?xì)胞本身基因表達(dá)的影響，直接或間接地殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞，或?yàn)槠渌[瘤治療方法創(chuàng)造有利條件的一種腫瘤生物治療方法。 盡管基因治療的研究和應(yīng)用起源于對遺傳病的治療，但近年來腫瘤基因治療的發(fā)展卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了遺傳病的基因治療，這主要是由于（1）惡性腫瘤的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于遺傳病的發(fā)?。唬?）外源目的基因選擇的余地增大；（3）腫瘤的基因治療不需要象遺傳病那樣終生

46、持續(xù)應(yīng)用，而只需要較短的療程即可；（4）腫瘤的基因治療不需要外源基因持續(xù)表達(dá)，階段性表達(dá)甚至過量表達(dá)也可以達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的；（5）對目的基因表達(dá)調(diào)控的要求遠(yuǎn)不如遺傳病治療時(shí)嚴(yán)格。目前有關(guān)腫瘤基因治療的研究主要集中在以下幾個(gè)方面： a. 細(xì)胞因子導(dǎo)入療法細(xì)胞因子是免疫活性細(xì)胞分泌的多肽類物質(zhì)，它們調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生理功能和免疫應(yīng)答。將編碼細(xì)胞因子的基因?qū)爰?xì)胞，使其在宿主或局部腫瘤中穩(wěn)定、持續(xù)的表達(dá)，通過增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中抗癌免疫達(dá)到治療腫瘤的目的。b. 腫瘤抑制基因療法 在腫瘤的發(fā)生和演變的過程中，涉及多個(gè)腫瘤的抑制基因和癌基因的改變。其中，腫瘤抑制基因的失活與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。將正常的腫瘤抑制基因?qū)肽[瘤細(xì)胞可以替代或補(bǔ)償有缺陷的基因，從而達(dá)到抑制腫瘤的生長或逆轉(zhuǎn)其表型的目的c. “自殺”基因療法自殺基因所編碼的蛋白產(chǎn)物能夠使無毒性的化療藥物的前體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)換為強(qiáng)毒性藥物，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞“自殺”而死亡，達(dá)到選擇性地殺傷腫瘤的目的。正常組織由于未轉(zhuǎn)染該基因，不能表達(dá)