生化實驗-血清醋酸纖維素膜電泳ppt課件

1、生物化學(xué)的四大研討技術(shù)：生物化學(xué)的四大研討技術(shù)：Kaurin Tiselius (1902-1971)因研討電泳和吸因研討電泳和吸附分析，特別是發(fā)現(xiàn)附分析，特別是發(fā)現(xiàn)關(guān)于血清蛋白的復(fù)雜關(guān)于血清蛋白的復(fù)雜本質(zhì)而獲獎本質(zhì)而獲獎1948諾貝諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。爾生理醫(yī)學(xué)獎。 1809年，俄國物理學(xué)家年，俄國物理學(xué)家Pece初次發(fā)初次發(fā)現(xiàn)電泳景象；現(xiàn)電泳景象；1937年，年，Kaurin Tiselius 發(fā)明了發(fā)明了Tiselius電泳儀，建立了自在界面電泳，電泳儀，建立了自在界面電泳，初次證明人血清蛋白的組分；初次證明人血清蛋白的組分；1948年，年，Wieland和和Fischer以濾紙作以濾紙作

2、為支持介質(zhì)的電泳；為支持介質(zhì)的電泳；1959年，年，Raymond和和Weintraub利用利用人工合成凝膠作為介質(zhì)人工合成凝膠作為介質(zhì)聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝膠電泳胺凝膠電泳:生物大分子的生物大分子的“Last Check！ + -外表帶負電荷 + 帶正電荷的水層 + + 外表帶正電荷 - 帶負電荷的水層+質(zhì)點的大小和外形質(zhì)點的大小和外形根據(jù)電泳中能否運用支持介質(zhì)分為：根據(jù)電泳中能否運用支持介質(zhì)分為： 自在界面電泳自在界面電泳 區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳根據(jù)電泳系統(tǒng)根據(jù)電泳系統(tǒng)pH能否延續(xù)分為：能否延續(xù)分為： 延續(xù)延續(xù)pH電泳電泳 不延續(xù)不延續(xù)pH電泳電泳按支持物的安裝方式不同分為：按支持物的安裝方式不同

3、分為： 程度板式電泳程度板式電泳 垂直板式電泳垂直板式電泳 垂直柱式電泳垂直柱式電泳根據(jù)電泳物質(zhì)類別不同分為：根據(jù)電泳物質(zhì)類別不同分為： 細胞電泳，核酸電泳，蛋白質(zhì)電泳等細胞電泳，核酸電泳，蛋白質(zhì)電泳等按其介質(zhì)的物理性狀不同可分為：按其介質(zhì)的物理性狀不同可分為： 凝膠電泳凝膠電泳 粉末電泳粉末電泳 線絲電泳線絲電泳 纖維膜電泳等纖維膜電泳等血清醋酸纖維素薄膜電泳基基 本本 原原 理理本實驗以醋酸纖維素為電泳支持物，分別各種血本實驗以醋酸纖維素為電泳支持物，分別各種血清蛋白。清蛋白。血清中含有清蛋白、血清中含有清蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨

4、基酸組成、蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組成、分子量、等電點及外形不同，在電場中的遷移速度分子量、等電點及外形不同，在電場中的遷移速度不同。不同。以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳，染色后可顯示的緩沖體系中電泳，染色后可顯示5條區(qū)帶。條區(qū)帶。其中清蛋白的泳動速度最快，其他依次為其中清蛋白的泳動速度最快，其他依次為1-、2-、-及及-球蛋白。球蛋白。留意：點樣時動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞留意：點樣時動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分別效果膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分別效果 。另外

5、操作過程要防止指紋污染。另外操作過程要防止指紋污染。3. 電泳電泳 將點樣后的薄膜使粗糙面點樣面向下，點樣將點樣后的薄膜使粗糙面點樣面向下，點樣端置于負極，貼在電泳槽支架的端置于負極，貼在電泳槽支架的“濾紙橋上，平濾紙橋上，平衡衡5min。 翻開電源，調(diào)理電壓和電流強度。調(diào)理電壓至翻開電源，調(diào)理電壓和電流強度。調(diào)理電壓至90-100V左右，電流強度為左右，電流強度為0.40.6mA/cm薄膜條寬，薄膜條寬，電泳時間電泳時間40min-1h左右。左右。1.濾紙橋濾紙橋 2.電泳槽電泳槽 3.醋酸纖維素薄膜醋酸纖維素薄膜 4.電泳槽膜支架電泳槽膜支架 5.電極室中央隔板電極室中央隔板 點樣端點樣端

6、4. 染色染色 電泳終了立刻取出薄膜，直接浸入染色液中，電泳終了立刻取出薄膜，直接浸入染色液中，染色染色5min。5. 漂洗漂洗 用漂洗液漂洗，不停擺動薄膜條，每用漂洗液漂洗，不停擺動薄膜條，每3-5min左右換一次液，延續(xù)改換三次，可使背景顏色脫左右換一次液，延續(xù)改換三次，可使背景顏色脫去。將膜夾在干凈濾紙中，吸去多余溶液。去。將膜夾在干凈濾紙中，吸去多余溶液。 操作中，留意控制染色和漂洗的時間，防止操作中，留意控制染色和漂洗的時間，防止背景過深或某些區(qū)帶太淺。背景過深或某些區(qū)帶太淺。分清薄膜的點樣面分清薄膜的點樣面留意點樣樣品的寬度和力度留意點樣樣品的寬度和力度留意薄膜放置的方向留意薄膜放

7、置的方向控制染色及漂洗時間控制染色及漂洗時間堅持良好的實驗次序堅持良好的實驗次序 清蛋白清蛋白 1 2 1、洗脫法：剪下各蛋白區(qū)帶剪下各蛋白區(qū)帶0.02mol/L NaOH0.02mol/L NaOH洗脫洗脫將洗脫液用分光光度計比色將洗脫液用分光光度計比色結(jié)果計算結(jié)果計算每種蛋白質(zhì)占總蛋每種蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)量的相對含量白質(zhì)量的相對含量= =該種蛋白管光密度讀數(shù)該種蛋白管光密度讀數(shù)各管光密度讀數(shù)之和各管光密度讀數(shù)之和100% 2、光密度計掃描法清蛋白清蛋白 1 2 清蛋白清蛋白 1 2 蛋白質(zhì)類型蛋白質(zhì)類型平均值平均值標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)差正常范圍正常范圍（M2SD）白蛋白白蛋白64.593.7557.4

8、5%-71.73%1-球蛋白球蛋白3.120.681.76%-4.48%2-球蛋白球蛋白6.161.064.04%-8.28%-球蛋白球蛋白9.091.156.79%-11.39%-球蛋白球蛋白17.412.7811.85%-22.9%A/G1.800.281.24-2.36急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭：白蛋白降低，急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭：白蛋白降低，1、2 和和球蛋白升高；球蛋白升高；慢性活動性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，慢性活動性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，、球蛋白升高；球蛋白升高；急性炎癥：急性炎癥：1、2球蛋白升高；球蛋白升高；慢性炎癥：白蛋白降低、慢性炎癥：白蛋白降低、2、球蛋白升高；球蛋白升高；紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎：白蛋白降低，紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎：白蛋白降低，球蛋白顯著升高；球蛋白顯著升高；多發(fā)性骨髓瘤：白蛋白降低，多發(fā)性骨髓瘤：白蛋白降低，球蛋白升高，球蛋白升高， 和和球蛋白區(qū)帶之間球蛋白區(qū)帶之間出現(xiàn)出現(xiàn)“M帶。帶。 利用本次實驗課所學(xué)知識，分析以下表格中個各蛋利用本次實驗課所學(xué)知識，分析以下表格中個各蛋白質(zhì)的混合物在醋酸纖維薄膜電泳實驗中的電泳結(jié)果？繪