液相色譜柱基礎(chǔ)

1、液相色譜柱基礎(chǔ)液相色譜柱基礎(chǔ)熊鶯2014年8月26日Agenda為什么要了解色譜柱12如何成為色譜柱專家在LC實驗室中尋找銷售機(jī)會3Agenda為什么要了解色譜柱12如何成為色譜柱專家在HPLC實驗室中尋找銷售機(jī)會3色譜法原理開始開始收集信息，收集信息， 設(shè)定要求設(shè)定要求選擇初始的色譜選擇初始的色譜柱柱, 流動相流動相調(diào)節(jié)調(diào)節(jié) 2k10 至至15a a OK ?是是否否優(yōu)化優(yōu)化N改變?nèi)軇└淖內(nèi)軇V柱，色譜柱 分離分離是否符合要求是否符合要求 ?驗證驗證否否 是是HPLC方法流程Agenda2013 Lab Water China Marketing Plan| 20 Feb. 20136為

2、什么要了解色譜柱2如何成為色譜柱專家在HPLC實驗室中尋找銷售機(jī)會3高效液相色譜柱簡介 色譜柱是一根填滿填料的管子 柱管的材料(塑料,玻璃,不銹鋼)和尺寸(內(nèi)徑,長短)不盡相同 色譜柱的性能主要取決于填料的性質(zhì)和填充技術(shù)2013 Lab Water China Marketing Plan| 20 Feb. 20137色譜柱的填充及結(jié)構(gòu)2013 Lab Water China Marketing Plan| 20 Feb. 20138硅膠顆粒的形狀不規(guī)則形狀 (Irregular)大硅膠顆粒研磨，篩分顆粒尺寸和表面積限制球形（Spherical）目前流行的分析填料更好的性能，重現(xiàn)性球形硅膠基質(zhì)

3、的分類 純硅膠基質(zhì) 雜化硅膠基質(zhì) 其他色譜柱專家能力之一能夠說出色譜柱的價值C18 填料的合成 1.硅膠基質(zhì)的合成（多孔）Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(PEOS)硅膠顆粒基質(zhì)硅膠顆?；|(zhì)硅羥基硅羥基色譜柱填料電鏡照片2013 Lab Water China Marketing Plan| 20 Feb. 201314鍵合相鍵合相(配體配體)：C18硅膠基質(zhì)硅膠基質(zhì)C18 填料的合成2. 配體鍵合 + HCl+SiCCCCCCCCH3CH3H3CClOHSiOOOSiCCCCCCCCH3CH3H3COSiOOO鍵合化學(xué)方程式殘留硅羥基殘留硅羥基端

4、基封口基團(tuán)端基封口基團(tuán)C18 填料的合成2. 端基封口四乙氧基硅烷四乙氧基硅烷(TEOS)硅甲基嵌入型聚乙氧硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷基硅烷 (MPEOS)甲基三乙氧基硅烷甲基三乙氧基硅烷(MTEOS)第一代雜化顆粒的合成過程 硅膠快速溶解 嚴(yán)重的柱失效 柱壽命短暫Surface modified Silica Particles 因嵌入硅甲基的阻擋, 顆粒表面溶解速度明顯減緩 柱壽命大大延長XTerra Hybrid Particles普通硅膠柱普通硅膠柱基于雜化顆粒的基于雜化顆粒的Xterra 柱柱XBridge:第二代雜化填料的合成硅膠基體中插入的橋式乙基硅膠基體中插入的橋式乙基美國專利號

5、美國專利號 6,686,035 B2Tetraethoxysilane(TEOS)Bis(triethoxysilyl)ethane(BTEE)+4Polyethoxysilane(BPEOS)SiEtOEtOOEtEtOSiEtOEtOCH2EtOCH2SiOEtOEtOEtSiEtOOCH2CH2SiOSiEtOOEtSiOOOEtOSiOSiOEtOOOEtEtEtn挑戰(zhàn)性流動相挑戰(zhàn)性流動相: 0.02N NaOH pH 12.3 , 50C測試時的流動相測試時的流動相: 50/50 (v/v) 乙腈乙腈/水水 , 50C標(biāo)準(zhǔn)測試物標(biāo)準(zhǔn)測試物: 苯癸酮苯癸酮01020304050XBri

6、dge C8XBridge C18XBridge PhenylXBridge Shield RP18XTerra MS C18Symmetry C18要使柱效降低一半要使柱效降低一半, 需將色譜柱曝露在需將色譜柱曝露在0.02N NaOH (pH 12.3)和和 50下的小時數(shù)下的小時數(shù)將高pH 柱穩(wěn)定性推向新極限 + HCl+SiCCCCCCCCH3CH3H3CClOHSiOOOSiCCCCCCCCH3CH3H3COSiOOO優(yōu)點：鍵合密度高，樣品載量大優(yōu)點：鍵合密度高，樣品載量大缺點：疏水性最強(qiáng)，對極性物質(zhì)保留不佳；容易發(fā)生酸水解鍵和相流失缺點：疏水性最強(qiáng)，對極性物質(zhì)保留不佳；容易發(fā)生酸水

7、解鍵和相流失鍵合方式：單點鍵合優(yōu)點：酸性條件下鍵和相穩(wěn)定性高（耐水解）鍵合方式：三點鍵合帶有內(nèi)嵌極性配體的色譜填料 OSiCH3CH3PolarGroup內(nèi)嵌極性基團(tuán)配體OSiCH3CH3傳統(tǒng)直鏈烷基配體Shield RP18Shield RP18作用機(jī)理水 “屏蔽”層CH3NH3CH+通過極性嵌入基團(tuán)保留水浸潤： 可完全兼容可完全兼容100%水相水相 屏蔽硅醇基，對堿性化合物峰形更佳屏蔽硅醇基，對堿性化合物峰形更佳 提供與提供與C18不同的選擇性不同的選擇性Chromolith整體柱Macropores: 2m mm Mesopores: 130 雙孔結(jié)構(gòu)雙孔結(jié)構(gòu)表面帶電雜化顆粒技術(shù)Step

8、 1Step 2Step 3未經(jīng)鍵合的BEH顆粒始于穩(wěn)定耐用的、超高效的亞乙基橋雜化(BEH)顆粒技術(shù)在高度控制下施予表面電荷為顆粒表面添加可重現(xiàn)的低濃度水平的電荷相鍵合與封端用合適的鍵和相化學(xué)賦予官能團(tuán)化核殼技術(shù) 核殼技術(shù)：將多孔硅殼熔融到實心的硅核上面而制備出的。這些多孔的“光環(huán)”狀顆粒具有極小的粒徑分布和擴(kuò)散路徑，可以同時減小軸向和縱向擴(kuò)散，因此減小峰寬，提高柱效。2013 Lab Water China Marketing Plan| 20 Feb. 201328ionKey/ MS系統(tǒng)的iKey微流分離裝置只有于智能手機(jī)一樣的大小，但包含了流路連接、電子設(shè)備、ESI接口、色譜柱加熱器

9、、eCord智能芯片，以及1.7m顆粒填充的內(nèi)徑150 m通道。該設(shè)備能夠連續(xù)進(jìn)行數(shù)百個UPLC分離，同時確保重復(fù)性，并且分析性能不會降低。ionKey/ MS系統(tǒng)比較常見的幾個品牌 Waters ：Xbridge(BEH)，Sunfire， Symmetry,AtlantisT3 Merck: Chromolith 整體化柱,Purosphere STAR,Lichrospher RP18e Phenomenex Gemini,Luna 資生堂 Capcell Agilent ZorbaxExtend，Zorbax XDB Kromasil, Hypersil ODS22013 Lab Wa

10、ter China Marketing Plan| 20 Feb. 201329色譜柱專家能力之二了解色譜柱的性能2013 Lab Water China Marketing Plan| 20 Feb. 201330對色譜柱填料的了解(一)鍵合相化學(xué) 不同鍵合相對不同種類的化合物分離不同 可能導(dǎo)致色譜的分離機(jī)理不同 如：C18、C8、CN填料的品牌-不同硅膠顆粒基質(zhì) 密度，表面積，孔徑純度(殘留硅羥基活性不同)鍵合相的種類:C18,C8, Shield RP18不同 C18配體鍵合水平 單鍵鍵合,雙鍵鍵合,三鍵鍵合 配體覆蓋率(疏水性不同)選擇性差異來源對色譜柱填料的了解(二)對色譜柱填料的了

11、解(三)含碳量 含碳量越高，k值越大（固定相傳質(zhì)效應(yīng)增加）高含碳量 有利于不易保留的化合物的分離 水解穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好 有利于極性化合物的拖尾改善低含碳量 有利于分析中性及堿性化合物 降低溶劑損耗對色譜柱填料的了解(四)平均顆粒度，顆粒度分布 顆粒度 顆粒度越小：柱效越高 柱壓越高 顆粒分布 顆粒分布越寬:柱效低 顆粒形狀 球型 無定型對色譜柱填料的了解(五)硅膠的活性 主要影響堿性化合物的保留行為 生產(chǎn)硅膠時處理溫度不同，硅膠活性也不同硅膠的雜質(zhì)含量 重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小 是色譜柱質(zhì)量好壞的重要標(biāo)志對色譜柱填料的了解(六)填料的pH穩(wěn)定性 硅膠填料 pH：2-8 聚合物填料

12、 pH：2-12 雜化硅膠填料 pH：2-12pH值小于2時鍵合相水解pH值大于8時硅膠溶解1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH硅膠的溶解曲線硅膠表面鍵合相的水解（PH2）Low pH (hydrolysis of ligand)Note: Sometimes called “Column Bleed” + HCl+SiCCCCCCCCH3CH3H3CClOHSiOOOSiCCCCCCCCH3CH3H3COSiOOOSiCCCCCCCCH3CH3H3CHOOHSiOOO對色譜柱填料的了解(七)填料的熱穩(wěn)定性 普通硅膠填料 柱溫:60 聚合物填料(高溫GPC) 柱溫:150 雜化硅膠填料(X

13、Terra,XBridge) 柱溫:90色譜柱專家能力之三簡單的色譜柱維護(hù)保養(yǎng)理念測柱效-良好的色譜實驗習(xí)慣拿到一根新色譜柱時，先測柱效保留在新色譜柱上測得的色譜圖，并記錄色譜測試條件定期檢測柱效定期檢測儀器的譜帶展寬計算色譜柱的柱效 N 理論塔板數(shù)計算公式：理論塔板數(shù)計算公式：Ws 方法Wtan16切線法Wh5.54半峰高W3s9 3sW4s16 4sW5s25 5s21WVN正確使用色譜柱(一)樣品方面 除去微粒及雜質(zhì) 了解樣品在流動相中的溶解度 如溶樣品的溶劑不是流動相，一定要用流動相試溶解度，防止其在流動相中析出 了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否有相互作用正確使用色譜柱（二）流動相方面

14、 除去微粒 純度的要求 超純水，梯度實驗時水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低 緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi) 緩沖液（鹽）的濃度 有機(jī)溶劑：色譜純,雜質(zhì)含量盡量低,并與填料相匹配 流動相對樣品的溶解度 有機(jī)溶劑或水的比例色譜柱的在線保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù) 除去樣品及流動相中的顆粒給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù) 防止分析柱被化學(xué)污染裝置 在線過濾器 Sentry Guard 保護(hù)柱色譜柱的清洗對所做的樣品要有充分的了解 用對該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動相清洗硅膠柱的一般方法 先用甲醇洗去極性雜質(zhì) 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次

15、沖洗記記住住每每種種色色譜譜柱柱可可能能有有特特定定的的方方法法 一一定定要要先先看看其其使使用用說說明明！色譜柱的清洗一些供參考的反相色譜柱清洗程序:極性樣品極性樣品非極性樣品非極性樣品蛋白樣品蛋白樣品1.水水1.異丙醇或合適比例的水異丙醇或合適比例的水溶液溶液1.重復(fù)進(jìn)樣少量重復(fù)進(jìn)樣少量DMSO(二甲二甲基亞砜基亞砜)2.甲醇甲醇2.四氫呋喃四氫呋喃2.梯度洗脫梯度洗脫,從從10%到到90%的的B液液3.四氫呋喃四氫呋喃3.二氯甲烷二氯甲烷A=0.1%TFA水溶液水溶液B=0.1%TFA乙腈溶液乙腈溶液4.甲醇甲醇4.正己烷正己烷3.梯度清洗梯度清洗,從從10%到到90%的的B液液.A=水水,B=乙腈乙腈5.水水5.異丙醇異丙醇,接著用合適比例接著用合適比例的異丙醇的異丙醇/水混合溶液水混合溶液4.流動相流動相6.流動相流動相6.流動相流動相色譜柱的存放存放前的處理 除去雜質(zhì)、緩沖鹽合適的存放溶劑避免色譜柱床的干涸避免機(jī)械震動防止細(xì)菌生長注意存放的溫度Agenda2013 Lab Water China Market