生物化學(xué)課件-第四章-核酸雜交

1、核酸分子雜交核酸分子雜交 nucleic acid hybridization 第四章第四章本章內(nèi)容本章內(nèi)容n第一節(jié)第一節(jié) 核酸分子雜交的基本原理核酸分子雜交的基本原理n第二節(jié)第二節(jié) 核酸探針核酸探針n第三節(jié)第三節(jié) 印跡雜交技術(shù)印跡雜交技術(shù)n第四節(jié)第四節(jié) 常用的核酸分子雜交技術(shù)常用的核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交的基本原理核酸分子雜交的基本原理第一節(jié)第一節(jié) 核酸變性核酸變性 核酸復(fù)性核酸復(fù)性 核酸雜交核酸雜交 在化學(xué)和物理因素的影響下在化學(xué)和物理因素的影響下, ,維系核酸二維系核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞,DNA,DNA雙雙螺旋解旋成為單鏈的過程螺旋解旋

2、成為單鏈的過程. . DNA DNA變性后，理化性質(zhì)和生物活性喪失。變性后，理化性質(zhì)和生物活性喪失。一、一、核酸的變性核酸的變性(denaturation) 物理因素物理因素：熱（高溫）：熱（高溫） 化學(xué)因素化學(xué)因素：酸、堿；：酸、堿； 變性劑（如尿素、胍）；變性劑（如尿素、胍）； 有機(jī)溶劑（如乙醇、丙酮）有機(jī)溶劑（如乙醇、丙酮） （一）引起核酸變性的因素：（一）引起核酸變性的因素：（二）變性溫度（或解鏈溫度，（二）變性溫度（或解鏈溫度，Tm):Tm):單鏈單鏈DNADNA的紫外吸收比雙鏈的紫外吸收比雙鏈DNADNA高高40%40%，所以，所以變性導(dǎo)致變性導(dǎo)致DNADNA的紫外吸收增加，稱為的

3、紫外吸收增加，稱為增色效增色效應(yīng)（應(yīng)（hyperchromic effecthyperchromic effect）。在熱變性過程中，增色效應(yīng)達(dá)一半時(shí)即雙螺在熱變性過程中，增色效應(yīng)達(dá)一半時(shí)即雙螺旋被解開一半時(shí)的溫度稱為旋被解開一半時(shí)的溫度稱為解鏈溫度解鏈溫度(Tm)(Tm)。 （1）堿基組成：堿基組成：Tm=69.3+0.41(G+C)% （2 2）分子大?。┓肿哟笮? : （3）離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度： （3）pH：59 （4）變性劑：干擾堿基堆積力和氫鍵的變性劑：干擾堿基堆積力和氫鍵的 形成，降低形成，降低TmTm值。值。（三）影響（三）影響TmTm值的因素：值的因素：變性的變性的DNADNA

4、兩條互補(bǔ)單鏈兩條互補(bǔ)單鏈, ,在適當(dāng)條件下重新在適當(dāng)條件下重新締合成雙鏈的過程，又叫締合成雙鏈的過程，又叫退火退火。二、二、核酸的復(fù)性核酸的復(fù)性(renaturation)DNADNA復(fù)性后，理化性質(zhì)和部分生物活性恢復(fù)。復(fù)性后，理化性質(zhì)和部分生物活性恢復(fù)。 復(fù)性導(dǎo)致復(fù)性導(dǎo)致DNADNA的紫外吸收降低，稱為的紫外吸收降低，稱為減色效應(yīng)減色效應(yīng)（hypochromic effecthypochromic effect）。DNADNA的最適復(fù)性溫度（的最適復(fù)性溫度（T Toror）比解鏈溫度低）比解鏈溫度低2020 -25-25（1 1）DNADNA大?。浩卧叫。瑥?fù)性越快；大?。浩卧叫?，復(fù)性越快

5、； 反之亦然。反之亦然。（2 2）離子強(qiáng)度：增加鹽濃度可加速復(fù)性。）離子強(qiáng)度：增加鹽濃度可加速復(fù)性。（3 3）DNADNA濃度：濃度越大，復(fù)性越快。濃度：濃度越大，復(fù)性越快。（4 4）若變性不徹底，復(fù)性很快。）若變性不徹底，復(fù)性很快。（5 5）序列越簡(jiǎn)單，復(fù)性越快。）序列越簡(jiǎn)單，復(fù)性越快。影響復(fù)性速度的因素影響復(fù)性速度的因素DNADNA的變性和復(fù)性的變性和復(fù)性三、核酸分子雜交三、核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNADNA復(fù)性過程中，如果把不同復(fù)性過程中，如果把不同DNADNA單鏈單鏈分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNADNA與與

6、RNARNA放在一放在一起，只要在起，只要在DNADNA或或RNARNA的單鏈分子之間有一定的單鏈分子之間有一定的的堿基配對(duì)堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成形成雜化雙鏈雜化雙鏈(heteroduplex)(heteroduplex) 。 雜交可以發(fā)生在雜交可以發(fā)生在 DNA/DNADNA/DNA、DNA/RNADNA/RNA、 RNA/RNARNA/RNA、以及人工合成的寡核苷酸單鏈與、以及人工合成的寡核苷酸單鏈與 DNADNA或或RNARNA之間。之間。分子基礎(chǔ)：分子基礎(chǔ)：核酸的變性和復(fù)性核酸的變性和復(fù)性雜交可分為：雜交可分為：液相雜交和固相雜交液相雜交和

7、固相雜交n液相雜交液相雜交: 進(jìn)行雜交的核酸都在雜交液中進(jìn)行雜交的核酸都在雜交液中 特點(diǎn)特點(diǎn): : 雜交速度快，但誤差較高雜交速度快，但誤差較高 n固相雜交固相雜交: 將參加反應(yīng)的核酸先固定在固相支持將參加反應(yīng)的核酸先固定在固相支持物上，與雜交液中的游離探針進(jìn)行雜交物上，與雜交液中的游離探針進(jìn)行雜交復(fù)性復(fù)性RNADNA核酸分子雜交核酸分子雜交 第二節(jié)第二節(jié) 核核 酸酸 探探 針針 探針的概念探針的概念 探針的種類和選擇探針的種類和選擇 探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記一、探針一、探針(probe)的概念的概念一小段用染料一小段用染料(同位素、生物素或熒光同位素、生物素或熒光)標(biāo)標(biāo)記記的的(末端或全鏈末端或

8、全鏈)已知序列已知序列的多聚核苷酸，的多聚核苷酸，與固定在膜與固定在膜(NC、PVDF或尼龍）上的核苷酸或尼龍）上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 簡(jiǎn)言之，簡(jiǎn)言之，探針指探針指已知序列已知序列的的標(biāo)記核酸標(biāo)記核酸片片段段。 二、探針二、探針(probe)的種類的種類n基因組基因組DNADNA探針探針ncDNAcDNA探針探針nRNARNA探針探針n人工合成的寡核苷酸探針（人工合成的寡核苷酸探針（ASOASO）n基因組探針基因組探針：用基因克隆技術(shù)分離獲得的特異：用基因克隆技術(shù)分離獲得的特異的的DNADNA序列。序列。nRNARNA探針探針：特異：

9、特異DNADNA序列在體外轉(zhuǎn)錄出的序列在體外轉(zhuǎn)錄出的RNARNA序序列。列。ncDNAcDNA探針探針：以特異：以特異mRNAmRNA序列為模板，在逆轉(zhuǎn)錄序列為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成的酶催化下合成的cDNAcDNA序列。序列。n寡核苷酸探針（寡核苷酸探針（ASOASO）：人工合成已知序列的：人工合成已知序列的寡核苷酸片段。寡核苷酸片段。探針種類探針種類三、探針的標(biāo)記物三、探針的標(biāo)記物（一）放射性同位素標(biāo)記物：（一）放射性同位素標(biāo)記物： 32P、 3H、 35S 生物素（生物素（biotin） 地高辛（地高辛（digoxigenin ） 熒光素（熒光素（ fluorescein ） 酶（堿性

10、磷酸酶、辣根過氧化物酶）酶（堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶）（二）非放射性標(biāo)記物：（二）非放射性標(biāo)記物：四、探針的標(biāo)記方法四、探針的標(biāo)記方法 酶標(biāo)記法酶標(biāo)記法 化學(xué)標(biāo)記法化學(xué)標(biāo)記法 體外標(biāo)記方法：體外標(biāo)記方法： n 切口平移法（切口平移法（nick translation)nick translation)n 隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法 （random primingrandom priming）n DNADNA的的5 5末端標(biāo)記末端標(biāo)記n PCRPCR標(biāo)記法標(biāo)記法 幾種探針標(biāo)記方法：幾種探針標(biāo)記方法： 第三節(jié)第三節(jié)印跡雜交技術(shù)印跡雜交技術(shù) 印跡雜交技術(shù)印跡雜交技術(shù)以以固相雜交固相雜交為基礎(chǔ)為基礎(chǔ). .

11、 印跡雜交技術(shù)印跡雜交技術(shù)是將通過凝膠電泳分離的待測(cè)是將通過凝膠電泳分離的待測(cè)核酸轉(zhuǎn)移并結(jié)合到固相支持物上，然后與探針核酸轉(zhuǎn)移并結(jié)合到固相支持物上，然后與探針進(jìn)行雜交并分析。進(jìn)行雜交并分析。印跡印跡指將凝膠中的待測(cè)核酸轉(zhuǎn)移到固相膜上。指將凝膠中的待測(cè)核酸轉(zhuǎn)移到固相膜上。一、固相支持物一、固相支持物n 硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜n 尼龍膜尼龍膜n 活化濾紙活化濾紙二、印跡方法二、印跡方法n毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移法毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移法n真空轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法n電轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法三、印跡雜交過程三、印跡雜交過程 樣品制備樣品制備 電泳分離電泳分離 預(yù)雜交預(yù)雜交 洗膜洗膜 分析分析雜交雜交 印跡印跡第四節(jié)第四節(jié) 常用核

12、酸分子雜交技術(shù)常用核酸分子雜交技術(shù) u DNADNA印跡法印跡法u RNARNA印跡法印跡法u 斑點(diǎn)雜交法斑點(diǎn)雜交法u 原位雜交原位雜交 主要用于基因組主要用于基因組DNADNA的定性和定量分析的定性和定量分析( (特定序列特定序列定位定位) )，亦可分析重組質(zhì)粒和噬菌體。，亦可分析重組質(zhì)粒和噬菌體。一、一、 DNA印跡技術(shù)印跡技術(shù) (Southern blotting)1975年,Southern印跡雜交（Southern blot）由英國(guó)人埃德溫邁勒薩瑟恩 （Edwin Mellor Southern）創(chuàng)建。埃德溫邁勒薩瑟恩方法：利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制方法：利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限

13、制性內(nèi)切酶消化的性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)或者紫外線照射固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，通過顯色，檢測(cè)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，通過顯色，檢測(cè)特定特定DNA分子的含量。分子的含量。 兩個(gè)主要過程：兩個(gè)主要過程：一是印跡（一是印跡（blottingblotting）二是分子雜交二是分子雜交主要步驟主要步驟: : RE RE酶切待測(cè)酶切待測(cè)DNA DNA 瓊脂糖電泳分離待測(cè)瓊脂糖電泳分離待測(cè)DNADNA片段片段

14、 使使DNADNA變性變性 中和中和 預(yù)雜交預(yù)雜交 雜交雜交 放射自顯影放射自顯影 結(jié)果分析結(jié)果分析一、一、 DNA印跡技術(shù)印跡技術(shù) (Southern blotting) DNA的純化、酶切的純化、酶切凝膠電泳分離凝膠電泳分離DNA片段片段DNA變性變性轉(zhuǎn)膜、固定轉(zhuǎn)膜、固定預(yù)雜交、雜交預(yù)雜交、雜交檢測(cè)檢測(cè)分析分析制備探針制備探針 Southern blotting 的步驟：的步驟：DNA分子雜交實(shí)驗(yàn)分子雜交實(shí)驗(yàn)?zāi)磕?錄錄放放射射自自顯顯影影照照片片 將將RNARNA樣品完全變性，通過瓊脂糖凝膠電泳按樣品完全變性，通過瓊脂糖凝膠電泳按分子大小分離，然后轉(zhuǎn)移到固相膜上，固定后與探分子大小分離，然

15、后轉(zhuǎn)移到固相膜上，固定后與探針進(jìn)行雜交。針進(jìn)行雜交。二二 、RNA印跡技術(shù)印跡技術(shù) (Northern blotting) 用于用于RNARNA的定性定量分析。主要用于檢測(cè)某一的定性定量分析。主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異組織或細(xì)胞中已知的特異mRNAmRNA的表達(dá)水平，也可以的表達(dá)水平，也可以比較不同組織和細(xì)胞中的同一基因的表達(dá)情況。比較不同組織和細(xì)胞中的同一基因的表達(dá)情況。 Northern blotting 的步驟的步驟制備探針制備探針變性、凝膠電泳變性、凝膠電泳泡膠，洗去變性劑泡膠，洗去變性劑轉(zhuǎn)膜、固定轉(zhuǎn)膜、固定預(yù)雜交、雜交預(yù)雜交、雜交檢測(cè)檢測(cè)分析分析RNA的純化的純化與與DN

16、ADNA印跡的區(qū)別：印跡的區(qū)別： DNADNA印跡是先電泳后變性、轉(zhuǎn)移；印跡是先電泳后變性、轉(zhuǎn)移； RNARNA印跡是先變性后電泳、轉(zhuǎn)移，且不能印跡是先變性后電泳、轉(zhuǎn)移，且不能 采用堿變性采用堿變性固定固定直接將樣品點(diǎn)在膜上直接將樣品點(diǎn)在膜上預(yù)雜交、雜交預(yù)雜交、雜交檢測(cè)檢測(cè)分析分析制備探針制備探針三、斑點(diǎn)雜交法三、斑點(diǎn)雜交法(dot blotting) 特點(diǎn)特點(diǎn): 簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單, ,但特異性差但特異性差. . 在細(xì)胞保持基本形態(tài)的情況下將探針在細(xì)胞保持基本形態(tài)的情況下將探針注入細(xì)胞內(nèi)與注入細(xì)胞內(nèi)與DNADNA或或RNARNA雜交，雜交反應(yīng)在雜交，雜交反應(yīng)在載物片上的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。載物片上的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。 四、原位雜交法四、原位雜交法(in situ hybridization)DNA點(diǎn)陣點(diǎn)陣本章重點(diǎn)本章重點(diǎn):n掌握以下概念掌握以下概念: : 核酸分子雜交核酸分子雜交; ;探針探針; ;印跡；印跡；核酸的變性核酸的變性/ /復(fù)性復(fù)性;Tm;Tm;增