全自動熒光免疫分析儀工作原理

1、一、基本結構（一）按照反應裝置的結構，自動生化分析儀主要分為流動式(FLOW SYSTEM)、分立式(DISCRETE SYSTEM)兩大類。1流動式 指測定項目相同的各待測樣品與試劑混合后的化學反應在同一管道流動的過程中完成。這是第一代自動生化分析儀。2分立式 指各待測樣品與試劑混合后的化學反應都是在各自的反應杯中完成。其中有幾類分支。(1)典型分立式自動生化分析儀。此型儀器應用最廣。(2)離心式自動生化分析儀，每個待測樣品都是在離心力的作用下，在各自的反應槽內與試劑混合，完成化學反應并測定。由于混合，反應和檢測幾乎同時完成，它的分析效率較高。3袋式自動生化分析儀是以試劑袋來代替反應杯和比色

2、杯，每個待測樣品在各自的試劑袋內反應并測定。4固相試劑自定生化分析儀(亦稱干化學式自動分析儀) 是將試劑固相于膠片或濾紙片等載體上，每個待測樣品滴加在相應試紙條上進行反應及測定。操作快捷、便于攜帶是它的優(yōu)點。(二)典型分立式自動生化分析儀基本結構1樣品(SAMPLE)系統(tǒng)樣品包括校準品、質控品和病人樣品。系統(tǒng)一般由樣品裝載、輸送和分配等裝置組成。樣品裝載和輸送裝置常見的類型有：(1)樣品盤(SAMPLE DISK)，即放置樣品的轉盤有單圈或內外多圈，單獨安置或與試劑轉盤或反應轉盤相套合，運行中與樣品分配臂配合轉動。有的采用更換式樣品盤，分工作和待命區(qū)，其中放置多個弧形樣品架(SECTOR)作轉

3、載臺，儀器在測定中自動放置更換，均對樣品盤上放置的樣品杯或試管的高度、直徑和深度有一定要求，有的需專用樣品杯，有的可直接用采血試管。樣品盤的裝載數(shù)，以及校準品、質控品、常規(guī)樣品和急診樣品的裝載數(shù)，一般都是固定的。這些應根據(jù)工作需要選擇。(2)傳動帶式或軌道式進樣 即試管架(RACK)不連續(xù)，常為10個一架，靠步進馬達驅動傳送帶，將試管架依次前移，再單架逐管橫移至固定位置，由樣品分配臂采樣。(3)鏈式進樣試管固定排列在循環(huán)的傳動鏈條上，水平移動到采樣位置，有的儀器隨后可清洗試管。分配加樣裝置大都由注射器、步進馬達或傳動泵、加樣臂和樣品探針等組成，注射器(SYRINE UNIT)。根據(jù)注射器直徑和

4、活塞移動距離的多少，定量吸取樣品或試劑。它的精度決定加樣的精度，一般可精確到1微升。注射器漏液時，首先考慮是否探針堵塞，其次是注射器活塞磨損等。有的加液系統(tǒng)采用容積型注射泵和數(shù)控脈沖步進馬達，提高精度。樣品探引(PROBE)與加樣臂相聯(lián)，直接吸取樣品。探針均設有液面感應器，防止探針損傷和減少攜帶污染。有的設有阻塞檢測報警系統(tǒng)當探針樣品中的血凝塊等物質阻塞時儀器會自動報警沖洗探針，并跳過當前樣品，對下一樣品加樣。有的還有智能化防撞裝置遇到阻礙探針立即停止運動并報警。即使如此，它仍是非正規(guī)操作時的易損件。為了保護探針，除預先需要根據(jù)樣品容器的高低、最低液面高度等進行設置外、，樣品容器的規(guī)格、放置以

5、及液面高度等設定條件不得隨意改變。在某些儀器上，采樣器和加液器組合在一起，加樣品和加試劑或稀釋液一個探針一次完成。加樣臂。連接探引，在樣品杯(試劑瓶)和反應杯之間運動，完成采樣和加樣(加試劑)。它的運動方式，與儀器工作效率及工作壽命有一定關系。閥門用以決定液體流動方向。稀釋系統(tǒng)。對樣品進行預稀釋、過后稀釋或加倍，對標準原液系列稀釋等。不同儀器的稀釋方式有所差異，要注意識別。試劑系統(tǒng)亦有稀釋功能：2試劑(REAGENT)系統(tǒng)一般由試劑儲放和分配加液裝置組成。(1)試劑倉常與試劑轉盤結合在起。多數(shù)儀器將試劑倉設為冷藏室，以提高在線試劑的穩(wěn)定期。(2)分配加液裝置(DISPENSE UNIT)。與樣

6、品系統(tǒng)的類似。，試劑探針常常可以對試劑預加溫，雙試劑系統(tǒng)的試劑2(R2)探針起始量宜較下，以便配合不同R1/R2比例的試劑。(3)試劑瓶(BOTTLE)。有不同的形狀及大小規(guī)格。如 COBAS MIRA PLUS儀有4、10、15、35ML等規(guī)格，瓶底呈凹形，OLYMPUS AU600儀有30和60ML兩種；日立7060儀有20、50、100ML三種等規(guī)格。應根據(jù)工作量和試劑規(guī)格考慮試劑瓶殘留死體積和更換頻率，合理選用。獨特設計的卡式試劑盒，體積小，防蒸發(fā)，方便儲存。(4)配套試劑常有條形碼，儀器設有條形碼檢查系統(tǒng)，可對試劑的種類、批號、存量、有效期和校準曲線等貨剌，進行核對校驗，如BECKM

7、ANCX7等。(5)試劑瓶蓋自動開關系統(tǒng)，更有利于試劑保存。有的儀器可在運行中添加，更換試劑，有的則須在暫停狀態(tài)進行。3條形碼(BARCODE)識讀系統(tǒng)一般由掃描系統(tǒng)、信號整形和譯碼器三部分組成。掃描系統(tǒng)以光源掃射黑條白空相間的條碼符號由于條和空對光的反射不同、不同寬窄的條符反射光持續(xù)時間不同，產生強度不同的反射光再經光電轉換元件接收并轉換成相應強度的電信號，最后通過信號整形，由譯碼器解譯。系統(tǒng)自動識別樣品架及樣品編號識別試劑、校準品及其批號、失效期，有的并可識別校驗校準曲線等信息。實驗室常用條形碼類型有CODE 39、CODE 128、2 OF 5 STANDARD、INTERLEAVED2

8、OF 5等。要自編樣品條形碼需要條形碼輸入器，條形碼閱讀系統(tǒng)與條形碼要匹配。已有全自動試管分配暨條形碼粘貼準備系統(tǒng)。4反應系統(tǒng)(1)反應盤裝載一系列反應比色杯（CUVETTES）,多為轉盤形式。反應測定過程中按固定程序，在加樣臂、加液臂、攪拌棒、光路和清洗裝置之間轉動。有的儀器在反應杯中完成反應后再吸入比色杯比色，現(xiàn)在更常見反應和檢測同在比色杯中進行，效率更高，尤其適于連續(xù)監(jiān)測法。比色杯多采用硬質石英玻璃、硬質玻璃、無紫外光吸收的丙烯酸塑料等，使用壽命不一。DIMENSION系列的比色杯在機器內自動制造，自動封口，免沖洗，無污染。流動池式主要在小型分析儀用。容積一般幾十微升，但抽液管道占用較多

9、反應液，多樣品連續(xù)使用，增加交叉污染機會。蠕動泵(PUMP)。半自動生化儀需要蠕動泵抽吸反應液進人流動比色池作測定。要求定期對蠕動泵校準，即通過吸人定量的水來檢驗泵的吸液量是否準確。一般均設有泵校準功能。(2)混合裝置(MIXING UNIT) 如采用多頭回旋攪拌棒(二頭雙清洗式攪拌系統(tǒng))。攪拌棒常具特氟隆不粘涂層，避免液體粘附。(3)溫控裝置生化分析儀通過恒溫控制裝置來保持孵育溫度的調控和恒定也是由計算機來控制的，理想的孵育溫度波動應小于±01。保持恒溫的方式有三種?？諝庠『銣兀杭丛诒壬c加熱器之間隔有空氣?？諝庠『銣氐奶攸c是方便、速度快、不需要特殊材料，但穩(wěn)定性和均勻性較水浴稍

10、差。羅氏(ROCHE)的COBAS和0LYMPUS AU2700系統(tǒng)采用的就是空氣浴恒溫模式。水浴循環(huán)式：即在比色杯周圍充盈有水，加熱器控制水的溫度。水浴恒熱的特點是溫度恒定，但需特殊的防腐劑以保證水質的潔凈，且要定期更換循環(huán)水。日立系統(tǒng)生化分析儀采用的即是水浴循環(huán)恒溫裝置。恒溫液循環(huán)間接加熱式：結構原理是在比色杯周圍流動著一種特殊的恒溫液(具無味、無污染、惰性、不蒸發(fā)等特點)。比色杯和恒溫液之間有極小的空氣狹縫，恒溫液通過加熱狹縫的空氣達到恒溫，其溫度穩(wěn)定性優(yōu)于干式，和水浴式循環(huán)式相比不需要特殊保養(yǎng)。5清洗(WASH)系統(tǒng)探針和攪拌棒采用激流式等方式自動沖洗。清洗裝置一般由吸液針、吐液針和擦

11、拭刷組成。清洗工作流程為吸出反應一吸于一注入純水一吸干一擦干。清洗液有堿性和酸眭兩種。一般說來，在吸出反應液后，儀器先用堿性液沖洗，再用酸性液沖洗，最后用去離子水沖洗三遍。擦拭刷的功能是吸去杯壁上掛淋的水，刷體內部有負吸裝置。使用進程中要注意擦拭刷是否磨損。值得注意的是，對于常規(guī)沖洗還不能清除交叉污染(CARRYOVER)的實驗要特別處理，以減少交叉污染或攜帶污染。例如，膽固醇測定試劑中的膽酸鹽對血清總膽汁酸的測定有干擾，在消除交叉污染的程序中，可輸入程序，指令總膽汁酸不在測試膽固醇的比色杯中進行測定，如不能避開，儀器則對比色杯進行特別沖洗，防止發(fā)生交叉污染。沖洗水的水溫自動控制到與恒溫反應槽

12、溫度相近，保證反應系統(tǒng)的恒溫，并增加去污力。急診測定后采用針對性清洗，似乎比采用固定的全面清洗程序更有效率更經濟。耗水量儀器間相差較大。ABBOTT AEROSET 自動生化分析儀等系統(tǒng)具有自動清洗功能(SMART WASH)和最佳標本順序選擇功能(OSS)。即儀器根據(jù)試劑或樣品間交叉污染的項目組合，自動改變檢測順序，避免互有影響的分析項目；確實無法回避時，則采用選定的特殊清洗劑作自動清洗。6比色系統(tǒng)(1)光源多數(shù)采有鹵素燈，工作波長為325800NM。鹵素燈的使用壽命較短，一般只有1 000L 500小時。當燈的發(fā)光強度不夠時，儀器會自動報警，應及時更換，部分生化分析儀采用的是長壽命的氙燈，

13、24小時待機可工作數(shù)年，工作波長285-750NM。(2)比色杯 自動生化分析儀的比色杯也是反應杯。比色杯的光徑0.50.7 CM不等，通常為石英或優(yōu)質塑料。光徑小的省試劑，當比色杯光徑小于1 CM時，部分儀器可自動校正為1CM。生化分析儀的比色杯自動沖洗裝置在儀器完成比色分析后做自動反復沖洗、吸干的動作，比色杯在自動檢查合格后繼續(xù)循環(huán)使用。要及時更換不合格的比色杯。如采用的是石英比色杯，比色杯要定期檢查清洗。(3)單色器與檢測器各類自動生化分析儀應用的是可見一紫外吸收光譜法，即監(jiān)測200-700NM光區(qū)某特定波長下發(fā)色基團吸光度的變化，輔以微機軟件系統(tǒng)的計算來完成測定?？梢娨蛔贤馕庾V定量的

14、基礎是LAMBERBEER定律。傳統(tǒng)的分光度測定普遍采用前分光，即在光源燈和樣品杯之間先要用濾光片、棱鏡或光柵分光，通過可調的狹縫，取得與樣品“互補”的單色光之后，照射到樣品杯，再用光電池或光電管作為檢測器，測定樣品對單色光的吸收量(吸光度)。而現(xiàn)代大多生化分析儀采用后分光測量技術。后分光測定：將一束白光(混合光)先照到樣品杯，然后再用光柵分光，同時用一列發(fā)光二極管排在光柵后面作為檢測器。后分光的優(yōu)點是不需移動儀器比色系統(tǒng)中的任何部件，可同時選用雙波長或多波長進行測定，這樣可降低比色的噪聲，提高分析的精確度和減少故障率。生化儀的單色器即分光裝置，有干涉濾光片和光柵分光兩類。干涉濾光片有插入式和

15、可旋轉的圓盤式兩種。插入式就是將需用的濾光片插入濾片槽中，圓盤式是將儀器配備的濾光片都安裝在圓盤中，使用時旋轉至所需濾光片處即可。干涉濾光片價格便宜，但易變潮霉變，從而影響檢測結果的準確性，半自動生化分析儀多采用此種濾光片。光柵分光可分為全息反射式光柵和蝕刻式凹面光柵兩種。前者是在玻璃上覆蓋一層金屬膜后制成，有一定程度的相差易被腐蝕；后者是將所選波長固定地刻制在凹面玻璃上，耐磨損、抗腐蝕、無相差。全自動生化分析儀多采用光柵分光。7程序控制系統(tǒng)計算機是自動生化分析儀的大腦，標本、試劑的注加和識別，條碼的識別，恒溫控制，沖洗控制，結果打印，質控的監(jiān)控，儀器各種故障的報警等都是由計算機控制完成。儀器

16、一代勝過一代，自動化程度越來越高，有的儀器甚至可以完成部分日常保養(yǎng)程序。自動生化分析儀數(shù)據(jù)處理功能日趨完善，如：反應進程中吸光度，各種測定方法，各種校準方法室內質控結果的統(tǒng)計等，生化儀都可進行處理。計算機還可以調看病人的數(shù)據(jù)、儀器的性能指標、儀器的運行狀態(tài)等。自動生化儀中的質控和病人結果還可通過儀器計算機與實驗室信息系統(tǒng)(LIS)的對接進行網絡管理。程序控制器是系統(tǒng)的硬件部分。它主要包括：(1)微處理器和主機電腦。用于儀器各個單元和總體控制，應具有程控操作、故障診斷、多種數(shù)據(jù)處理和儲存等強大功能。一般根據(jù)儀器功能的需要和電腦硬件市場的主流產品來配置。(2)顯示器(CRT MONITOR UNI

17、T)。通常用鍵盤、鼠標、觸摸屏等方式進行操作。(3)系統(tǒng)及配套軟件。多采用WINDOWS-NT或WINDOWS界面，具全圖形化設計，多菜單選擇，信息導引，故障報警，幫助提示，人機“對話”，方便直觀，不少儀器有即時反應曲線顯示。(4)通過RS 232 C等數(shù)據(jù)接口與其他計算機、打印機等設備傳輸數(shù)據(jù)。具人工智能雙向通訊系統(tǒng)(HOST QUERY)，儀器可直接自行向主電腦詢問病人樣品基本資料及檢測項目。有的具遠程通訊及監(jiān)控功能，可遙控遠處測試及維修檢查，實現(xiàn)網絡工作。自動生化分析儀均采用程序控制的自動分析。分析程序一經確定，工作時只要簡單地輸入測定項目或編碼，儀器即可按編制程序自動完成測定、計算和報

18、告。具體的控制程序因儀器而異，一般分為固定程序和自編程序兩種。固定程序為儀器廠家預先設定，常與指定試劑配套；有的不能更改，有的也可由用戶修改。它與配套試劑一同使用時，既方便工作，質量也比較可靠，但成本較高。自編程序靈活實用，便于開發(fā)新項目，強調程序的靈活性。比如，成批測定過程中應可隨時插入急診標本測定而不打亂原有程序；單個急診標本測定操作簡捷、消耗少，可靈活預稀釋或重復測定。二、儀器一般工作流程生化分析儀的正確應用，只是掌握了測定技術原理還不夠，還需要對具體儀器的工作流程及測定計算方法有足夠的了解。   (一)一般工作流程工作流程可以通過儀器的測定周期來考察。重點關注比色杯

19、空白讀數(shù)點(CB)、加樣品點（S）、各試劑加液點(R1、R2、)、試劑空白讀數(shù)點(RB)、各測定讀數(shù)點(P)、各點時間間隔及周期總時間等。每個儀器一般都在反應轉盤的固定位置和反應測定周期的固定時間設置樣品試劑和稀釋的加液位，以及測定讀數(shù)點。如HITACHI 7170在P1到P34周期為10分鐘時，PO前加樣品，RL在PL前，R2在P5和P6間，R3在P16和P17間，R4在：P33和P34間。(二)數(shù)據(jù)處理計算方法儀器在各個吸光度讀數(shù)點讀取的吸光度數(shù)據(jù)，并不一定都納人濃度計算。儀器往往根據(jù)儀器定義和操作者設定的要求，對吸光度原始數(shù)據(jù)作計算處理，轉換成所謂反應數(shù)據(jù)，再按系數(shù)或公式作濃度計算。舉例

20、如下：1HITACH 7170的終點法測定點(A )吸光度計算為(AX+AX1)2。實際吸光度=吸光度數(shù)據(jù)×10 000。20LYHPUS AU 600試劑空白數(shù)據(jù)：P0點試劑空白(RB)=P0點吸光度一比色杯水空白(WB)；任一測定點試劑空白(RB )。該點吸光度一比色杯水空白(WB)。3MONARCH 1 000兩點終點法的反應數(shù)據(jù)。(終點測定吸光度一終點空白吸光度)一(始點測定吸光度一始點空白吸光度)。4AU 600的終點法(帶試劑空白，END法)的反應數(shù)據(jù)=終點吸光度一P0點吸光度(試劑空白，RB)。終點法(不帶試劑空白，END)法)的反應數(shù)據(jù)=終點吸光度-比色杯水空白(WB

21、)。5AU 600的兩點法(自身空白)的反應數(shù)據(jù)=加第二試劑后測定點讀數(shù)一P0點讀數(shù)一加第二試劑前測定點讀數(shù)一PO點讀數(shù)。三、主要操作程序(一)儀器運行前操作程序主要進行儀器的基本設置：L試驗項目設置對試驗名稱、編碼，試驗組合(PROFILE)、試驗輪次(ROUND)，必要時包括試驗順序等設置。  2各試驗的參數(shù)設置包括試驗間比值、結果核對等參數(shù)的設定。3劑設置根據(jù)有關試驗參數(shù)，設置各試驗的試劑位、試劑瓶規(guī)格，必要時設定試劑批號、失效期等。4校準品設置對校準品的位置、濃度和數(shù)量等進行設置。5質控設置 根據(jù)質控要求。設置質控物個數(shù)，質控規(guī)則，質控項目及相應質控參數(shù)等。6樣品管設置 包括

22、樣品管類型，殘留液高度（死體積），識別方式等設置。7其他設置對數(shù)據(jù)傳輸方式、結果報告格式、復查方式及復查標準等設置。(二)常規(guī)操作程序開機(預熱、保養(yǎng))-設置開始條件(日期時間索引、輪次、樣品起始號等)-根據(jù)需要，申請校準、質控和病人測定項目(包括架號、杯號或順序號。測定中可繼續(xù)申請)_裝載校準品、質控物和病人標本-裝載試劑-核對儀器起始狀態(tài)（未應用條碼系統(tǒng)，采用順序識別樣品時，尤其要核對測定起始編號是否與樣品架號和申請?zhí)栂喾?定標和質控測定-檢查定標和質控結果-病人標本測定-測定過程監(jiān)控（試劑檢查，觀察分析結果，編輯校正）-數(shù)據(jù)傳遞（打印報告，向檢驗管理系統(tǒng)傳輸，包括工作量統(tǒng)計、財務統(tǒng)計、

23、病人情況追蹤、質控分析等)。測定后保養(yǎng)。(三)測定結果檢查分析1要了解和熟悉儀器的各種警示符號的含義與作用在正確設定參數(shù)的前提下，利用各種警示符能提高 們發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的效率。2要熟悉和靈活運用儀器的相關操作屏(界面) 如：用反應過程監(jiān)測(REACTION MONITOR)，觀察反應時間進程曲線；用校準追蹤(CALIBRATION TRACE)回顧分析校準曲線；利用統(tǒng)計(STATISTICS)了解不同日期段病人測定均值及數(shù)據(jù)分析；運用分析數(shù)據(jù)編輯(DATA EDIT)察看和校正測定數(shù)據(jù)。3校準的檢查要充分利用儀器設置的功能，監(jiān)測校準曲線圖形、各校準點吸光度值(不能忽略試劑空白值及空白速率值

24、)、計算K值等的波動情況，以及與以往的比較。必要時，應進一步檢查反應時間進程曲線。必須結合質控數(shù)據(jù)來把握實驗條件。4病人結果的檢查除了目測觀察或用血清指數(shù)了解標本性狀，注意和了解臨床資料及診斷外，學會分析反應時間進程曲線及數(shù)據(jù)是重要的基本功。四、基本測定方法   (一)終點法(END POINT METHOD)   根據(jù)反應達到平衡時反應產物的吸收光譜特征及其吸光度大小，對物質進行定量分析的方法。對一般化學反應來說，反應完全(或正、逆反應動態(tài)平衡)、反應產物穩(wěn)定時為反應終點。對抗原一抗體反應來說，是抗原和抗體完全反應、形成最大且穩(wěn)定的免疫復合物時為終點。

25、在反應時間進程曲線上為與X軸平行線區(qū)段。在測定計算方式上，一般分為一點法和兩點法兩種。1一點法(ONE POINT) 以試劑和樣品混合之前的空氣空白(GB)、水空白(WB)或試劑空白(RB)的吸光度值為測定計算基點，以反應終點的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，得到反應吸光度。通過與相同條件下校準液反應吸光度的比較，求得測定結果。常與一點校準法配合使用，即采用一個校準濃度，校準曲線通過零點且成線性。也應用多點校準。2兩點終點法(TWO POINT END)即終點一始點法 以試劑和樣品混合之后的某一時間點作為始點，以反應終點的吸光度讀數(shù)減去始點讀數(shù)。一定條件下可降低樣品對反應或反應本身的特異性于擾(主要指

26、色度干擾)。常采用雙試劑，多以加R2前某一點作測定始點；某些情況下，也可以加R2后一點作測定始點。若使用單試劑，主反應啟動太快或儀器起始讀數(shù)點受限時難以運用。固定時間法(FIXED METHOD)與兩點終點法的區(qū)別只是在：測定讀數(shù)的末點不在反應平衡區(qū)段，而是根據(jù)方法學選擇。如血清肌酐(苦味酸法)測定。3三點終點法 即雙終點法，在一個通道內一次進行兩項反應相關的終點法測定。比如同測游離脂肪酸和甘油三酯。某些儀器(如HITACHI系列)設置此方法。(二)連續(xù)監(jiān)測法(CONTINUOUS MONITORING METHOD)又稱速率法(RATE ASSAY)。即連續(xù)監(jiān)測反應過程，根據(jù)所測定的產物生成

27、或底物消耗的速度進行定量分析的方法。在反應時間進程曲線上為反應呈恒速區(qū)段(斜率保持不變)，常用于酶活性線性反應期測定。1連續(xù)監(jiān)測法即零級反應速率法，亦稱斜率法。在較長的反應時間區(qū)段內(至少90-120秒)，每隔一定時間(常為230秒)讀取一次吸光度值，至少讀取4點，得到3個A；一般將連續(xù)多次讀數(shù)作最小二乘法處理，讀數(shù)間隔時間太短的作帶速率時間(TR)多點法處理，均取線性反應部分的讀數(shù)，求出單位時間內的反應速率A/MIN。此法必須以零級反應為測定計算的基礎，因為只有在零級反應下，單位時間內的吸光度變化(反應速率A/MIN)才與酶活力呈正比。此法相對減少了分析誤差，大大提高了分析速度和準確性。但是，半自動生化分析儀采用單樣品連續(xù)監(jiān)測，相當耗時。應用連續(xù)監(jiān)測法，首先應準備線性范圍內的高、中、低濃度的樣品，分別作反應時間進程曲線，了解不同濃度下反應全過程，兼顧確定延遲時間和線性監(jiān)測期。2兩點速率法即所謂擬一