DNARNA蛋白質(zhì)等各種生物物質(zhì)的保存

1、各種生物活性物質(zhì)的保存Experience2009-08-16 16:34:36閱讀336評(píng)論0字號(hào)：大中小訂閱DNA、RNA蛋白質(zhì)、抗體和探針的保存方法：（網(wǎng)上搜索，僅供參考A_A）短期保存，兩年之內(nèi)吧，無(wú)菌水和 TE緩沖液是ok的。如果是長(zhǎng) 期保存，比如10年20年的話，我推薦你剛提取好的 DNA直接保存 到乙醇里，放200,放10年沒(méi)問(wèn)題。需要用的時(shí)候，再離心后，棄 去乙醇，加水或TE溶解即可。長(zhǎng)期保存用TE, DNA本來(lái)就是酸性，所以需要弱堿性環(huán)境保存， 如果用中性或者酸性環(huán)境保存容易降解。保存兩年應(yīng)該會(huì)降解的！還是不要超過(guò)兩年，再一年內(nèi)都有降解的可能，所以還是要盡快的利用 了。做成干

2、粉不太可能，哪里有那么多的量！還是在-80度以下保存吧，也要避免反復(fù)凍融。如果DNA很純的話，應(yīng)該影響不是很大啊，有文獻(xiàn)報(bào)道高純DNA 的最佳保存條件是4度，你也可以應(yīng)證一下你的DNA有沒(méi)有降解啊， 跑個(gè)電泳看看啊，如果出現(xiàn)smear,就不要用了?。√峒兊腄NA放在4度一段時(shí)間（數(shù)周-數(shù)月）都沒(méi)問(wèn)題。但是長(zhǎng) 期保存建議-20度，并且濃度不要稀釋的太低，否則容易降解。RNA若要長(zhǎng)期保存，需沉淀下來(lái)后置于無(wú)水乙醇凍在-70度用的時(shí)候再離心下來(lái)除去無(wú)水乙醇，用DEPCK溶解。保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量 RNase的污染，從富含 RNase的樣品(如胰臟、肝臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛

3、中以 保存高質(zhì)量的RNA,對(duì)于長(zhǎng)期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的 RNA,在水中貯存一個(gè)星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的 RNA,在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長(zhǎng)度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對(duì) 于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存 RNA樣品的 穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70 C。用于保 存RNA的甲酰胺一定不能含有降解 RNA的雜物。來(lái)源于胰臟的RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí)，可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaAc至，12,000 X離心5分鐘。RNA即使是放在-80度下也會(huì)降解，所以最好的保存方法是將 RNA 逆轉(zhuǎn)成cDN

4、A后保存。提取的RNA保存在DEPCM理的水中，加入RNAseJ卬止齊L在-80 度保存 2 個(gè)月，應(yīng)該是可以保證不降解的。最好是反轉(zhuǎn)錄后保存。一旦生物樣品被收集采摘，離體組織的RNA會(huì)立刻變得非常不穩(wěn) 定，極易被降解。由于特異及非特異的 RNA降解，或者由于樣品采 集過(guò)程中的應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生新的 RNA都會(huì)弓I起RNA狀態(tài)的改變。對(duì)于 生物芯片、基因表達(dá)矩陣分析(Array Analysis)、定量RT-PC噂實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，采樣后立即穩(wěn)定樣品里的 RNA以保存當(dāng)時(shí)RNA的表達(dá)狀態(tài)，是精確 /定量研究基因表達(dá)分析的重要前提。記得以前學(xué)植物遺傳的同學(xué)常常要帶著液氮罐，騎著單車(chē)到田里采樣 那個(gè)液氮罐的蓋子

5、有點(diǎn)問(wèn)題，一顛就冒白煙，嚇得一路上行人、車(chē)輛紛紛躲避，很是招搖，據(jù)說(shuō)有一次覺(jué)得液氮不夠了，趕著坐出租回來(lái)，那可是連哄帶騙才上了的士，到學(xué)校時(shí)司機(jī)已經(jīng)緊張得面無(wú)人色了 這真令貪玩的我們非常羨慕，只恨這等趣事怎么就落不到我們頭上。對(duì)當(dāng)事人來(lái)說(shuō)，每周一次帶著液氮罐到處跑實(shí)在不算一種有趣的經(jīng)歷。沒(méi)有辦法，為了保持樣品的RNA完整真實(shí)，要么當(dāng)場(chǎng)提 RNA,要么液氮保存，一直如此。不過(guò)自從有了 RNAlater,這種有趣的場(chǎng)面就會(huì)越來(lái)越少了。RNAlater 是特殊的樣品儲(chǔ)存液，只要在采樣后立即將新鮮樣品浸入這種液體試劑，RNlater可以迅速滲透到組織或其他生物樣本中， 穩(wěn)定并保護(hù)RNA完整而不被降解，

6、確保下游分析得到的數(shù)據(jù)真實(shí)反應(yīng)樣品的表達(dá)信息。樣品儲(chǔ)存液中保存的新鮮樣品可以在不超過(guò)37度的高溫天氣下保存一天，或者在25 度室溫下保存一周；或者4 度冰箱存放一個(gè)月；或者負(fù)20度長(zhǎng)期保存而使RNA保持完整免受降解。這種技術(shù)為在不同溫度和不同地點(diǎn)下的采樣、運(yùn)輸和保存樣品提供了極大的方便，同樣適合手術(shù)/解剖過(guò)程中部分樣品的保存。RNAlater的用法非常簡(jiǎn)單，只要在采樣后立即將樣品完全浸入適量 （10ul/1mg組織或者5倍體積）的RNAlater中即可。取樣的動(dòng)作要盡量快速利索，組織樣品的大小以厚度不超過(guò)公分為宜。對(duì)于一些小腎等器官則可以整個(gè)取出浸入溶液中，較大的則應(yīng)切開(kāi)為厚度小于公分的小塊，

7、以確保RNAlater 能迅速擴(kuò)散滲透入組織塊中的所有細(xì)胞中。采樣的容器應(yīng)該足夠大以容納10 倍于組織重量的溶液，避免組織塊擠在一起，同時(shí)建議將溶液加滿容器以避免在運(yùn)輸過(guò)程中組織塊露出液面。保存在RNAlater中的樣品RNA可以： 37 C下穩(wěn)定保存1天 18-25 C保存7天 2-8C穩(wěn)定4周 -20C永久保存3 .蛋白質(zhì)辛辛苦苦純化得到的那么一點(diǎn)蛋白，可千萬(wàn)不能因?yàn)椴欢迷趺幢４娑装桌速M(fèi)了！選擇什么樣的貯存方法取決于該蛋白的穩(wěn)定性和你打算保存多長(zhǎng)時(shí)間以及下一步你打算如何利用。一般來(lái)說(shuō)，蛋白溶液應(yīng)避免極端的pH （強(qiáng)酸or強(qiáng)堿），同時(shí)也不能接近其等電點(diǎn)的pH 另外，還應(yīng)該避免其他物質(zhì)的摻

8、入。如果保存時(shí)間在24h 以內(nèi)，大多數(shù)蛋白可以放置到4。如果保存時(shí)間在24h 以上， 應(yīng)該考慮避免蛋白溶液長(zhǎng)菌，可以事先過(guò)濾一下（through am filter）或者加入抑菌的物質(zhì)（如疊氮化鈉）。如果保存時(shí)間超過(guò)一周，則應(yīng)該將蛋白溶液冷凍起來(lái)。通過(guò)液氮或干冰冷凍的方法使蛋白溶液迅速冷凍，可以有效避免蛋白的變性。為避免多次凍溶致使蛋白活性降低或變性，應(yīng)該將蛋白溶液分裝保存，一次用多少就取多少。除此之外，還可以加入一些甘油（5-50%（w/v）或者血清（10 mg/ml）幫助目的蛋白保持穩(wěn)定。如果打算保存數(shù)月之久，則需要將其放置于20，此時(shí)要加入一定量甘油，避免“凍傷 ”。另外，還可以用硫酸銨

9、將蛋白沉淀置于4保存（損失較多，不建議采用）；也可以將蛋白以干粉狀態(tài)保存（保存時(shí)間最久）。新提取的蛋白可以分裝存在-80 度冰箱 ，保存（保險(xiǎn)系數(shù)）1 年，如果加入buffer 煮過(guò)的蛋白在-20 保存。最好提取的蛋白，一部分保存，一部分立刻加Buffer 煮，做實(shí)驗(yàn)。蛋白的穩(wěn)定性及保存方法PIERC公司技術(shù)資料Proteins comprise an extremely heterogeneous class of biological macromolecules. They are often unstable when not in their native environments,

10、 which can vary considerably among cell compartments and extracellular fluids. If certain buffer conditions are not maintained, extracted proteins may not function properly or remain soluble.Proteins can lose activity as a result of proteolysis, aggregation and suboptimal buffer conditions. Purified

11、 proteins often need to be storedfor an extended period of time while retaining their original structural integrity and/or activity. The extent of storagey frosmhealf life canfew days to more than a year and is dependent on the natu of the protein and the storage conditions used. Optimal conditions

12、for storage are distinctive to each protein; nevertheless, it is possible to suggest some general guidelines for protein storage and stability. Common conditions for protein storage are summarized and compared below.Generally, there are tradeoffs associated with each method. For example, proteins st

13、ored in solution at 4can be dispensedconveniently as needed but require morediligence to prevent microbial or proteolytic degradation; such proteins may not be stable for more than a few days or weeks. By contrast, lyophilization allows for long-term storage of protein with very little threat of deg

14、radation, but the protein must be reconstituted before use and may be damaged by the lyophilization process.BubJ 薩 1- CcilIlipfIL-fcOtl ol Pt G'Oli 孱，Cditllhqiillll.MrhlI 卅口HLU 2Kl野 w bfttMTiwm nt 一知野勖"C ill IkjllMI lUlEfE匚,4:0勝1|4蟲(chóng)1 (tguul用 43 fiydhn .fiplnktII。l EH&ELlbI yewVearvYfcst

15、SiRf14nHi1.ddhtvii efNc口 of vimi'* jv3 Epi* g* g vruKi-iiriJ Em iiwNe* i 嗎， tivErJri4 l3uiW 早gE*.j HLemtyQra«. it h疝1由力I le tyd|hEllfc aikDMlllBp* Hl：111cqT.blr 1. 4.'ouminii Pt iXc4ic IdubitunT闿 “t Pro 抑制kWorkiun CouctuhTitiQiiPMSF (Ptien liikciliykLikniyl OMtide)Sciiuj才支上0.1-! nAlBeii

16、ziiudmeine)n teases1 mMP«p$Mhn AAciiipoHE涉112 1111Inif>cplU4T】u”l臥Mg1tidApinEitiinV亡HnC ；打31亡!1號(hào)臼5 M* tulAllllpAlllI hied 聯(lián)。1kM41mJEDTA 扁 EGTAMcjAlloptotcn M1)0 1-irnM問(wèn)：純化后的蛋白質(zhì)4度保存約15天，怎么分子量發(fā)生了變化？答：蛋白質(zhì)樣品如果是溶液狀態(tài)的，在4度下頂多保存一個(gè)禮拜。15天太長(zhǎng)了。估計(jì)分降解成很多小蛋白。電泳時(shí)出現(xiàn)很多條帶。在-20度也就是保存一個(gè)月。最好的保存辦法還是將蛋白樣品凍干成粉末。保存，這

17、樣保存的時(shí)間會(huì)很長(zhǎng)。如果條件不具備，-70度也可以。蛋白樣品最忌諱反復(fù)凍融。答：蛋白保存應(yīng)根據(jù)對(duì)活性的要求及蛋白的種類(lèi)而定：抗體 ：除非一 些公司特別要求-20C凍存，一般4c可穩(wěn)定一年（無(wú)菌，如加疊氮鈉），因?yàn)榭贵w是一種具有非常穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的蛋白；要求具有活性的蛋白,最好根據(jù)需要小量保存4 （一周）、-20 （一個(gè)月）、 -80 （六個(gè)月）、液氮（基本無(wú)限期），反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致諸多不良后果，如聚集、修飾、降解、污染等（取決于蛋白濃度、緩沖液成分及蛋白本身的特點(diǎn)）；凍干是一種很好的長(zhǎng)期保存法（如條件具備），在大多數(shù)情況下可以很好地保存蛋白的活性，但不適于某些蛋白（因有些蛋白對(duì)凍干重溶時(shí)必然產(chǎn)生的鹽離

18、子濃度的急劇變化反應(yīng)不佳，其活性會(huì)永久喪失（應(yīng)具體對(duì)待，尚無(wú)規(guī)律可循）。另：蛋白聚集與二硫鍵形成是兩個(gè)概念，航基乙醇只負(fù)責(zé)維持-SH的游離狀態(tài)，形成二硫鍵是一化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生純凈物，聚集一般只通過(guò)一些離子鍵、范德華力、疏水力形成，可以用物理方法分開(kāi)。答：較長(zhǎng)時(shí)間的保存最好用 DTT在加入緩沖液中24小時(shí)內(nèi)，航基 乙醇被氧化，其后可加速蛋白的失活，而 DTT不危及蛋白質(zhì)的航基。因此，最好是在制備蛋白質(zhì)樣品的時(shí)候用大約12mmol/L 巰基乙醇，而長(zhǎng)期儲(chǔ)存則使用1-5mmol/L的DTTC （見(jiàn)蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)）另外，我有印象看產(chǎn)品目錄的時(shí)候，看到有一種用于western 的試劑盒，提供的試劑可以在還

19、原二硫鍵之后在巰基上烷基化，這樣就防止了二硫鍵的再次生成。4 .抗體抗體儲(chǔ)存容器應(yīng)由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成，常用的有聚丙烯， 聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲(chǔ)存的抗體中蛋白濃度很低(10-100Mg/L),就應(yīng)另加隔離蛋白以減少容器對(duì)抗體蛋白的吸附,隔離蛋白常用%的牛血清白蛋白。絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)存在4 -8條件下，以免凍融對(duì)抗體蛋白產(chǎn)生有害效應(yīng)?？贵w原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20條件下，并避免反復(fù)凍融。冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍，應(yīng)絕對(duì)避免用高溫快速解凍。被細(xì)菌污染的抗體常會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細(xì)菌污染，可于抗體溶液中加入%疊氮鈉?？贵w

20、經(jīng)真空冷凍干燥后置-20以下可保存3-5 年。保存稀釋后的單抗應(yīng)加入%疊氮鈉濃度。大多數(shù)稀釋抗體可進(jìn)行冷凍保存，少數(shù)抗體可能會(huì)丟失抗原活性。大多數(shù)單抗，只要蛋白濃度適當(dāng)，可在4下保存數(shù)月。其他注意事項(xiàng)：分裝可以最大程度的降低反復(fù)凍融對(duì)抗體活性的損害，同時(shí)也降低了由于多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。分裝的量以一次實(shí)驗(yàn)用完為好，最少不能少于10ul 每份。因?yàn)榉盅b體積越小，抗體的濃度越可能會(huì)受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4oC,避免再凍起來(lái)！抗體工作液應(yīng)該當(dāng)天配制當(dāng)天用完，在4oC 盡量不要超過(guò) 1 天。 絕對(duì)避免將抗體保存在自動(dòng)除霜冰箱中。盡

21、量將抗體保存在冰箱里層，而不是門(mén)上。無(wú)論是保存還是運(yùn)輸，絕對(duì)避免反復(fù)凍融！反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致抗體變性，導(dǎo)致多聚體形成，從而降低抗體的結(jié)合能力！蛋白在高濃度時(shí)更不容易降解(1 mg/ml 或者更高)，這就是為什么在抗體中加入BSA之類(lèi)作為穩(wěn)定劑的原因了；另一方面，加入的蛋白也可以減少抗體由于管壁吸附所造成的損失。但是如果抗體要用來(lái)標(biāo)記的話，則不能加入蛋白穩(wěn)定劑，因?yàn)檫@些穩(wěn)定劑會(huì)和抗體一起競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合標(biāo)記物。為了防止微生物污染，疊氮化鈉經(jīng)常被加入到抗體中(終濃度%(w/v) )。 疊氮化鈉會(huì)干擾任何含有氨基基團(tuán)的偶聯(lián)，因此在進(jìn)行偶聯(lián)之前，應(yīng)將疊氮化鈉去除。偶聯(lián)后的抗體可以加入疊氮化鈉保存，但是濃度只能是。

22、對(duì)于需要偶聯(lián)的抗體，thimerosal (merthiolate)可以替代疊氮化鈉作為保護(hù)劑！注：疊氮化鈉的去除方式：可以通過(guò)凝膠電泳或過(guò)濾的方式去除！IgG的分子量是150kDa(IgM是 600kDa);疊氮化鈉的分子量只有 65Da。使用cut off 14kDa 的濾膜即可將疊氮化鈉從抗體中去除。純化IgG:不要保存稀釋的抗體，高濃度有利于保存。IgG會(huì)粘附于玻璃或塑料，低于ml 的蛋白會(huì)很快被吸收并變性失去活性。下面是我的讀書(shū)筆記，內(nèi)容全部摘錄自Using Antibodies這本 書(shū)。該書(shū)中專(zhuān)門(mén)有 Handling Antibodies這樣一個(gè)章節(jié)，對(duì)于像我這樣 的入門(mén)級(jí)還是很有

23、啟發(fā)的。首先要樹(shù)立的一個(gè)觀念是“抗體可一點(diǎn)兒都不脆弱，很強(qiáng)悍的”?！?Antibodies have a compact thre-edomain structure that has evolved to retain activity in most biological settings. One practical advantage of such compact and stable protein domain is that they are resistant to a broad range of mildly denaturing conditions, making l

24、ong-term storage of antibodies relatively easy. Storage buffers seldom need to be supplemented with glycerol or other stabilizing compounds that are commonly added to help maintain the activity of proteins purified in the lab. ”經(jīng)常使用的抗體可以4保存；長(zhǎng)期保存可以置于-20?！?Working solutions of antibodies are convenien

25、tly stored a4t . At this temperature they are stable for months to years without loss of activity. For long-term storage, antibodies can be kept conveniently at -20 in the serum, tissue culture supernatant, or ascitic fluid in which they arecollected. Lower temperatures will not hurt the antibody ac

26、tivities, but there is no significant advantage in lower-temperature storage. ” 也有例外，不是所有抗體在4都穩(wěn)定，有些得在常溫保存?！?The only group of antibodies that should not be stored at 4 are the so-called cryoproteins, which are sensitive to low-temperature storage, where they precipitate. Some mouse antibodies of the

27、 IgG3 subclass may fit these characteristics. If antibodies precipitate at 4over time,they should be kept at room temperature with addition of sodium azide. ”盡管抗體很穩(wěn)定，還是要避免反復(fù)凍融，因?yàn)樗赡茉斐煽贵w活力的喪失。原因是“ Antibody solutions should not be frozen and thawed repeatedly, because this can lead to denaturation of

28、antibodies that may lead to unwanted protein-protein aggregation. Aggregation of antibodies can cause the loss of activity due to steric interference of the antigen combining site or by generating insoluble material that is lost during centrifugation or filtration.”抗體到底可以保存多長(zhǎng)時(shí)間什么十年 “ Antibodies are

29、remarkably stable. If tightly sealed to avoid evaporation, they can be stored at 4 for months with no loss of activity. Antibodies stored at -20 have been shown to keep their activity for decades.這么強(qiáng)悍！那，抗體到底怕什么 “ The only problem commonly encountered in storing antibodies is contamination of these s

30、olutions with bacteria or fungi. This can be prevented by addition of antimicrobial agents; for example, by adding sodium azide to % or, as an alternative, Merthiolate to %.何時(shí)需要添加疊氮化納什么時(shí)候又不能添加“ Although useful and effective for most settings, sodium azide is not appropriate in some assays, because i

31、t blocks the cytochrome electron transport system and therefore is toxic to most organisms. In addition, the primary amine on the azide would attack the stability of the antibody's interaction with conjugate or matrix in coupling methods. If sodium azide is already present in a solution, it can be removed by dialysis or gel filtration.”自己純化的抗體，保存的時(shí)候要注意什么Purified preparations of antibodies