生物化學(xué)實驗總結(jié)

1、生物化學(xué)生物化學(xué)實驗總結(jié)實驗總結(jié)2010年年12月月內(nèi)內(nèi) 容容v一、混合物質(zhì)的分離、純化與鑒定一、混合物質(zhì)的分離、純化與鑒定v二、物質(zhì)含量（或濃度）測定二、物質(zhì)含量（或濃度）測定v三、酶活性測定三、酶活性測定一、混合物質(zhì)的分離、純化與鑒定一、混合物質(zhì)的分離、純化與鑒定v1.1. 電泳法電泳法v1.2. 層析法層析法v1.3. 排除法排除法1.1. 電泳法（電泳法（Electrophoresis）v1.1.1 電泳及其分離原理電泳及其分離原理v1.1.2 影響電泳速度的因素影響電泳速度的因素v1.1.3 常用的電泳支持介質(zhì)常用的電泳支持介質(zhì)v1.1.4 電泳后的染色電泳后的染色v1.1.5 電泳

2、的應(yīng)用電泳的應(yīng)用1.1.1 電泳及其分離原理電泳及其分離原理v電泳：電泳：是指帶電顆粒在電場中向本身所帶電荷相反是指帶電顆粒在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。的電極移動的現(xiàn)象。v電泳技術(shù)：電泳技術(shù)：利用在電場的作用下，由于待分離樣品利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子中各種分子帶電性質(zhì)帶電性質(zhì)以及分子本身以及分子本身大小、形狀大小、形狀等性等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術(shù)。（利用電泳對樣品進行分離、鑒定或提純的技術(shù)。（利用電泳現(xiàn)象）現(xiàn)象）泳動度或遷移率泳動度或遷移率(mobility,

3、m)d為帶電顆粒泳動的距離為帶電顆粒泳動的距離(cm)L為支持物的有效長度為支持物的有效長度(cm)t為通電時間為通電時間(s)v為加在支持物兩端的實際電壓為加在支持物兩端的實際電壓(V)1.1.2 影響電泳速度的因素影響電泳速度的因素v待分離生物大分子的性質(zhì)分子形狀分子形狀Shape分子量大小分子量大小Size所帶凈電荷量所帶凈電荷量Net charge(pI-pH)v電場強度E（v =Q / f）Electric field strength焦耳熱焦耳熱Q熱熱= I2Rt v緩沖溶液（緩沖溶液（Buffer） 緩沖溶液的緩沖溶液的pH Solution pH ：緩沖溶液的緩沖溶液的pH值決

4、定了值決定了 被分離物質(zhì)的解離程度，因此決定了被分離物質(zhì)被分離物質(zhì)的解離程度，因此決定了被分離物質(zhì) 所帶電荷的性質(zhì)及凈電荷量。所帶電荷的性質(zhì)及凈電荷量。 緩沖溶液的離子強度緩沖溶液的離子強度 Ionic Strength ：緩沖溶液的離子緩沖溶液的離子 強度越高，緩沖液離子所介導(dǎo)的電流就越多，則帶強度越高，緩沖液離子所介導(dǎo)的電流就越多，則帶 電顆粒的泳動速度越慢；反之則反。電顆粒的泳動速度越慢；反之則反。 低離子強度的緩沖液降低了總電流，減少了產(chǎn)熱；低離子強度的緩沖液降低了總電流，減少了產(chǎn)熱； 但其緩沖能力低下，會導(dǎo)致樣品擴散，降低電泳的但其緩沖能力低下，會導(dǎo)致樣品擴散，降低電泳的 分辨率。一

5、般選擇離子強度范圍在分辨率。一般選擇離子強度范圍在0.020.2之間。之間。 緩沖溶液的黏度：緩沖溶液的黏度： 緩沖系統(tǒng)的選擇緩沖系統(tǒng)的選擇 ？Ic zii=122支持介質(zhì)（支持介質(zhì)（The Property of the dispersion medium） 吸附：吸附：支持介質(zhì)對樣品的吸附滯留作用，導(dǎo)致樣品的拖尾支持介質(zhì)對樣品的吸附滯留作用，導(dǎo)致樣品的拖尾 ，從而降低了電泳的分辨率和總的遷移率。，從而降低了電泳的分辨率和總的遷移率。 電滲：電滲：緩沖液在電場中對緩沖液離子的相對移動。緩沖液在電場中對緩沖液離子的相對移動。 凝膠的分子篩效應(yīng)：凝膠的分子篩效應(yīng)：瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠都是多孔的

6、瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠都是多孔的 介質(zhì)，不同濃度的凝膠的孔徑大小不同。介質(zhì)，不同濃度的凝膠的孔徑大小不同。分子量大分子量大 且形狀不規(guī)則的被分離物質(zhì)所受阻力大，在電場中且形狀不規(guī)則的被分離物質(zhì)所受阻力大，在電場中 移動的速率慢移動的速率慢；反之則反。；反之則反。1.1.3 常用的電泳支持介質(zhì)常用的電泳支持介質(zhì)v醋酸纖維素薄膜醋酸纖維素薄膜(Cellulose Acetate Membrane)v瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠(Agarose Gel)v聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(Polyacrylamide Gel, PAG) 1.1.4 電泳后的染色電泳后的染色氨基黑氨基黑10B（Amino Bla

7、ck 10B）考馬斯亮藍考馬斯亮藍R-250 （定性）（定性）考馬斯亮藍考馬斯亮藍G-250 （定量）（定量）銀染色法銀染色法脂蛋白染色（蘇丹黑脂蛋白染色（蘇丹黑B）特異性酶的染色特異性酶的染色糖蛋白染色糖蛋白染色蛋白質(zhì)染色蛋白質(zhì)染色核酸染色核酸染色溴化乙錠溴化乙錠(Ethidium Bromide, EB)其他其他1.1.5 電泳的應(yīng)用電泳的應(yīng)用v分離混合物 醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)；醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)； 瓊脂糖凝膠電泳分離乳酸脫氫酶同工酶瓊脂糖凝膠電泳分離乳酸脫氫酶同工酶 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)菌菌液蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)菌菌液蛋白質(zhì)v純度的鑒定 瓊脂糖凝膠電泳

8、鑒定血細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳鑒定血細(xì)胞DNA 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定GST蛋白蛋白醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳(Cellulose Acetate Membrane Electrophoresis) 清清蛋蛋白白 1 球球蛋蛋白白 2 球球蛋蛋白白 球球蛋蛋白白 球球蛋蛋白白人血清醋酸纖維薄膜電泳圖譜（染色劑：氨基黑10B）聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE)Protein Marker（kDa）1 2 3 4 5 （染色劑：考馬斯亮藍（染色劑：考馬斯亮藍R-250）SDS-PAGEv

9、不連續(xù)不連續(xù)PAGE的分離效應(yīng)的分離效應(yīng)1. 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) 1) 緩沖液與凝膠的離子成分和緩沖液與凝膠的離子成分和pH值不同。值不同。Cl-，Gly-，蛋白質(zhì)離子。快，蛋白質(zhì)離子?？炻x子遷移快慢的差別造成電場強度與電導(dǎo)率的變化。低導(dǎo)電區(qū)和高導(dǎo)慢離子遷移快慢的差別造成電場強度與電導(dǎo)率的變化。低導(dǎo)電區(qū)和高導(dǎo)電區(qū)。蛋白質(zhì)樣品遷移率在快慢離子之間，壓縮聚集成一條窄帶。電區(qū)。蛋白質(zhì)樣品遷移率在快慢離子之間，壓縮聚集成一條窄帶。 2) 兩層凝膠的孔徑不同：濃縮膠為大孔膠，分離膠為小孔膠兩層凝膠的孔徑不同：濃縮膠為大孔膠，分離膠為小孔膠2. 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)3. 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)SDS 在在SDS

10、-PAGE中的作用中的作用vSDS在溶液中解離后帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合后在溶液中解離后帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合后，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。由于蛋白質(zhì)膠束。由于蛋白質(zhì)-SDS膠束膠束所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而消所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而消除了不同分子之間原有的電荷差異。除了不同分子之間原有的電荷差異。v蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS膠束形狀相似，均為橢圓棒狀。膠束形狀相似，均為橢圓棒狀。v因此，因此，SDS-PAGE是利用混合物間分子量的差異進是利用混合物間分子量的差異進行分離的。行分離的。SDS-PAGE凝

11、膠配制的注意事項凝膠配制的注意事項v先配制分離膠，當(dāng)加入自由基引發(fā)劑先配制分離膠，當(dāng)加入自由基引發(fā)劑AP和加速劑和加速劑TEMED后應(yīng)迅速混勻，以免局部濃度過高，形成后應(yīng)迅速混勻，以免局部濃度過高，形成的凝膠不均一；的凝膠不均一；v灌膠后須立即用蒸餾水進行封膠，以保持膠面平灌膠后須立即用蒸餾水進行封膠，以保持膠面平整和防止空氣中的氧對自由基的淬滅。整和防止空氣中的氧對自由基的淬滅。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳(Agarose Gel Electrophoresis)（染色劑：EB） DNA Marker Kbp+-1 2 3 4 51.2 層析法層析法1.2.1 層析法原理層析法原理1.2.2

12、 層析的兩相層析的兩相1.2.3 層析的分類層析的分類1.2.4 層析的顯色層析的顯色1.2.5 層析的應(yīng)用層析的應(yīng)用1.2.1 層析法的原理層析法的原理 層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（異（如吸附力如吸附力、分子形狀及大小分子形狀及大小、分子親和力分子親和力、分分配系數(shù)配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的

13、。達到分離的目的。1.2.2 層析的兩相層析的兩相v固定相：固定相：固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。v流動相：流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中一般個方向

14、移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。 1.2.3 層析的分類層析的分類按層析的原理分類按層析的原理分類v吸附層析吸附層析v分配層析分配層析v離子交換層析離子交換層析v凝膠層析凝膠層析v親和層析親和層析1.2.3.1 吸附層析吸附層析 根據(jù)被分離物質(zhì)在兩相中的吸附力不同根據(jù)被分離物質(zhì)在兩相中的吸附力不同進行分離。進行分離。 作為固定相的吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力的強作為固定相的吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力的強弱不同，弱不同，吸附力強吸附力強的物質(zhì)在流動相中的物質(zhì)在流動相中移動較慢移動較慢，吸吸附力弱附力弱的物質(zhì)在流動相中的物

15、質(zhì)在流動相中移動較快移動較快，從而達到分離，從而達到分離混合物樣品的目的。混合物樣品的目的。1.2.3.2 分配層析分配層析 利用被分離樣品在兩相之間的分配系數(shù)利用被分離樣品在兩相之間的分配系數(shù)（溶解度）的差異對混合物各組分進行分離。（溶解度）的差異對混合物各組分進行分離。 分配層析的固定相和流動相是兩種分配層析的固定相和流動相是兩種互不相溶互不相溶的的溶劑。溶劑。 在固定相中在固定相中溶解度高溶解度高的物質(zhì)隨流動相的物質(zhì)隨流動相移動的速移動的速度慢度慢；反之則反。；反之則反。1.2.3.3 離子交換層析離子交換層析 利用被分離物質(zhì)各組分與作為固定相的之利用被分離物質(zhì)各組分與作為固定相的之間的

16、親和力（靜電吸引力）不同，而達到離間的親和力（靜電吸引力）不同，而達到離子交換劑分離混合物的目的。子交換劑分離混合物的目的。 固定相：固定相：帶有大量電荷的帶有大量電荷的陽陽/ /陰陰離子交換劑離子交換劑 流動相：流動相：具有一定具有一定pH值值和一定和一定離子強度離子強度的的 電解質(zhì)溶液電解質(zhì)溶液 離子交換層析的洗脫方法離子交換層析的洗脫方法v增加離子強度增加離子強度v改變流動相（洗脫液）的改變流動相（洗脫液）的pH值值1.2.3.4 凝膠層析凝膠層析 利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用, ,根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進行分離。根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不

17、同來進行分離。 凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子大的分子不能進入不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最最先先被洗脫出來；比網(wǎng)孔被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子小的分子能不同程度的自由能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，較慢，最后最后被洗脫出來。被洗脫出來。1.2.3.5親和層析親和層析 利用生物分子間所具有的專一而又可逆的利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親和

18、力而使生物分子分離純化的層析技術(shù)。親和力而使生物分子分離純化的層析技術(shù)。 在成對互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，在成對互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對樣品溶液中的另一方分子進行親和層析，達到分離純化而對樣品溶液中的另一方分子進行親和層析，達到分離純化目的。目的。 在親和層析中，作為在親和層析中，作為固定相固定相的一方稱為的一方稱為配基配基(ligand)(ligand)。配基必須偶聯(lián)于不溶性母體配基必須偶聯(lián)于不溶性母體(matrix) (matrix) (又稱又稱載體載體) )上。上。 凝膠層析及親和層析常用的載體凝膠層析及親和層析常用的載體v瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠v葡聚

19、糖凝膠葡聚糖凝膠v聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠v纖維素纖維素1.2.4 層析的顯色層析的顯色例：例：v離子交換層析分離混合氨基酸的實驗中，氨基酸離子交換層析分離混合氨基酸的實驗中，氨基酸可與茚三酮反應(yīng)，產(chǎn)生藍紫色?？膳c茚三酮反應(yīng)，產(chǎn)生藍紫色。v該藍紫色化合物在該藍紫色化合物在570nm處有最大吸收峰，因此處有最大吸收峰，因此可以根據(jù)可以根據(jù)lambert-beer定律對分離出的氨基酸進定律對分離出的氨基酸進行定量分析。行定量分析。v各類物質(zhì)常用的顯色劑見教材各類物質(zhì)常用的顯色劑見教材P27。1.2.5 層析的應(yīng)用層析的應(yīng)用v離子交換層析分離混合氨基酸離子交換層析分離混合氨基酸 用磺酸型用磺酸型

20、陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂分離酸性氨基酸天冬氨分離酸性氨基酸天冬氨酸酸（2.97）和堿性氨基酸賴氨酸（）和堿性氨基酸賴氨酸（9.74）。）。 方法方法 ：改變洗脫液的：改變洗脫液的pH值（值（ pH 5.3 pH 12） 結(jié)果：天冬氨酸結(jié)果：天冬氨酸先先被洗脫下來，賴氨酸被洗脫下來，賴氨酸后后被洗脫被洗脫 下來下來1.2.5 層析的應(yīng)用層析的應(yīng)用v凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白 結(jié)果：紅色的色帶結(jié)果：紅色的色帶(分子量大的血紅蛋白分子量大的血紅蛋白)先先洗脫洗脫下來，黃色的色帶下來，黃色的色帶(分子量小的分子量小的DNP-魚精蛋白魚精蛋白)后后洗洗脫下來脫下來1

21、.2.5 層析的應(yīng)用層析的應(yīng)用v基因工程菌中（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）基因工程菌中（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）GST的親和層析分離的親和層析分離 瓊脂糖凝膠顆粒手臂上的谷胱甘肽可以與瓊脂糖凝膠顆粒手臂上的谷胱甘肽可以與GST蛋白特異蛋白特異性結(jié)合，通過洗脫除去不能與其結(jié)合的雜蛋白，然后使用還性結(jié)合，通過洗脫除去不能與其結(jié)合的雜蛋白，然后使用還原型谷胱甘肽原型谷胱甘肽(GSH)洗脫，洗脫，GSH競爭競爭GST上的結(jié)合位點而將上的結(jié)合位點而將GST蛋白洗脫下來，從而獲得純化的蛋白洗脫下來，從而獲得純化的GST酶的純品。酶的純品。 結(jié)果：結(jié)果：SDS-PAGE鑒定為一條區(qū)帶鑒定為一條區(qū)帶1.3. 排除法排除法

22、v真核細(xì)胞真核細(xì)胞DNA的分離與純化的分離與純化v實驗設(shè)計思路：實驗設(shè)計思路：v用雙蒸水的低滲環(huán)境使用雙蒸水的低滲環(huán)境使細(xì)胞膜溶脹破裂；細(xì)胞膜溶脹破裂；v加入加入NaI破細(xì)胞核膜，使核蛋白解離成蛋白質(zhì)和核破細(xì)胞核膜，使核蛋白解離成蛋白質(zhì)和核酸；酸；v加入氯仿加入氯仿/ /異戊醇，使蛋白質(zhì)變性沉淀，同時溶解異戊醇，使蛋白質(zhì)變性沉淀，同時溶解脂類物質(zhì)；脂類物質(zhì)；實驗設(shè)計思路：實驗設(shè)計思路：4.4. 離心后，混合物分成三相：上層為水相，含糖類、無離心后，混合物分成三相：上層為水相，含糖類、無機鹽類、核酸等易溶于水的物質(zhì)；中層為變性沉淀的機鹽類、核酸等易溶于水的物質(zhì)；中層為變性沉淀的蛋白質(zhì)相；下層為氯

23、仿相，其中含溶解的脂類物質(zhì)；蛋白質(zhì)相；下層為氯仿相，其中含溶解的脂類物質(zhì)；5.5. 移取上層液，加入異丙醇沉淀移取上層液，加入異丙醇沉淀DNA；6.6. 離心后，棄去上清，將剩下的沉淀部分用離心后，棄去上清，將剩下的沉淀部分用70%的乙醇的乙醇洗滌。沉淀干燥后，加入洗滌。沉淀干燥后，加入TE緩沖液或雙蒸水溶解緩沖液或雙蒸水溶解DNA，即得到純化的，即得到純化的DNA樣品。樣品。二、物質(zhì)含量（或濃度）的測定二、物質(zhì)含量（或濃度）的測定2.1 吸光光度法吸光光度法 基于基于物質(zhì)對不同波長的光具有選擇性吸物質(zhì)對不同波長的光具有選擇性吸收收而建立起來的分析方法。包括比色法、可而建立起來的分析方法。包括

24、比色法、可見光及紫外分光光度法、紅外光譜法等。見光及紫外分光光度法、紅外光譜法等。遠紫外遠紫外近紫外近紫外 可見光可見光近紅外近紅外中紅外中紅外遠紅外遠紅外（真空紫外）（真空紫外）10nm200nm200nm 380nm380nm 780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m 300 m光學(xué)光譜區(qū)光學(xué)光譜區(qū)可見光：可見光：人眼能感覺到的光（人眼能感覺到的光（380780nm）叫可見光。）叫可見光。白光是由紅橙黃綠青藍紫七種不同顏色的光按一定強白光是由紅橙黃綠青藍紫七種不同顏色的光按一定強度比例混合而成，稱為度比例混合而成，稱為復(fù)合光復(fù)合光，只有一種顏色的光即，只有一種顏色的光

25、即單一波長的光稱為單一波長的光稱為單色光單色光。2.1.1 物質(zhì)對光的選擇性吸收物質(zhì)對光的選擇性吸收 同一物質(zhì)對不同波長的光吸收能力不同；同一物質(zhì)對不同波長的光吸收能力不同；不同物質(zhì)對同一波長的光吸收能力不同。不同物質(zhì)對同一波長的光吸收能力不同。 蛋白質(zhì)最大吸收峰波長蛋白質(zhì)最大吸收峰波長為為280nm 核酸的最大吸收波長為核酸的最大吸收波長為260nm2.2 光吸收基本定律光吸收基本定律:Lambert-Beer定律定律A A 吸光度吸光度(absorbance)(absorbance)b b 溶液厚度溶液厚度(length/cm)(length/cm)c c 濃度濃度(concentrati

26、on)(concentration)k k 吸光系數(shù)吸光系數(shù)(absorptivity)(absorptivity)與物質(zhì)性質(zhì)、溫與物質(zhì)性質(zhì)、溫度、波長有關(guān)；度、波長有關(guān)； Lambert-Beer定律的物理學(xué)意義：定律的物理學(xué)意義：當(dāng)一束平行的單色光當(dāng)一束平行的單色光通過均勻透明的溶液時，該溶液對光的吸收程度與溶液通過均勻透明的溶液時，該溶液對光的吸收程度與溶液中物質(zhì)的濃度和光通過的液層厚度的乘積成正比中物質(zhì)的濃度和光通過的液層厚度的乘積成正比。A=kbc吸收光譜曲線特征：吸收光譜曲線特征：v物質(zhì)對光的吸收是選擇性吸收；不同物質(zhì)對物質(zhì)對光的吸收是選擇性吸收；不同物質(zhì)對光的吸收范圍、強弱不同；

27、光的吸收范圍、強弱不同；v吸收的波形與物質(zhì)性質(zhì)有關(guān)，與濃度無關(guān)；吸收的波形與物質(zhì)性質(zhì)有關(guān)，與濃度無關(guān)；vA值最大時的波長稱值最大時的波長稱max；在；在max時測量時測量A靈靈敏度最高。敏度最高。吸光系數(shù)吸光系數(shù)k k k的物理意義是：的物理意義是： 吸光物質(zhì)在單位濃度及單吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時的吸光度。在給定條件（單色光波長、位厚度時的吸光度。在給定條件（單色光波長、溶劑、溫度等）下，溶劑、溫度等）下，k k是物質(zhì)的特征性常數(shù)是物質(zhì)的特征性常數(shù)a的單位的單位: Lg-1cm-1當(dāng)當(dāng)c的單位用的單位用gL-1表示時，用表示時，用a表示，表示， Aabc 的單位的單位: Lmol-1cm

28、-1當(dāng)當(dāng)c的單位用的單位用molL-1表示時，用表示時，用 或或EM表示表示. 或或EM 摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)(Molar absorptivity) A bc 吸光系數(shù)吸光系數(shù)k1%1cmE1%1cmE1%1cmE當(dāng)當(dāng)c的單位用的單位用g(100mL)-1表示時，用表示時，用 表表示，示，A bc， 叫做比吸光系數(shù)或百分叫做比吸光系數(shù)或百分吸光系數(shù)吸光系數(shù)特定條件下，特定條件下， 或或E1%是物質(zhì)的是物質(zhì)的特征性常數(shù)。特征性常數(shù)。 2.3 Lambert-Beer定律的應(yīng)用定律的應(yīng)用2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 取標(biāo)準(zhǔn)品配成一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定取標(biāo)準(zhǔn)品配成一系列已知濃度的

29、標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定波長處波長處( (通常為通常為max) )，用同樣厚度的比色杯分別測定其吸，用同樣厚度的比色杯分別測定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)作圖，得光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到一通過坐標(biāo)原點的直線標(biāo)準(zhǔn)曲線（工作曲線）。到一通過坐標(biāo)原點的直線標(biāo)準(zhǔn)曲線（工作曲線）。繪制要求：繪制要求：v至少至少5個點；個點；v2個以上重復(fù)值；個以上重復(fù)值；v重復(fù)值誤差小于重復(fù)值誤差小于5%；v點與線的垂直距總和最??；點與線的垂直距總和最??；注：注：標(biāo)準(zhǔn)曲線不能任意延長！標(biāo)準(zhǔn)曲線不能任意延長！2.3.1.1 理想標(biāo)準(zhǔn)曲線的特點理想標(biāo)準(zhǔn)曲線的特點v過原點的直線過原點

30、的直線;v斜率為斜率為1；v濃度為待測物質(zhì)濃度的濃度為待測物質(zhì)濃度的一半二倍；一半二倍；vA550值在值在0.1 0.7之間之間C（mg/ml）A5502.3.1.2 偏離偏離Lambert Beer定律的原因定律的原因負(fù)偏離v依據(jù)依據(jù)Beer定律，定律，A與與C關(guān)系應(yīng)為經(jīng)過原點關(guān)系應(yīng)為經(jīng)過原點的直線的直線v偏離偏離Beer定律的主要定律的主要因素表現(xiàn)為以下兩個因素表現(xiàn)為以下兩個方面：方面：1. 光學(xué)因素光學(xué)因素2. 化學(xué)因素化學(xué)因素 負(fù)偏離負(fù)偏離2.3.1.3 光學(xué)因素光學(xué)因素v因儀器產(chǎn)生的因儀器產(chǎn)生的入射光單色性不純?nèi)肷涔鈫紊圆患?、雜散光、雜散光、單色器的內(nèi)反射，電壓不穩(wěn)、儀器的靈、單色

31、器的內(nèi)反射，電壓不穩(wěn)、儀器的靈敏度的波動等各種因素。敏度的波動等各種因素。2.3.1.4 溶液本身的溶液本身的化學(xué)因素化學(xué)因素引起的偏離引起的偏離(1)(1)濃度、濃度、pHpH值、溶劑和溫度等會對化學(xué)平衡產(chǎn)生影響，導(dǎo)致值、溶劑和溫度等會對化學(xué)平衡產(chǎn)生影響，導(dǎo)致溶液的組成或各組分間的比例發(fā)生變化；溶液的組成或各組分間的比例發(fā)生變化；(2)(2)溶液介質(zhì)不均一引起的溶液介質(zhì)不均一引起的 實驗中形成懸濁液、乳濁液等；實驗中形成懸濁液、乳濁液等； (3)(3)溶液的濃度溶液的濃度 被測物質(zhì)濃度過大時，吸光微粒間的平均距離減小，使被測物質(zhì)濃度過大時，吸光微粒間的平均距離減小，使相鄰微粒的電荷分布互相影

32、響，從而改變其對光的吸收能相鄰微粒的電荷分布互相影響，從而改變其對光的吸收能力。因此力。因此Lambert-BeerLambert-Beer定律一般適用于稀溶液的測定。定律一般適用于稀溶液的測定。 2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)管對照法標(biāo)準(zhǔn)管對照法 先配制一個與待測溶液濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液先配制一個與待測溶液濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液(其其濃度已知，用濃度已知，用c標(biāo)標(biāo)表示表示)，在，在max處測出其吸光度處測出其吸光度A標(biāo)標(biāo)，在相同條件下測出待測樣品溶液的吸光度，在相同條件下測出待測樣品溶液的吸光度A測測，則，則待測樣品溶液濃度待測樣品溶液濃度c測測可按下式求得：可按下式求得： c測測 (A測測/ A標(biāo)標(biāo))* c標(biāo)

33、標(biāo)2.3.3 利用消光系數(shù)求待測樣品濃度利用消光系數(shù)求待測樣品濃度 如果已知待測物質(zhì)的摩爾消光系數(shù)如果已知待測物質(zhì)的摩爾消光系數(shù)，則其濃度，則其濃度CA/ 例如：例如：如如已知蛋白質(zhì)溶液在已知蛋白質(zhì)溶液在280nm波長處的波長處的值，值，讀取待測蛋白質(zhì)溶液的讀取待測蛋白質(zhì)溶液的A280值，即可計算出待測蛋值，即可計算出待測蛋白質(zhì)溶液的濃度。詳見教材白質(zhì)溶液的濃度。詳見教材P6263。2.3.3 利用消光系數(shù)求待測樣品濃度利用消光系數(shù)求待測樣品濃度v例如：例如：雙鏈核酸的雙鏈核酸的值為值為0.02，單鏈核酸的，單鏈核酸的值值為為0.025。因此。因此v雙鏈核酸的濃度雙鏈核酸的濃度 CA260/=

34、 A260 50 （g/ml）v單鏈核酸的濃度單鏈核酸的濃度 CA260/= A260 40 （g/ml）2.4 吸光光度法的應(yīng)用吸光光度法的應(yīng)用v蛋白質(zhì)含量的測定蛋白質(zhì)含量的測定vLDH活性的測定活性的測定v堿性磷酸酶堿性磷酸酶Km值的測定值的測定vALT/GPT活性的測定活性的測定v血糖及血清膽固醇的測定血糖及血清膽固醇的測定三、酶活性的測定三、酶活性的測定3.1 酶活力酶活力(Enzyme Activity) 是指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力，也即酶催化某一化是指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力，也即酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度。學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度。3.2 酶反應(yīng)速度酶反應(yīng)速度 酶活力測定常采用測反應(yīng)初速度的

35、方法。底物濃酶活力測定常采用測反應(yīng)初速度的方法。底物濃度的變化在起始濃度的度的變化在起始濃度的5以內(nèi)的速度為初速度。以內(nèi)的速度為初速度。3.3 測定酶活力的方法測定酶活力的方法3.3.1 測定在最適宜條件下，測定在最適宜條件下，完成一定量反應(yīng)完成一定量反應(yīng)所需的所需的時間時間，即在一定條件下將全部底物轉(zhuǎn)，即在一定條件下將全部底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的時間?；癁楫a(chǎn)物所需的時間。3.3.2 測定在最適宜條件下，測定在最適宜條件下，單位時間內(nèi)單位時間內(nèi)底物底物的減少量的減少量或或產(chǎn)物的增加量產(chǎn)物的增加量。3.4 酶的活力單位酶的活力單位(U)及比活力及比活力3.4.1 酶的活力單位酶的活力單位(U): 酶活力單位，是指在特定條件下，單位時間內(nèi)能將一定酶活力單位，是指在特定條件下，單位時間內(nèi)能將一定量（常常以微摩爾（量（常常以微摩爾（molmol）為單位）為單位) )的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。需的酶量。3.4.2 酶的比活力酶的比活力 比活力的大小比活力的大小, , 即單位酶蛋白的活性，以即單位酶蛋白的活性，以