惡性腫瘤組織微衛(wèi)星不穩(wěn)定性研究

1、惡性腫瘤組織微衛(wèi)惡性腫瘤組織微衛(wèi)不穩(wěn)定性的研究不穩(wěn)定性的研究微衛(wèi)星微衛(wèi)星(microsatellite,MS),(microsatellite,MS),是指是指DNADNA基因組中小于基因組中小于1010個(gè)核苷酸的簡(jiǎn)單重復(fù)序列個(gè)核苷酸的簡(jiǎn)單重復(fù)序列, , 又稱短串聯(lián)重復(fù)又稱短串聯(lián)重復(fù)(short (short tandem repeat, STR)tandem repeat, STR)，是，是一種遍布于人類基因組的一種遍布于人類基因組的重復(fù)序列，一般為重復(fù)序列，一般為2 26 6個(gè)個(gè)堿基重復(fù)，如堿基重復(fù)，如(CA)n(CA)n、(GT)n(GT)n、(CAG)n(CAG)n等，尤以等，尤以(C

2、A)n(CA)n重復(fù)序列最為常見。重復(fù)序列最為常見。其長(zhǎng)度由重復(fù)單位的拷貝數(shù)其長(zhǎng)度由重復(fù)單位的拷貝數(shù)決定，是一類呈高度多態(tài)的決定，是一類呈高度多態(tài)的遺傳標(biāo)記，不僅可用于基因遺傳標(biāo)記，不僅可用于基因組遺傳連鎖圖的構(gòu)建以及基組遺傳連鎖圖的構(gòu)建以及基因的定位與克隆，而且可用因的定位與克隆，而且可用于遺傳性疾病的連鎖分析和于遺傳性疾病的連鎖分析和基因診斷?；蛟\斷。遺傳物質(zhì)的突變是導(dǎo)致人類許多疾病(包括腫瘤)的主要原因,而引起遺傳物質(zhì)突變的直接誘因是不同類型的DNA損傷。其中多種原因造成的DNA雙鏈分子的堿基錯(cuò)配是導(dǎo)致突變的主要DNA損傷類型之一。大量研究表明,從細(xì)菌、酵母到人體細(xì)胞都存在一種能修復(fù)D

3、NA堿基錯(cuò)配的安全保障體系, 這種保障體系是由一系列特異性修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配的酶分子組成,被稱為DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(DNA mismatch repair system,MMR)。人體細(xì)胞中由于MMR系統(tǒng)的存在,可保持遺傳物質(zhì)的完整性和穩(wěn)定性,避免遺傳物質(zhì)突變的產(chǎn)生,保證DNA復(fù)制的高保真度。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)是指由于復(fù)制錯(cuò)誤(replication error, RER)引起的簡(jiǎn)單重復(fù)序列的增加或丟失,也稱RER陽性或RER表型。1993年，Altonen等首次發(fā)現(xiàn)，在HNPCC細(xì)胞中存在高頻率的MSI后，又有很多學(xué)者在多種腫瘤中發(fā)

4、現(xiàn)MSI。MSI作為腫瘤遺傳不穩(wěn)定一個(gè)敏感的檢測(cè)指標(biāo)已逐漸被大家接受。在以后的研究中，相繼在肺在以后的研究中，相繼在肺癌，胃癌，白血病等其它腫癌，胃癌，白血病等其它腫瘤也發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。瘤也發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。Li Li等報(bào)道一組等報(bào)道一組100100例包括頭頸部例包括頭頸部腫瘤，膀胱腫瘤及肺癌病例，腫瘤，膀胱腫瘤及肺癌病例，用用9 9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)標(biāo)記物篩選，個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)標(biāo)記物篩選，發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)3 3個(gè)及個(gè)及4 4個(gè)核苷酸重復(fù)序個(gè)核苷酸重復(fù)序列更易出現(xiàn)插入或缺失，列更易出現(xiàn)插入或缺失，2626例出現(xiàn)至少一個(gè)位點(diǎn)的改變。例出現(xiàn)至少一個(gè)位點(diǎn)的改變。 顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性改變可作為腫瘤細(xì)胞的克隆標(biāo)志，

5、運(yùn)用于腫瘤的檢測(cè)。腫瘤常在抑癌基因位點(diǎn)出現(xiàn)染色體基因缺失，表現(xiàn)為等位基因雜合性丟失(Loss of heterozygosity),通過檢測(cè)分析腫瘤雜合性丟失及其規(guī)律，可在染色體一定范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)腫瘤的抑癌基因及易感基因。目前已發(fā)現(xiàn)RER+腫瘤主要有3類：一類為散發(fā)性結(jié)直腸癌,這一類腫瘤細(xì)胞核型為近二倍體,病人預(yù)后較好；另一類為HNPCC病人發(fā)生的結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌以及卵巢癌,這一類腫瘤幾乎都表現(xiàn)為MSI,與散發(fā)性結(jié)直腸癌比較,發(fā)病年齡較早；第三類為包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在內(nèi)的其它腫瘤,這一類腫瘤MSI發(fā)生頻率相對(duì)較低。 近年來研究證實(shí)RER+是HNPCC、肺癌、乳腺癌、食管癌、膀胱癌的早期分

6、子標(biāo)志,也是慢性髓細(xì)胞性白血病的晚期分子標(biāo)志,對(duì)腎母細(xì)胞瘤來說,不僅是晚期分子標(biāo)志并與其惡性程度有關(guān),對(duì)胃癌來說,不僅是其早期事件,而且與癌的惡性轉(zhuǎn)移有一定聯(lián)系。并發(fā)現(xiàn)MSI存在于病理證實(shí)為陰性的腫瘤旁切緣組織。目前已經(jīng)知道,RER+大腸癌有以下特性；(1)發(fā)病年齡早,35歲以下大腸癌患者RER陽性比例最高；(2)多位于右半結(jié)腸,易發(fā)生腸內(nèi)或腸外其它器官的多發(fā)性腫瘤,多發(fā)性腫瘤RER陽性率(80%)明顯高于單發(fā)性腫瘤(11%), 術(shù)后易再發(fā)其它原發(fā)惡性腫瘤；(3)DNA多為二倍體或近二倍體；(4)對(duì)某些化療藥物(如順鉑)有原發(fā)耐藥性；(5)具有高突變特性,許多癌基因及抑癌基因(如RAS,p53

7、,APC等)突變數(shù)目明顯增多； (6)粘液腺癌多見,組織分化差,多浸潤(rùn)生長(zhǎng),腫塊較大,但較少發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,預(yù)后較好,而RER-的大腸癌多發(fā)生在左半結(jié)腸,多為多倍體。晚期胃癌、遠(yuǎn)端胃癌多為RER+,RER+表型在腸型和實(shí)體瘤中的頻率顯著高于印戒細(xì)胞癌；近端胃癌早期多為RER-。 這說明與RER+癌發(fā)病機(jī)制不同。因此,檢測(cè)不同腫瘤的MSI,對(duì)深入認(rèn)識(shí)腫瘤病的基因變化是十分有幫助的。目前,需大力開展對(duì)人體多種腫瘤MSI的檢測(cè),了解各種腫瘤與MMR基因突變的關(guān)系,弄清腫瘤中MMR基因的突變類型及作用方式,建立更為簡(jiǎn)便的基因突變的檢查技術(shù)并應(yīng)用了臨床。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的研究方法，目前主要以PCR技術(shù)為基

8、礎(chǔ)研究微衛(wèi)星不穩(wěn)定性改變，步驟為：(1)首先需確定特定染色體上特定微衛(wèi)星位點(diǎn)標(biāo)記，并根據(jù)其序列合成特異性引物。引物序列一般可根據(jù)特定位點(diǎn)直接從基因庫中查詢。（2）收集腫瘤組織及相應(yīng)正常組織標(biāo)本，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，提取基因組DNA。 （3）PCR擴(kuò)增。（4）擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。常用凝膠電泳，溴化乙錠染色后在紫外燈下觀察，或放射自顯影及銀染等方法觀察。（5）判斷結(jié)果。若腫瘤組織較正常對(duì)照組織出現(xiàn)某一基因條帶消失或密度減少50以上，可判斷為雜和性丟失；若腫瘤組織出現(xiàn)基因條帶的增多，即判斷為不穩(wěn)定性改變。存在的問題：通過對(duì)人體多種腫瘤MSI的檢測(cè),目前已初步對(duì)體細(xì)胞中MMR系統(tǒng)的功能以及MMR缺陷與

9、腫瘤發(fā)生的相應(yīng)關(guān)系有所認(rèn)識(shí),但此僅僅是深入研究的開始而已,因?yàn)?1)人類MMR基因不僅具有識(shí)別和修復(fù)DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)的DNA錯(cuò)配的功能,有實(shí)驗(yàn)報(bào)道, 該組基因還以某種方式參與細(xì)胞對(duì)增殖的調(diào)控,其確切機(jī)理及調(diào)節(jié)方式有待進(jìn)一步研究。(2)大腸桿菌MutHLS系統(tǒng)中的MMR基因僅占大腸桿菌基因組中突變控制位點(diǎn)(murator loci)的一半。除MMR基因外,其余占半數(shù)的突變控制位點(diǎn)的基因組成了大腸桿菌細(xì)胞中的對(duì)突變產(chǎn)生具有明顯抑制作用的體系。 由于細(xì)菌與人體細(xì)胞在由于細(xì)菌與人體細(xì)胞在MMRMMR系系統(tǒng)上表現(xiàn)出極大的相似性統(tǒng)上表現(xiàn)出極大的相似性, ,因而因而推測(cè)人體細(xì)胞除推測(cè)人體細(xì)胞除MMRMMR系統(tǒng)外系統(tǒng)外, ,也也應(yīng)含有類似于大腸桿菌的其它應(yīng)含有類似于大腸桿菌的其它突變抑制系統(tǒng)突變抑制系統(tǒng), ,該突變抑制系統(tǒng)該突變抑制系統(tǒng)也應(yīng)該在維持人基因組穩(wěn)定性也應(yīng)該在維持人基因組穩(wěn)定性上發(fā)揮重要作用上發(fā)揮重要作用, ,其功能失活也其功能失活也參與了腫瘤的形成。目前參與了腫瘤的形成。目前, ,對(duì)人對(duì)人體細(xì)胞中可能存在的此系統(tǒng)還體細(xì)胞中可能存在的