手把手教你做PCR引物的設(shè)計(jì)來自小木蟲

1、PC咫I物設(shè)計(jì)的黃金法則1,引物最好在模板cDNA勺保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。DN年列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件(比如DNAman比對(Alignment),各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。2,引物長度一般在1530堿基之間。引物長度(primerlength)常用的是18-27bp,但不應(yīng)大于38,因?yàn)檫^長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74C,不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。3,引物GC含量在40%60噥間，Tm值最好接近72C。GC含量(composition)過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC量不能相差太大。另外，上下游引物的

2、Tm值(meltingtemperature)是寡核甘酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核甘酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值510C。若按公式Tm=4(G+C+2(A+T»估計(jì)引物的Tma,則有效引物的Tm為5580C,其TM直最好接近72c以使復(fù)性條件最佳。4,引物3'端要避開密碼子的第3位。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增的特異性與效率。5 .引物3'端不能選擇A,最好選擇To引物3'端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，

3、也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，GC錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3'端最好選擇To6 .堿基要隨機(jī)分布。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3'端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)(Falsepriming)。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚喋吟或聚喀咤的存在。尤其3'端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在GCB集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。7 .引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空

4、間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3'端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體(Dimer與Crossdimer)的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。8,引物5'端和中間G值應(yīng)該相對較高，而3'端4G值較低。G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5'端和中間4G

5、值相對較高，而3'端4G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3'端的G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（不同位置的G值可以用Oligo6軟件進(jìn)行分析）9 .引物的5'端可以修飾，而3'端不可修飾。引物的5'端決定著PCFT物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3將；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNAff列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。引物的延伸是從3'端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3'端也不能有形成任何

6、二級結(jié)構(gòu)可能。10 .擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。某些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預(yù)測估計(jì)mRNA勺穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（G。）小于58.61kJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2'-脫氧GTPM弋dGTP寸擴(kuò)增的成功是有幫助的。11 .引物應(yīng)具有特異性。引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對其進(jìn)行BLAST僉測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。POSTbyBingsenXu前言：我是剛剛注冊到丁香園，在

7、PCRK術(shù)討論版看見置頂貼，“請求助引物設(shè)計(jì)的戰(zhàn)友先進(jìn)來這里！”稍微瀏覽了一下，發(fā)現(xiàn)很多朋友對PC咫I物設(shè)計(jì)還不是很熟悉，我愿意把自己積累的一點(diǎn)引物設(shè)計(jì)方面的經(jīng)驗(yàn)和大家分享，希望不會做引物設(shè)計(jì)的朋友看完之后，可以不用再發(fā)求助貼而是自己動(dòng)手做引物設(shè)計(jì)或者引物檢驗(yàn)。開始之前：其實(shí)非常簡單，不需要你下載任何軟件，但是你得有一臺電腦能上網(wǎng)。當(dāng)然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本貼的討論范圍。另外，要先對PCR目的序列的長度有個(gè)大致估計(jì)，好了，馬上開始吧：第一步：找到Primer3的站點(diǎn)。你不用記住這個(gè)站點(diǎn)，但是要記住“Primer3”這個(gè)詞，然后打開GOOGLE頁

8、，輸入Primer3,跳出來的第一個(gè)項(xiàng)目就是了“Primer3Input0.4.0（primer3-web/htdocs/input-040.htm）”網(wǎng)址是/。第二步：貼上模板序列。進(jìn)入Primer3站點(diǎn)，可以看到一個(gè)引物設(shè)計(jì)的界面。（附件Word文檔里有圖）在“Pastesourcesequencebelow（5'->3'-一.”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖進(jìn)去。注意是5'->3'方向的，數(shù)字或者空格都沒關(guān)系，軟件會自動(dòng)過濾的。第三步：重要參數(shù)設(shè)定。首先是“ProductSizeRanges”，如

9、果你不希望軟件給你隨便做的話，首先要調(diào)整的就是這個(gè)參數(shù)。默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從100至卜000,這個(gè)你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預(yù)期，盡可能把范圍改小，比如480-500,具體看情況調(diào)整。第二個(gè)參數(shù)是“PrimerSize”，默認(rèn)值一般可以用，但是，當(dāng)你用熟了這個(gè)軟件，你自己就知道該怎么改了。第三個(gè)參數(shù)是"PrimerTm”這個(gè)和PrimerSize差不多。第四步：Pickprimers:點(diǎn)一下這個(gè)按鈕，符合你大小預(yù)期的primer就出來了，看看Primer3Output的界面，多么漂亮！你要的primer出來了，而且有primer在序列上的位置比對圖，還有primer本身

10、的信息，包括位置，長度，TmG饒量，任何位置互補(bǔ)堿基數(shù)，3'端互補(bǔ)堿基數(shù)，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'）,還有產(chǎn)物大小，兩引物間任意互補(bǔ)堿基數(shù)，兩引物間3'端互補(bǔ)堿基數(shù)等。如果引物尚在參數(shù)設(shè)定的范圍內(nèi)，但還不是最佳，將會給出警告。比如（隨便舉例，本人在做一個(gè)超長引物）：WARNING:Leftprimerisunacceptable:High3'stabilityOLIGOstartlentmgc%any3'seqLEFTPRIMER13369.0245.456.001.00TAATACGACTCACTATAGGGGTGAA

11、AGACTGCCRIGHTPRIMER13883467.8629.416.002.00AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCESIZE:1388INCLUDEDREGIONSIZE:1388PRODUCTSIZE:1388,PAIRANYCOMPL:5.00,PAIR3'COMPL:3.00第五步：引物設(shè)計(jì)檢驗(yàn)：可以僅僅設(shè)計(jì)一向引物，只要在Pickleftprimer或者Pickrightprimer前面的勾勾掉一個(gè)就可以。也可以自己定義引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的書寫反向仍然是5'->3'）如果符合設(shè)

12、定的條件，軟件將對給出引物評分，同時(shí)給出警告信息，根據(jù)警告信息可以適當(dāng)對自定義引物做些調(diào)整即可，警告信息也讓你做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候心中有數(shù)。對于文獻(xiàn)發(fā)表的引物，最好都要檢查一下，這樣就可以避免被別人有意無意誤導(dǎo)。至于RT-PCRf用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛在DNA寸RT-PCR的干擾。實(shí)際做引物的時(shí)候，要把內(nèi)含子都去掉，僅僅把外顯子序列放入源序列框中，并且通過自定義引物設(shè)計(jì)的方法，使上下游引物分別全部或者部分落在不同外顯子上。至于如何快速識別內(nèi)含子和外顯子以及電子PCR我將抽空另做說明。至于設(shè)計(jì)出來的引物的實(shí)際效果，根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，一般情況下都能做到PCFH次成功，也許隨便那一段序列

13、做引物也能達(dá)到很好的效果，但是不管怎么說，軟件做引物可以讓自己心中有數(shù)。最后，GOODUCKTOEVERYONE.手把手教你在線做PCR引物設(shè)計(jì)POSTbyBingsenXu前言：我是剛剛注冊到丁香園，在PC敬術(shù)討論版看見置頂貼，“請求助引物設(shè)計(jì)的戰(zhàn)友先進(jìn)來這里！”稍微瀏覽了一下，發(fā)現(xiàn)很多朋友對PC咫I物設(shè)計(jì)還不是很熟悉，我愿意把自己積累的一點(diǎn)引物設(shè)計(jì)方面的經(jīng)驗(yàn)和大家分享，希望不會做引物設(shè)計(jì)的朋友看完之后，可以不用再發(fā)求助貼而是自己動(dòng)手做引物設(shè)計(jì)或者引物檢驗(yàn)。開始之前：其實(shí)非常簡單，不需要你下載任何軟件，但是你得有一臺電腦能上網(wǎng)。當(dāng)然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板

14、序列，不再本貼的討論范圍。另外，要先對PCRS的序列的長度有個(gè)大致估計(jì)，好了，馬上開始吧：第一步：找到Primer3的站點(diǎn)。你不用記住這個(gè)站點(diǎn)，但是要記住“Primer3”這個(gè)詞，然后打開GOOGL苜頁，輸入Primer3,跳出來的第一個(gè)項(xiàng)目就是了“Primer3Input0.4.0(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”網(wǎng)址是http:/。第二步：貼上模板序列。進(jìn)入Primer3站點(diǎn)，可以看到一個(gè)引物設(shè)計(jì)的界面。（附件Word文檔里有圖）在“Pastesourcesequencebelow（5'->3'-i.

15、”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖進(jìn)去。注意是5'->3'方向的，數(shù)字或者空格都沒關(guān)系，軟件會自動(dòng)過濾的。第三步：重要參數(shù)設(shè)定。首先是“ProductSizeRanged',如果你不希望軟件給你隨便做的話，首先要調(diào)整的就是這個(gè)參數(shù)。默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從100到1000,這個(gè)你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預(yù)期，盡可能把范圍改小，比如480-500,具體看情況調(diào)整。第二個(gè)參數(shù)是“PrimerSize”,默認(rèn)值一般可以用，但是，當(dāng)你用熟了這個(gè)軟件，你自己就知道該怎么改了。第三個(gè)參數(shù)是"PrimerTm”這個(gè)和PrimerSize差不多。第四步：Pi

16、ckprimers:點(diǎn)一下這個(gè)按鈕，符合你大小預(yù)期的primer就出來了，看看Primer3Output的界面，多么漂亮！你要的primer出來了，而且有primer在序列上的位置比對圖，還要primer本身的信息，包括位置，長度，TmGC含量，任何位置互補(bǔ)堿基數(shù)，3'端互補(bǔ)堿基數(shù)，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'）,還要產(chǎn)物大小，兩引物間任意互補(bǔ)堿基數(shù)，兩引物間3'端互補(bǔ)堿基數(shù)等。如果引物尚在參數(shù)設(shè)定的范圍內(nèi)，但還不是最佳，將會給出警告。比如（隨便舉例，本人在做一個(gè)超長引物）：WARNING:Leftprimerisunacceptable:

17、High3'stabilityOLIGOstartlentmgc%any3'seqLEFTPRIMER13369.0245.456.001.00TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHTPRIMER13883467.8629.416.002.00AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCESIZE:1388INCLUDEDREGIONSIZE:1388PRODUCTSIZE:1388,PAIRANYCOMPL:5.00,PAIR3'COMPL:3.00第五步：引物設(shè)計(jì)檢驗(yàn)：可以僅僅設(shè)計(jì)一向引物，只

18、要在Pickleftprimer或者Pickrightprimer前面的勾勾掉一個(gè)就可以。也可以自己定義引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的書寫反向仍然是5'->3'）如果符合設(shè)定的條件，軟件將對給出引物評分，同時(shí)給出警告信息，根據(jù)警告信息可以適當(dāng)對自定義引物做些調(diào)整即可，警告信息也讓你做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候心中有數(shù)。對于文獻(xiàn)發(fā)表的引物，最好都要檢查一下，這樣就可以避免被別人有意無意誤導(dǎo)。至于RT-PCRf用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛在DNA寸RT-PCR勺干擾。實(shí)際做引物的時(shí)候，要把內(nèi)含子都去掉，僅僅把外顯子序列放入源序列框中，并且通過自定義引物設(shè)計(jì)的

19、方法，使上下游引物分別全部或者部分落在不同外顯子上。至于如何快速識別內(nèi)含子和外顯子以及電子PCR我將抽空另做說明。至于設(shè)計(jì)出來的引物的實(shí)際效果，根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，一般情況下都能做到PCR-次成功，也許隨便那一段序列做引物也能達(dá)到很好的效果，但是不管怎么說，軟件做引物可以讓自己心中有數(shù)。最后，GOODLUCKTOEVERYONE.Primri3InpulD.4.Qai*ili/hlidaminpiJl-l4O.hlml-UirrtiK4rInTmrF-ipInrarPrimerS(7.0.40)FickpnmenfromaDNAkspiHucEPngy凸口匕LfKrTa*24耳七rrunh/匕立卜二

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