實時定量PCR課件

1、1實時定量PCRReal-Time Quantitative PCR梁沛中國農(nóng)業(yè)大學昆蟲學系2主要內(nèi)容n基本原理n幾個概念n絕對定量n相對定量n常見問題3一、基本原理4發(fā)展簡史1993年，日本Higuchi 等人首次采用動態(tài)PCR方法和封閉式檢測方式對目的核酸數(shù)量進行定量分析，首次提出了熒光定量PCR技術(shù)的概念。熒光染料：EB（溴乙錠）PCR儀：改良的熱循環(huán)儀激發(fā)光：UV射線檢測器：CCD相機缺點：儀器耗費巨大；非特異產(chǎn)物導致定量不準確5發(fā)展簡史n1995年美國PE公司成功開發(fā)TaqMan技術(shù)n1996年推出了首臺熒光定量PCR檢測系統(tǒng)操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復性好、污染率低等6實時定

2、量PCR的概念n實時定量PCR技術(shù)（real-time quantitative PCR）是指在PCR反應體系中加入，通過監(jiān)測熒光信號的累積實時監(jiān)測整個PCR進程，并利用特定數(shù)學原理對未知模板進行定量分析的方法。789兩種熒光標記法n染料染色-SYBR Green I-EBn探針標記-Tagman-Tagman MGB-分子信標10SYBR Green I 的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm11化學原理12染料法的優(yōu)缺點：n實驗設(shè)計簡單，僅需要設(shè)計上下游一對引物，不需要設(shè)計探針，通用性好；n成本低；n可通過分析檢驗擴增產(chǎn)物的特異性。n在低通量實驗和單重實驗時一般優(yōu)先考慮使

3、用SYBR Green I染料法。 13染料法的優(yōu)缺點nSYBR Green I方法對PCR擴增特異性要求較高SYBR Green I 可與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性nSYBR Green I 不能區(qū)分不同擴增子發(fā)出的熒光而導致它不能用于多重反應 1415Tagman ProbeQuencherReporter16Tagman probe 的工作原理17探針與PCR產(chǎn)物的數(shù)量關(guān)系n每產(chǎn)生一個新的DNA片段，就切斷一條探針n每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個單位的熒光信號n信號強度與DNA的copy數(shù)成正比18探針法的優(yōu)缺點

4、nTagman探針法中，除引物外，還使用了一條特異的探針，因此此方法可以特異的檢測目標序列，防止非特異產(chǎn)物的干擾影響定量的準確性n可用于多重反應，即可同時檢測多個目的基因。n但探針設(shè)計成本較高，有時探針設(shè)計困難。 19二、幾個概念201.擴增曲線n描述PCR動態(tài)進程的曲線即擴增曲線。nPCR的擴增曲線實際上并不是一條標準的指數(shù)曲線，而是呈S型曲線（圖3） CyclesFluoresces211.擴增曲線n擴增曲線分三個階段：擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起

5、始DNA拷貝數(shù)。，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可選擇該階段進行定量分析。 222.熒光閾值n一般把熒光PCR的前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline，基線期），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋。n是人為設(shè)定的一個值，可設(shè)在指數(shù)擴增階段任意位置上。n缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍（自動）。232.熒光閾值n常采用手動設(shè)置，原則：大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，真正的信號是超過域值的熒光信號。243.Ct值nCycle threshold，所謂Ct值就是當擴

6、增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。線性圖譜半對數(shù)圖譜25Ct值的重現(xiàn)性263.Ct值nCt值與模版的拷貝數(shù)存在著線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，達到閾值所需的循環(huán)數(shù)就越少，Ct值也就越小，反之亦然。n正常的Ct值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。 2728Ct值定量的數(shù)學原理29Ct值定量的數(shù)學原理30Ct值定量的數(shù)學原理31Ct值定量的數(shù)學原理0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleRnThreshold10410310232靶標基因的定量33靶標基因的定量500010000

7、1234靶標基因的定量CYP6B6Actin35三、絕對定量36三、絕對定量37三、絕對定量38三、絕對定量1.化學合成目的基因，是純度高、定量準確，是受化學合成工藝限制，只能合成120bp以下的長度；2.用回收純化后的PCR產(chǎn)物3.將PCR產(chǎn)物克隆到載體上，然后抽提出質(zhì)粒，經(jīng)過測量濃度和拷貝數(shù)的換算，可準確定量，是穩(wěn)定、準確。39三、絕對定量40三、絕對定量(ss DNA, 660 for ds DNA)41三、絕對定量n3000 堿基質(zhì)粒，濃度100 ng/ul nMW= 3000 bp x 660 dalton/bp =1.98 x 106 daltons，即1 mol =1.98 x

8、106 g。ncopy數(shù) - 3x 1010 copies/ul100ng1.98 x 10642絕對定量舉例Copies/ul Ct 1Ct 2Meant CtSTD510328.1828.6428.410.16510425.2525.1425.190.04510522.1122.4622.280.12510618.6318.9218.770.10Blank43絕對定量舉例擴增效率（擴增效率（E）計算）計算E=10-1/斜率斜率 =10-1/-3.18 =2.06E%=(2.06-1) 100%=106%44絕對定量舉例n如未知樣本Ct為20.5，將Ct值帶入線性方程：n20.5= -3.1

9、83 X + 40.211nX=（20.5-40.211）/-3.183 =6.19n未知樣本拷貝數(shù)=106.19=1548816 copies/ul45四、相對定量n無需知道目的基因的絕對拷貝數(shù) 1. 模板均一性問題模板均一性問題：起始的細胞數(shù)、細胞的狀態(tài)、均一性等 2. RNA制備制備：RNA純化得率、均一性等 3. 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄：反轉(zhuǎn)錄的效率等46內(nèi)標/內(nèi)參照n因因RNA純化后得率不同、純化后得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同。不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同。因此，在進行基因表達調(diào)控研究中都會用一些看家基因此

10、，在進行基因表達調(diào)控研究中都會用一些看家基因（因（house-keeping gene）來標準化，以校正因樣）來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。品初始濃度不同而造成的差異。n常用的看家基因有：常用的看家基因有：GAPDH、Beta-actin、18S rRNA等等47相對定量的方法n雙標準曲線法雙標準曲線法nCt法法48雙標準曲線法n優(yōu)點：優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化簡單。n缺點：缺點：對每一個基因每一個基因，每一輪實驗每一輪實驗都必需做標準曲線；必需有固定的標準品做標準曲線；這些標準品并不代表樣品擴增的真實狀態(tài)比如標準品為質(zhì)?；蚣兓腜CR產(chǎn)物，而待測樣品為cDNA，那么標準曲線的

11、擴增效率并不能真實地反映樣品的擴增情況。n應用應用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一。處理組處理組目的目的基因濃度基因濃度處理組處理組參照參照基因濃度基因濃度對照組對照組目的目的基因濃度基因濃度對照組對照組參照參照基因濃度基因濃度相對表達量相對表達量49Ct法法nCt，即，即Ct的變化值的變化值n假定目的基因和參照基因的擴增效率相同，均為假定目的基因和參照基因的擴增效率相同，均為100%2- （Ct1- Ct2）50Ct法法舉例舉例Cyp6B6 ave Ct18S RNA ave Ct標準化的Cyp6B6 Ct校正Ct對照組對照組24.512.611.90處理組處理組22.

12、812.310.5-1.451Ct法法n優(yōu)點：優(yōu)點：優(yōu)化的體系建立后，每次實驗中無需再對看家基因和目的基因做標準曲線，而只需對待測樣品分別進行PCR擴增即可。n要求：要求：標準曲線斜率差值E=1，2.3 倍差別E=0.9，2.2倍差別E=0.5，1.6倍差別53Pfaffl法M.W. Pfaffl, Nucleic Acids Research 2001, 29(9):e45n目標基因和參照基因擴增效率不同，但目標基因間的擴增效率相同。需計算目標基因和參照基因擴增效率。 E=10-1/斜率斜率54SYBR法常見問題及注意事項n實驗流程樣品準備RT建立反應體系上機數(shù)據(jù)分析55樣品準備RNAn提取

13、RNA所用不同處理組的蟲量一致，且具有代表性n所有操作盡可能一致n保證無RNase的環(huán)境n利用分光光度法確定所提核酸的質(zhì)量和濃度：純度：OD260/OD280=1.8 2.020 uL的反應體系最多可以將0.4 ug 總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；1 100 ng RNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA加1uL/rxn56樣品準備DNAnDNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之間nDNA用量：0.05 ng 100 ng樣品準備的惟一目標：57Reverse Transcription1、根據(jù)下游反應數(shù)確定、根據(jù)下游反應數(shù)確定RT反應體積反應體積2、試劑應統(tǒng)一，尤其是反轉(zhuǎn)錄酶、試劑應統(tǒng)一，尤

14、其是反轉(zhuǎn)錄酶3、引物：、引物：Oligo dT、隨機引物、隨機引物4、RNA到到cDNA的轉(zhuǎn)換效率一般的轉(zhuǎn)換效率一般70%高效、全長的高效、全長的cDNA58建立反應體系n做普通PCR、跑核酸電泳的槍嚴禁用于定量PCR！n加buffer、引物和水在獨立房間n加模板在另一房間n加模板和其它反應物的移液槍要嚴格區(qū)分，不能混用！n增大模板的加樣量，以減少孔間誤差。n使用mix以減少系統(tǒng)誤差；每個樣品至少3個重復59樣品設(shè)置6061626364引物設(shè)計及評價引物設(shè)計的基本原則： 1) 避免重復堿基，尤其是G. 2) 引物的退火溫度要高，一般要在60度以上3）GC=30-80%. 4) 3端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C. 5) 正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。 6) PCR擴增產(chǎn)物長度： 不要太大，一般在80-250bp之間都可；80150 bp最為合適（可以延長至300 bp）.65引物設(shè)計及評價n做溶解曲線Dissociation curve66引物設(shè)計及評價67SYBR法常見問題及注意事項特異性擴增產(chǎn)物特異性擴增產(chǎn)物非特異性擴增產(chǎn)物非特異性擴增產(chǎn)物引物二聚體引物二聚體68探針設(shè)計原則n探針位置盡可能地靠近上游引物，擴增片段長度在50150bp范圍內(nèi)； n探針長度通常在2030bp，Tm值在6570，通常比引物Tm高510