第二章 固定化酶(1~3節(jié))

1、Enzyme Engineering酶工程第三章第三章 固定化酶固定化酶n第一節(jié)第一節(jié) 概述概述n第二節(jié)第二節(jié) 固定化酶的性質(zhì)及其影響因素固定化酶的性質(zhì)及其影響因素n第三節(jié)第三節(jié) 固定化酶的制備固定化酶的制備n第四節(jié)第四節(jié) 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞n第五節(jié)第五節(jié) 固定化輔酶和原生質(zhì)體固定化輔酶和原生質(zhì)體n第六節(jié)第六節(jié) 酶反應(yīng)器和固定化酶（細(xì)胞）酶反應(yīng)器和固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用的應(yīng)用生物催化劑細(xì)胞酶非生長(zhǎng)生長(zhǎng)可溶固定化懸浮固定化連續(xù)間歇吸附包埋交聯(lián)化學(xué)連續(xù)材料膜固定酶液凝膠吸附化學(xué)連接物固定化再循環(huán)系統(tǒng)凝膠吸附連續(xù)半連續(xù)分批間歇 連續(xù)活塞模式攪拌連續(xù)反應(yīng)器間歇連續(xù)活塞模式攪拌連續(xù)反應(yīng)器第一節(jié)第一節(jié)

2、概述概述圖6-1 生物催化劑作用方式示意固定化酶的發(fā)展史什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技術(shù)固定化技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 概述概述二 固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)n 多次使用 n 可以裝塔連續(xù)反應(yīng)n優(yōu)點(diǎn)： 純化簡(jiǎn)單n 提高產(chǎn)物質(zhì)量n 應(yīng)用范圍廣n缺點(diǎn)： 首次投入成本高n 大分子底物較困難第一節(jié)結(jié)束第一節(jié)結(jié)束n點(diǎn)擊返回第二節(jié)第二節(jié) 固定化酶的性質(zhì)及其影響因素固定化酶的性質(zhì)及其影響因素n一 影響固定化酶性質(zhì)的因素n二 固定化后酶性質(zhì)的變化n三 評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)一一 影響固定化酶性質(zhì)的因素影響固定化酶性質(zhì)的因素1 酶本身的變化，主要是由于活性

3、中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。一一 影響固定化酶性質(zhì)的因素影響固定化酶性質(zhì)的因素2 載體的影響n（1） 分配效應(yīng)n（2） 空間障礙效應(yīng)n（3） 擴(kuò)散限制效應(yīng)3. 固定化方法的影響二二固定化后酶性質(zhì)的變化固定化后酶性質(zhì)的變化n1 固定化對(duì)酶活性的影響：酶活性下降，反應(yīng)速度下降n原因：酶結(jié)構(gòu)的變化n 空間位阻二二 固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)2 固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響n（1） 操作穩(wěn)定性提高n（2） 貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。n (3 ) 對(duì)熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。n (4 ) 對(duì)分解酶的穩(wěn)定性提高。n（5） 對(duì)變性劑的耐受力升高2 固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：

4、固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：na. 固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接。nb. 酶活力的釋放是緩慢的。nc. 抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。3 pH的變化的變化nPH對(duì)酶活性的影響：n（1） 改變酶的空間構(gòu)象n（2）影響酶的催化基團(tuán)的解離n（3）影響酶的結(jié)合基團(tuán)的解離n（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。pH對(duì)固定化酶的影響對(duì)固定化酶的影響n1） 載體帶負(fù)電荷，pH向堿性方向移動(dòng)。 n微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱(chēng)為宏觀環(huán)境。3 pH的變化的變化n載體帶正電荷，pH向酸性方向移動(dòng)。n（2）產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)體系pH的影響n催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的pH值

5、比游離酶的pH值高；反之則低4 最適溫度變化最適溫度變化n一般與游離酶差不多，但有些會(huì)有較明顯的變化。n5 底物特異性變化n作用于低分子底物的酶 特異性沒(méi)有明顯變化n既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特異性往往會(huì)變化。6 米氏常數(shù)米氏常數(shù)Km的變化，的變化，Km值隨載體值隨載體性質(zhì)變化性質(zhì)變化n（1） 載體與底物帶相同電荷，KmKm固定化酶降低了酶的親和力。n（2） 載體與底物電荷相反，靜電作用，KmKm三三 評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：n1 酶活定義（IU)：在特定條件下，每一分鐘催化一個(gè)微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個(gè)酶活單位。n1Kat=1mol/s=60mo

6、l/min=60*106umol/minn =6*106IUn2. 酶比活定義（游離）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力單位 三三 評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：n1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位。n 或：?jiǎn)挝幻娣e（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。n2. 操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。 連續(xù)測(cè)活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時(shí)間（t1/2）三三 評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：n3. n4. n或稱(chēng)偶聯(lián)效率，活力保留百分?jǐn)?shù)。n5.相對(duì)酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱(chēng)為相對(duì)

7、酶活力n 四四 固定化酶的活力測(cè)定方法介紹固定化酶的活力測(cè)定方法介紹n1. 振蕩測(cè)定法：n2. 酶柱測(cè)定法：四四 固定化酶的活力測(cè)定方法介紹固定化酶的活力測(cè)定方法介紹n3. 連續(xù)測(cè)定法n利用連續(xù)分光光度法等測(cè)定方法可以對(duì)固定化酶反應(yīng)液進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，從而測(cè)定固定化酶的酶活力。n 第二節(jié)第二節(jié)固定化酶的性質(zhì)及其影響因素提要固定化酶的性質(zhì)及其影響因素提要n影響固定化酶性質(zhì)的因素n固定化酶的性質(zhì)n評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo) 酶本身的變化載體的影響固定化對(duì)酶活性的影響固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響最適pH的變化最適溫度變化底物特異性與游離酶不同米氏常數(shù)Km的變化評(píng)價(jià)指標(biāo)活力測(cè)定方法第二節(jié)結(jié)束第二節(jié)結(jié)束n點(diǎn)擊返回第三節(jié)第

8、三節(jié) 固定化酶的制備固定化酶的制備n一 一般方法及特點(diǎn)n二 酶的固定化方法一一 一般方法及特點(diǎn)一般方法及特點(diǎn)關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)墓潭ɑ椒ê捅匾妮d體以及穩(wěn)定性研究、改進(jìn)。1 四大類(lèi)方法：n吸附法（包括電吸附法）n結(jié)合法（無(wú)機(jī)多孔材料）n交聯(lián)法（雙功能試劑） n包埋法（微膠囊法） 各類(lèi)固定化方法的特點(diǎn)比較各類(lèi)固定化方法的特點(diǎn)比較: 比較項(xiàng)目吸附法結(jié)合法 交聯(lián)法包埋法物理吸附.共價(jià)鍵結(jié)合離子鍵結(jié)合 制備難易易難易 較難較難固定化程度弱強(qiáng)中等 強(qiáng)強(qiáng)活力回收率較高低高 中等高載體再生可能不可能可能 不可能不可能費(fèi)用低高低 中等低底物專(zhuān)一性不變可變不變 可變不變適用性酶源多較廣廣泛 較廣小分子底物、藥用

9、酶2 選擇方法依據(jù)：選擇方法依據(jù)： n（1） 酶的性質(zhì)n（2） 載體的性質(zhì)n（3） 制備方法的選擇3 固定化后酶的考察項(xiàng)目：固定化后酶的考察項(xiàng)目：n（1） 測(cè)定固定化酶的活力，以確定固定化過(guò)n程的活力回收率。n（2） 考察固定化酶穩(wěn)定性n（ 2） 考察固定化酶最適反應(yīng)條件二二 酶的固定化方法酶的固定化方法n（一） 吸附法n（二）結(jié)合法n（三）交聯(lián)法n（四） 包埋法（entrapping method）（一）（一） 吸附法吸附法n1 物理吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。n 選擇載體的原則 （1）要有巨大的比表面積 （2） 要有活潑的表面（3） 便于裝柱進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。（二）結(jié)

10、合法（二）結(jié)合法n1 離子鍵結(jié)合法n2 共價(jià)鍵結(jié)合法1 離子鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法n概念n常用載體:DEAE-纖維素， DEAE-葡聚糖凝膠n使用注意：pH、離子強(qiáng)度、溫度2 共價(jià)鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法n（1）概念n（2）可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)： 游離氨基， 游離羧基， 巰基， 咪唑基， 酚基， 羥基， 甲硫基， 吲哚基，二硫鍵n（3）常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無(wú)機(jī)載體共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式通式”n首先載體上引進(jìn)活潑基團(tuán)n 關(guān)鍵 n 然后活化該活潑基團(tuán)n 最后此活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)形成共價(jià)鍵（4）載體活化的方法）載體活化的方法nA重氮法nB疊

11、氮法nC烷基化反應(yīng)法nD硅烷化法nE溴化氰法A重氮法重氮法n反應(yīng)示意式如下 A重氮法重氮法n目前在我們國(guó)內(nèi)用的較多的載體是對(duì)氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等n該方法需要載體具有芳香族氨基A重氮法重氮法n反應(yīng)式及原理B 疊氮法疊氮法n例n用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶，步驟如下：n 酯化n 肼解n 疊氮化n(4) 偶聯(lián)B 疊氮法疊氮法n對(duì)含有羧機(jī)基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團(tuán)的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后于酶偶聯(lián) C烷基化反應(yīng)法烷基化反應(yīng)法n含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體。D硅烷化法硅烷化法n多孔

12、玻璃特點(diǎn)：n機(jī)械強(qiáng)度好，表面積大。n耐有機(jī)溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長(zhǎng)等。 D硅烷化法硅烷化法n一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。D硅烷化法硅烷化法D硅烷化法硅烷化法D硅烷化法硅烷化法E 溴化氰法溴化氰法n本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類(lèi)物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。E 溴化氰法溴化氰法（三）交聯(lián)法（三）交聯(lián)法n借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱(chēng)為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。（三）交聯(lián)法常用

13、試劑（三）交聯(lián)法常用試劑n常用試劑：戊二醛、異氰酸酯、N，N乙烯馬來(lái)亞胺、雙重氮聯(lián)苯胺等。應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，它兩個(gè)醛基都可以與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫堿(shiff)（三）交聯(lián)法的形式（三）交聯(lián)法的形式n交聯(lián)法有2種形式：酶直接交聯(lián)法n 酶輔助蛋白交聯(lián)n雙重固定法 （1） 吸附交聯(lián)法n（2） 交聯(lián)包埋法酶直接交聯(lián)法酶直接交聯(lián)法n在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴(lài)酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時(shí)間之間的平衡。酶輔助蛋白交聯(lián)酶輔助蛋白交聯(lián)n為避免分子內(nèi)交聯(lián)和在交聯(lián)過(guò)程中因化學(xué)修飾而引起酶失活，可使用第二個(gè)載體蛋白質(zhì)（即輔助蛋白質(zhì)，如白蛋白、明膠、血

14、紅蛋白等）來(lái)增加蛋白質(zhì)濃度，使酶與惰性蛋白質(zhì)共交聯(lián)。（1） 吸附交聯(lián)法吸附交聯(lián)法n先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹(shù)脂或其他大孔型離子交換樹(shù)脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)。用此法所得固定化酶也可稱(chēng)為殼狀固定化酶。（2）交聯(lián)包埋法）交聯(lián)包埋法n把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結(jié)成顆粒很細(xì)的集合體，然后用高分子或多糖一類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行包埋成顆粒。這樣避免顆粒太細(xì)的缺點(diǎn)，同時(shí)制得的固定化酶穩(wěn)定性好。（四）（四） 包埋法（包埋法（entrapping method） n定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱(chēng)為包埋法。（四）（四） 包埋法包埋法n包埋法分為網(wǎng)格型和微囊型n1網(wǎng)格型n2微囊型1網(wǎng)格型網(wǎng)格型n(1) 概念 將酶或含酶菌體包埋在凝膠細(xì)微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱(chēng)為網(wǎng)格型包埋法。也稱(chēng)為凝膠包埋法2微囊型包埋法微囊型包埋法n是將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱(chēng)為微囊化法。 微囊化法制備固定化酶有兩種方法微囊化法制備固定化酶有兩種方法