植物總DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測ppt課件

1、植物基因組DNA的提取瓊脂糖凝膠電泳檢測n脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸(DNA)(DNA)、核糖核酸、核糖核酸(RNA) (RNA) n與蛋白質(zhì)結(jié)合在一同以核蛋白與蛋白質(zhì)結(jié)合在一同以核蛋白DNPDNP的方式存在。的方式存在。在制備核酸時通常破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜來使核蛋在制備核酸時通常破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜來使核蛋白釋放出來。白釋放出來。n植物總植物總DNADNA包括細(xì)胞核包括細(xì)胞核DNADNA和細(xì)胞核外和細(xì)胞核外DNA,DNA,前者存前者存在于細(xì)胞核內(nèi)，后者存在于細(xì)胞質(zhì)中有半自主性在于細(xì)胞核內(nèi)，后者存在于細(xì)胞質(zhì)中有半自主性復(fù)制活性的細(xì)胞器內(nèi)，例如線粒體復(fù)制活性的細(xì)胞器內(nèi)，例如線粒體DNA(mtDNA)D

2、NA(mtDNA)和和葉綠體葉綠體DNA(ctDNA)DNA(ctDNA)。背景知識背景知識核酸的存在方式核酸的存在方式nDNADNA為白色類似石棉樣的纖維狀物，為白色類似石棉樣的纖維狀物，RNARNA的純品呈的純品呈白色粉末或結(jié)晶。白色粉末或結(jié)晶。nDNADNA、RNARNA和核苷酸都是極性化合物，普通都溶于和核苷酸都是極性化合物，普通都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。游離酸易溶于水。n在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。中較穩(wěn)定。 核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性

3、質(zhì)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 抽提去蛋白質(zhì)抽提去蛋白質(zhì) 沉淀核酸沉淀核酸根本過程根本過程 機(jī)械方法：機(jī)械方法： 超聲波處置法、研磨法、勻漿法；超聲波處置法、研磨法、勻漿法； 化學(xué)試劑法：用化學(xué)試劑法：用SDSSDS處置細(xì)胞；處置細(xì)胞； 酶解法：酶解法： 參與溶菌酶，破壞細(xì)胞壁。參與溶菌酶，破壞細(xì)胞壁。 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 uSDSSDS法法 SDS SDS是有效的陰離子去垢劑是有效的陰離子去垢劑, , 細(xì)胞中細(xì)胞中DNADNA與蛋與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合, SDS, SDS可以破可以破壞這種價鍵。壞這種價鍵。uCTABCTAB法法 CTAB CTAB是一種陽離子

4、去垢劑，它可以溶解膜是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細(xì)胞中的與脂膜，使細(xì)胞中的DNA-DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來，蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來，并使蛋白量變性，使并使蛋白量變性，使DNADNA與蛋白質(zhì)分別。與蛋白質(zhì)分別。DNADNA提取提取u 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 常用苯酚：氯仿：異戊醇常用苯酚：氯仿：異戊醇2525：2424：1 1或氯仿：異戊醇或氯仿：異戊醇2424：1 1抽提。抽提。u RNA RNA 常選用常選用RNaseRNase消化消化 ，或是用，或是用LiClLiCl來消除大來消除大分子的分子的RNARNA。u 酚類物質(zhì)酚類物質(zhì) 提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩提取液中加少量巰基乙醇

5、，選取幼嫩的資料。的資料。u 多糖多糖 提取液中加提取液中加1 1PVPPVP。DNADNA純化去雜質(zhì)純化去雜質(zhì)實(shí)驗(yàn)資料實(shí)驗(yàn)資料 新穎蔬菜葉片新穎蔬菜葉片( (去葉脈去葉脈) )試劑試劑 2 2CTABCTAB抽提液抽提液 TE TE 緩沖液緩沖液(pH=8.0) (pH=8.0) 氯仿：異戊醇氯仿：異戊醇(24:1)(24:1) 資料與試劑資料與試劑離心機(jī)離心機(jī) 水浴鍋水浴鍋研缽研缽 微量移液器微量移液器儀器器具儀器器具移液器量程的選擇移液器量程的選擇1取取 2g 清洗涼干的新穎葉片于研缽中，加清洗涼干的新穎葉片于研缽中，加 1/3 藥匙石英砂藥匙石英砂和和 4mL 2 倍的倍的 CTAB

6、提取液，迅速研磨。提取液，迅速研磨。2將將 1mL 研磨液轉(zhuǎn)入研磨液轉(zhuǎn)入 1.5mL 離心管中，置于離心管中，置于65水浴中保水浴中保溫溫 20min，其間顛倒混勻，其間顛倒混勻23次。破碎細(xì)胞次。破碎細(xì)胞3. 12000r/min 離心離心 5min，取上清液，取上清液700L轉(zhuǎn)到另一離心管轉(zhuǎn)到另一離心管中。參與等體積氯仿：異戊醇中。參與等體積氯仿：異戊醇24:1混合液，充分顛倒混合液，充分顛倒混勻?；靹颉?2000r/min，離心，離心 5min。抽提去蛋白。抽提去蛋白4將上清液移入新的將上清液移入新的1.5mL離心管內(nèi)，加離心管內(nèi)，加 600L異丙醇。顛異丙醇。顛倒混勻，可見倒混勻，可見

7、 DNA 絮狀沉淀。沉淀核酸絮狀沉淀。沉淀核酸512000r/min，離心，離心 1min，倒掉上清液，將離心管倒置枯，倒掉上清液，將離心管倒置枯燥。燥。 將沉淀回溶于將沉淀回溶于20L TE 緩沖液待測。緩沖液待測。操作步驟操作步驟1)選取新穎資料，研磨迅速徹底，研磨好的資料應(yīng)與選取新穎資料，研磨迅速徹底，研磨好的資料應(yīng)與 CTAB 抽提抽提液充分混勻；液充分混勻；2)假設(shè)提取產(chǎn)物有顏色，能夠是資料中含有較多的多酚類物質(zhì)，假設(shè)提取產(chǎn)物有顏色，能夠是資料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添加巰基乙醇添加巰基乙醇25，盡能夠選取幼嫩的資料；，盡能夠選取幼嫩的資料；3為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分別制

8、備過程中必需采為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分別制備過程中必需采用溫暖的條件，防止過酸過堿、猛烈地攪拌，防止熱變性，同用溫暖的條件，防止過酸過堿、猛烈地攪拌，防止熱變性，同時還要防止核酸降解酶類的降解。時還要防止核酸降解酶類的降解。本卷須知本卷須知DNADNA分子在高于等電分子在高于等電點(diǎn)的點(diǎn)的PHPH溶液中帶負(fù)溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向電荷，在電場中向正極挪動。在一定正極挪動。在一定電場強(qiáng)度下，電場強(qiáng)度下，DNADNA分分子的遷移速度與相子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)對分子質(zhì)量的對數(shù)成反比。成反比。電泳原理電泳原理瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越

9、小，其分辨才干就越強(qiáng)。濃度越高，孔隙越小，其分辨才干就越強(qiáng)。儀器和試劑儀器和試劑 儀器儀器 電泳儀電泳儀 電泳槽電泳槽 灌膠模具等灌膠模具等Tris-硼酸硼酸TBE Tris-乙酸乙酸TAE Tris-磷酸磷酸TPE常用電泳緩沖液常用電泳緩沖液 電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，普電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，普通與蔗糖、甘油或聚蔗糖通與蔗糖、甘油或聚蔗糖400400組成上樣緩沖液。組成上樣緩沖液。 作用：作用：添加樣品比重，以確保添加樣品比重，以確保DNADNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。均勻沉入加樣孔內(nèi)。構(gòu)成肉眼可見的指示帶，預(yù)測核酸電泳的速構(gòu)成肉眼可見的指示帶，預(yù)測核酸電泳的速度和位置

10、。度和位置。使樣品呈色，使加樣操作更方便。使樣品呈色，使加樣操作更方便。上樣緩沖液上樣緩沖液溴化乙錠溴化乙錠EBEB是一種熒光染料，是一種熒光染料，EBEB分子可嵌入核酸雙鏈分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強(qiáng)度與色熒光。其熒光強(qiáng)度與DNADNA的含量成正比。的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品據(jù)此可粗略估計樣品DNADNA濃度。濃度。 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠EBEB染色，肉眼可見核酸電泳帶，染色，肉眼可見核酸電泳帶，其其DNADNA量普通量普通5ng5ng。核酸染色劑核酸染色劑本卷須知：本卷須知：EBEB是致癌物質(zhì)，切勿用手接是

11、致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。觸，更不要污染環(huán)境。DNADNA分子量規(guī)范分子量規(guī)范不同種類不同種類DNA Marker1.1.凝膠制備凝膠制備 制備制備0.8%0.8%瓊脂糖凝膠。稱取適量瓊脂糖參瓊脂糖凝膠。稱取適量瓊脂糖參與與 20mL 0.5 20mL 0.5TBETBE，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至50-50-60 60 時，參與時，參與 EB EB 至終濃度至終濃度 0.5 0.5g/mLg/mL。緩慢倒入膠板，。緩慢倒入膠板，待膠凝固后拔出梳子。待膠凝固后拔出梳子。2.2.加樣加樣 取取1010l DNAl DNA樣液與樣液與 2 2l l 上樣上樣 buffer buffer 混勻，混勻，用微量移液器小心參與樣品槽。用微量移液器小心參與樣品槽。3.3.電泳電泳 接通電源，切記接近加樣孔的一端為負(fù)，電壓接通電源，切記接近加樣孔的一端為負(fù)，電壓為為15V/cm15V/cm長度以兩個電極之間的間隔計算長度以兩個電極之間的間隔計算, ,待溴酚待溴酚蘭挪動到一定位置，停