高分子量小麥谷蛋白亞基

1、2022-5-41 實驗一實驗一 小麥高分子量谷蛋白亞基測定小麥高分子量谷蛋白亞基測定2022-5-42 實驗內(nèi)容：實驗內(nèi)容：測定小麥高分子量谷蛋白亞基測定小麥高分子量谷蛋白亞基 實驗目的實驗目的: :掌握利用不連續(xù)十二烷基硫酸鈉掌握利用不連續(xù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳(SDS-PAGE)分離小麥高分子量谷分離小麥高分子量谷 蛋白蛋白亞基（亞基（HMW-GS）方法；）方法；了解小麥高分子量谷蛋白亞基的命名方法；了解小麥高分子量谷蛋白亞基的命名方法； 識別部分常見小麥高分子量谷蛋白亞基圖譜識別部分常見小麥高分子量谷蛋白亞基圖譜。 小麥高分子量谷蛋白亞基（小麥高分子量谷蛋

2、白亞基（HMW-GS）與?。┡c小麥的麥的加工品質(zhì)加工品質(zhì)密切相關(guān)，其組成是小麥品質(zhì)預測的密切相關(guān)，其組成是小麥品質(zhì)預測的一項重要指標。一項重要指標。HMW-GS作為一種分子標記，有作為一種分子標記，有助于提高小麥品質(zhì)性狀遺傳改良的效率。助于提高小麥品質(zhì)性狀遺傳改良的效率。十二烷基十二烷基硫酸鈉硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)是目技術(shù)是目前分離小麥前分離小麥 HMW-GS 的主要方法，此方法具有的主要方法，此方法具有準準確、微量、快速、操作簡便、分辨率高等確、微量、快速、操作簡便、分辨率高等優(yōu)點，尤優(yōu)點，尤其是其是可以分析半粒無胚籽?？梢苑治霭肓o胚籽粒的的

3、HMW-GS 組成，所組成，所剩余的帶胚半粒仍可以播種或組織培養(yǎng)，因此此方剩余的帶胚半粒仍可以播種或組織培養(yǎng)，因此此方法已經(jīng)成為小麥品種鑒定、親本選配及其后代篩選法已經(jīng)成為小麥品種鑒定、親本選配及其后代篩選的重要方法。的重要方法。2022-5-44實驗原理：實驗原理： 小麥高分子量谷蛋白亞基不連續(xù)小麥高分子量谷蛋白亞基不連續(xù) SDS-PAGE 系系統(tǒng)集統(tǒng)集電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)為一體，在為一體，在這三種效應(yīng)的共同作用下，把小麥谷蛋白亞基按分這三種效應(yīng)的共同作用下，把小麥谷蛋白亞基按分子量大小分離開來。子量大小分離開來。 以亞基組成已知的以亞基組成已知的中國

4、春小麥中國春小麥品種做對照，就品種做對照，就可以對待測小麥品種的可以對待測小麥品種的 HMW-GS 組成進行鑒定。組成進行鑒定。v電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)v各種蛋白質(zhì)按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在各種蛋白質(zhì)按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場向一定電極，以一定的速度泳動。電場向一定電極，以一定的速度泳動。v遷移率主要取決于遷移率主要取決于所帶電荷的多少、分子量所帶電荷的多少、分子量的大小以及分子的形狀的大小以及分子的形狀等因素。等因素。2022-5-46分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 由于凝膠具有黏度和較高摩擦阻力，以及其由于凝膠具有黏度和較高摩擦阻力，以及其網(wǎng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)直接參與了移動顆粒的分離過程，絡(luò)結(jié)構(gòu)直接參與了移

5、動顆粒的分離過程，這種區(qū)別這種區(qū)別不同大小分子種類的能力就是凝膠所具有的一種篩不同大小分子種類的能力就是凝膠所具有的一種篩分能力即分子篩效應(yīng)。分能力即分子篩效應(yīng)。濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) 蛋白質(zhì)樣品中的各組分在濃縮膠中會被壓縮成蛋白質(zhì)樣品中的各組分在濃縮膠中會被壓縮成層，而使原來很稀的樣品得到高度濃縮。層，而使原來很稀的樣品得到高度濃縮。 實驗材料、藥品和器材實驗材料、藥品和器材實驗材料：實驗材料：小麥籽粒，小麥普通中國春和馬奎斯為對照小麥籽粒，小麥普通中國春和馬奎斯為對照實驗器材：實驗器材：離心機、電泳儀、電泳槽、梳子、制膠架、成像離心機、電泳儀、電泳槽、梳子、制膠架、成像 儀、研缽、振蕩器、微波爐

6、、天平、儀、研缽、振蕩器、微波爐、天平、pH計、移計、移 液器、微量進樣器、染色盤、搖床、量筒等。液器、微量進樣器、染色盤、搖床、量筒等。實驗藥品：實驗藥品：丙烯酰胺、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、N,N,N,N,-四四 甲基乙二胺、過硫酸銨、二硫蘇糖醇、甘氨酸、甲基乙二胺、過硫酸銨、二硫蘇糖醇、甘氨酸、 甘油、十二烷基硫酸甘油、十二烷基硫酸 鈉、考馬斯亮藍等。鈉、考馬斯亮藍等。 試劑配制：試劑配制：麥谷蛋白提取液：麥谷蛋白提取液：4g SDS + 1g DTT + 250 ml 0.5M Tris-HCl (PH = 6.8)+ 20 ml甘油甘油 + 30 mg溴酚藍溴

7、酚藍 + 蒸餾水定溶至蒸餾水定溶至 100 ml。10電極緩沖液：電極緩沖液：Tris-HCI 30.3 g + 甘氨酸甘氨酸 144 g + SDS 10 g + 蒸餾水定溶至蒸餾水定溶至 1000ml。30%丙烯酰胺：丙烯酰胺：30 g + 蒸餾水定溶至蒸餾水定溶至 100ml。2%甲叉雙丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺：2 g + 蒸餾水定溶至蒸餾水定溶至 100ml。 1 M Tris-HCI（ PH = 6.8）: 12.1g Tris + 蒸餾水定蒸餾水定 溶至溶至 100ml,用用1 N HCI 調(diào)調(diào) PH = 6.8。 3 M Tris-HCI（ PH = 8.8）: 36.3g Tr

8、is + 蒸蒸 餾水定餾水定溶至溶至 100ml,用用1 M HCI 調(diào)調(diào) PH = 8.8。 10% SDS：SDS 10g + 蒸餾水定溶至蒸餾水定溶至100ml。 10% 過硫酸銨：過硫酸銨：1g過硫酸銨過硫酸銨 + 蒸餾水定溶蒸餾水定溶10ml。 染色液：染色液：100mg G-250 + 12 g三氯乙酸三氯乙酸 + 蒸餾水定蒸餾水定溶至溶至200ml。 實驗操作步驟實驗操作步驟1、小麥谷蛋白提取程序、小麥谷蛋白提取程序取單粒小麥種子研磨成粉，轉(zhuǎn)入離心管中，取單粒小麥種子研磨成粉，轉(zhuǎn)入離心管中，加入適量的蛋白質(zhì)提取液，在旋渦振蕩器加入適量的蛋白質(zhì)提取液，在旋渦振蕩器上混合均勻；上混合

9、均勻；將離心管放入將離心管放入65水浴鍋中水浴水浴鍋中水浴45min后取后取出離心管放，室溫冷卻；出離心管放，室溫冷卻；將冷卻后的離心管將冷卻后的離心管12000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/min離心離心30min，保存于保存于 4 冰箱備用。冰箱備用。 2 電泳程序電泳程序封板：封板：利用利用1%瓊脂封板，以防玻璃板漏膠；瓊脂封板，以防玻璃板漏膠；凝膠配制：凝膠配制：見表見表 1。 制膠：制膠：按表按表1的配方分別配制的配方分別配制 8% 和和 15% 兩種分離兩種分離膠，然后用兩個取液器進行以下操作，先吸取膠，然后用兩個取液器進行以下操作，先吸取1.0ml已經(jīng)已經(jīng)混勻的混勻的 15% 分離膠，加到玻璃板之間，再

10、向分離膠，加到玻璃板之間，再向 15% 分離分離膠中加入膠中加入 8% 的分離膠的分離膠0.5ml ，充分混勻后，從中吸取，充分混勻后，從中吸取 1.0ml加到玻璃板之間，如此反復操作上述步驟，加到玻璃板之間，如此反復操作上述步驟，2022-5-412直至距玻璃板上緣約直至距玻璃板上緣約 3cm 處時，向膠面上加一處時，向膠面上加一層正丁醇，靜置，直至分離膠凝固。倒置膠板，層正丁醇，靜置，直至分離膠凝固。倒置膠板，流出正丁醇，用蒸餾水沖洗膠面，用濾紙吸盡流出正丁醇，用蒸餾水沖洗膠面，用濾紙吸盡多余水。多余水。 按表按表1配制配制5%濃縮膠，混勻后倒入玻璃板之濃縮膠，混勻后倒入玻璃板之間，將梳子

11、放置在玻璃板間，注意不要產(chǎn)生氣間，將梳子放置在玻璃板間，注意不要產(chǎn)生氣泡，靜置至膠凝。待濃縮膠凝固后，垂直取出泡，靜置至膠凝。待濃縮膠凝固后，垂直取出梳子，加蒸餾水，甩出樣品槽中的殘膠。梳子，加蒸餾水，甩出樣品槽中的殘膠。 2022-5-413成成 分分8%分離膠分離膠50ml15%分離膠分離膠50ml5%濃縮膠濃縮膠10mlH2O23.211.56.830%Acr13.325.01.71M Tris-HCl (pH8.8)12.512.5-1M Tris-HCl (pH6.8)-1.2510%SDS0.50.50.110%AP0.5 (0.25)0.5 (0.25)0.1TEMED0.03

12、(0.02)0.020.01表表1 分離膠與濃縮膠配方分離膠與濃縮膠配方成成 分分8%分離膠分離膠50ml15%分離膠分離膠50ml5%濃縮膠濃縮膠10mlH2O23.211.56.830%Acr13.325.01.71M Tris-HCl (pH8.8)12.512.5-1M Tris-HCl (pH6.8)-1.2510%SDS0.50.50.110%AP0.5 (0.25)0.5 (0.25)0.1TEMED0.03 (0.02)0.020.01表表1 分離膠與濃縮膠配方分離膠與濃縮膠配方2022-5-414 點樣：點樣：將膠板放在電泳槽中加入電極緩沖液至高將膠板放在電泳槽中加入電極緩沖

13、液至高出內(nèi)側(cè)出內(nèi)側(cè) 玻璃板上邊約玻璃板上邊約0.5cm，用微量進樣器吸取蛋白，用微量進樣器吸取蛋白質(zhì)質(zhì)10-20ul分別加在每個樣品槽底部凝膠面上。分別加在每個樣品槽底部凝膠面上。 電泳：電泳：下槽為正極，上槽為負極，每膠板下槽為正極，上槽為負極，每膠板30mA穩(wěn)穩(wěn)流電泳，直至溴酚藍接近分離膠底部，電泳完畢。流電泳，直至溴酚藍接近分離膠底部，電泳完畢。 2022-5-415 卸膠、染色和脫色：卸膠、染色和脫色：卸下膠板，用手術(shù)剪撬開玻卸下膠板，用手術(shù)剪撬開玻璃板璃板 ，將整塊分離膠浸沒在，將整塊分離膠浸沒在0.25%考馬斯亮藍溶液考馬斯亮藍溶液中，放在搖床上緩緩搖動染色過夜；次日，取出凝中，放

14、在搖床上緩緩搖動染色過夜；次日，取出凝膠，蒸餾水漂洗直至呈現(xiàn)清晰可見的蛋白質(zhì)色帶。膠，蒸餾水漂洗直至呈現(xiàn)清晰可見的蛋白質(zhì)色帶。 拍照：拍照：利用凝膠成像儀或者普通像機拍照觀察。利用凝膠成像儀或者普通像機拍照觀察。 圖圖1 1小麥高分子量谷蛋白亞基的命名是依其相對遷移率，小麥高分子量谷蛋白亞基的命名是依其相對遷移率， 結(jié)果分析結(jié)果分析 1 小麥高分子量谷蛋白亞基的命名小麥高分子量谷蛋白亞基的命名 小麥高分子量谷蛋白亞基的命名是依其小麥高分子量谷蛋白亞基的命名是依其相對遷移率相對遷移率，按按Payne的數(shù)字命名法命名，見圖的數(shù)字命名法命名，見圖1 圖圖1 1小麥高分子量谷蛋白亞基的命名是依其相對遷

15、移率，小麥高分子量谷蛋白亞基的命名是依其相對遷移率， 2 小麥高分子量谷蛋白亞基小麥高分子量谷蛋白亞基 SDS-PAGE 圖譜圖譜部分小麥高分子量谷蛋白亞基部分小麥高分子量谷蛋白亞基 SDS-PAGE 圖譜見圖圖譜見圖 2 圖圖 2 部分小麥高分子量谷蛋白亞基部分小麥高分子量谷蛋白亞基 SDS-PAGE 圖譜圖譜2 小麥高分子量谷蛋白亞基小麥高分子量谷蛋白亞基 SDS-PAGE 圖譜圖譜部分小麥高分子量谷蛋白亞基部分小麥高分子量谷蛋白亞基 SDS-PAGE 圖譜見圖圖譜見圖 22 小麥高分子量谷蛋白亞基小麥高分子量谷蛋白亞基 SDS-PAGE 圖譜圖譜部分小麥高分子量谷蛋白亞基部分小麥高分子量

16、谷蛋白亞基 SDS-PAGE 圖譜見圖圖譜見圖 2 圖圖 2 部分小麥高分子量谷蛋白亞基部分小麥高分子量谷蛋白亞基 SDS-PAGE 圖譜圖譜2 小麥高分子量谷蛋白亞基小麥高分子量谷蛋白亞基 SDS-PAGE 圖譜圖譜部分小麥高分子量谷蛋白亞基部分小麥高分子量谷蛋白亞基 SDS-PAGE 圖譜見圖圖譜見圖 2圖3 中國春、紅火麥、馬奎斯和濟麥20 高分子量谷蛋白亞基 SDS-PAGE 圖譜 HMW-GS的變異由的變異由Glu-A1、Glu-B1和和Glu-D1三個位點上三個位點上的等位基因所控制，不同小麥基因型的高分子量谷蛋白亞基的等位基因所控制，不同小麥基因型的高分子量谷蛋白亞基組成不同，但

17、也有相同。如中國春、紅火麥、馬奎斯和濟麥組成不同，但也有相同。如中國春、紅火麥、馬奎斯和濟麥20的高分子量谷蛋白亞基的高分子量谷蛋白亞基SDS-PAGE圖譜見圖譜見 圖圖 3 圖圖3 中國春、紅火麥、馬奎斯和濟麥中國春、紅火麥、馬奎斯和濟麥20 高分子量谷蛋白亞基高分子量谷蛋白亞基 SDS-PAGE 圖譜圖譜 注意事項：注意事項： 丙烯酰胺和雙丙烯酰胺有很強的神經(jīng)毒性，容易丙烯酰胺和雙丙烯酰胺有很強的神經(jīng)毒性，容易吸附在皮膚上，且作用有積累性，稱量時戴手套吸附在皮膚上，且作用有積累性，稱量時戴手套和口罩；和口罩； 封板和灌膠時都不能產(chǎn)生氣泡，以防漏膠及譜帶封板和灌膠時都不能產(chǎn)生氣泡，以防漏膠及譜帶彎曲；彎曲； 使用過的滴管、玻璃器皿要立即沖洗，以防止凝使用過的滴管、玻璃器皿要立即沖洗，以防止凝固堵塞；固堵塞； 平板玻璃昂貴，實驗過程中要特別小心。實驗結(jié)平板玻璃昂貴，實驗過程中要特別小心。實驗結(jié)束后認真清洗放回原處。束后認