生物技術(shù)制藥重點(diǎn)剖析

1、重點(diǎn)（單選10個(gè)，名詞解釋4個(gè)，簡(jiǎn)單3個(gè)，論述2個(gè)。）1. 生物技術(shù)制藥飛速發(fā)展的30年20世紀(jì)70年代中期生物時(shí)代（重組DNA、DNA的合成、DNA和蛋白質(zhì)的微量測(cè)序技術(shù)、重組蛋白、單克隆抗體人胰島素）20世紀(jì)80年代中期技術(shù)平臺(tái)時(shí)代（新平臺(tái)：高通量篩選、組合化學(xué)、胚胎干細(xì)胞技術(shù)，藥物的探索性研究、治療的新模式：反義藥物、基因治療以及在治療中添加使用重組蛋白、胰島素、干擾素、EPO、細(xì)胞集落刺激因子（CSF）、人生長(zhǎng)激素等）20世紀(jì)90年代中期基因組時(shí)代（新技術(shù)：基因組、高通量的測(cè)序、基因芯片、生物信息、生物能源、生物光電、生物傳感器、蛋白質(zhì)組學(xué)和功能基因組學(xué)等制藥工程，新藥研發(fā)）2006年

2、后基因組時(shí)代2. 質(zhì)粒三要素、基因工程制藥流程、蛋白質(zhì)純化技術(shù)質(zhì)粒載體的三個(gè)要素（1）復(fù)制子:又稱復(fù)制起始區(qū)（2）選擇標(biāo)記：用于篩選鑒定（3）多克隆位點(diǎn)：限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列基因工程制藥流程:1. 目的基因的制備2. 載體3. 載體與目的基因的連接4. 重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞5. 重組子的篩選和鑒定6. 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的選擇7. 基因重組蛋白的分離和純化基因重組蛋白的主要純化技術(shù)1. 離子交換層析利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異，通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可以交換的離子進(jìn)行交換離子交換劑陰離子交換劑、陽(yáng)離子交換劑、兩性離子交換劑、選擇性離子交換劑影響因素鹽離子濃度、離子大小、洗脫梯度與流速2. 親和

3、層析利用固定化配基于目的蛋白之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附 酶與激活劑/受體/底物 抗體與抗原受體與激素/配體 蛋白質(zhì)與DNA/RNA結(jié)合域親和層析步驟： 配基固定化親和吸附洗滌洗脫解離再生3. 凝膠過(guò)濾4. 反相層析和疏水層析 反相層析：有機(jī)溶液洗脫，蛋白質(zhì)可能變性 疏水層析：鹽溶液洗脫3. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用溶液、培養(yǎng)基、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基是維持動(dòng)物組織及細(xì)胞在體外生存、生長(zhǎng)的基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。1天然培養(yǎng)基：直接采用取自動(dòng)物體液或組織中提取的成分作培養(yǎng)液，如乳蛋白水解物、酪蛋白水解物、血清、血漿及胚胎浸出液等（維持液：含低濃度或不含小牛血清/生長(zhǎng)液：含5%20%小牛血清）2合成培養(yǎng)基：

4、化學(xué)成分主要為氨基酸、碳水化合物、蛋白質(zhì)、核酸類物質(zhì)、維生素、輔酶、激素、生長(zhǎng)因子、微量元素及緩沖劑等。（Eagle培養(yǎng)基含有13種氨基酸、9種維生素、6種無(wú)機(jī)鹽及葡萄糖；199培養(yǎng)基含21種氨基酸、17種維生素、7種無(wú)機(jī)鹽、4種嘌呤、2種嘧啶、谷胱甘肽、ATP、膽固醇、吐溫-80、脫氧核糖、核糖、葡萄糖及醋酸鈉。）3血清培養(yǎng)基：不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中增加某些適于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，如纖連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、表皮生長(zhǎng)因子等3. 無(wú)血清培養(yǎng)基（serumfreemedium）第一代不含有血清，但含有大量的動(dòng)物或植物蛋白第二代完全不用

5、動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)含量很低（少于100g/ml），使重組蛋白的純化簡(jiǎn)單第三代完全不含有蛋白質(zhì)或含量極低，沒(méi)有任何動(dòng)物、人類蛋白或多肽新一代無(wú)血清、無(wú)蛋白質(zhì)、無(wú)動(dòng)物來(lái)源、成分確定動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用的其他溶液1. 平衡鹽溶液2.培養(yǎng)基pH調(diào)整液3. 細(xì)胞消化液4. 抗生素溶液1平衡鹽溶液生理鹽水葡萄糖維持細(xì)胞滲透壓、調(diào)控培養(yǎng)液酸堿度平衡酚紅指示劑pH黃/紫紅Hanks液緩沖能力弱Earle液緩沖能力強(qiáng)2. 培養(yǎng)基pH調(diào)整液合成培養(yǎng)液微酸性，需調(diào)整pH單獨(dú)配制，單獨(dú)滅菌，待滅菌后的培養(yǎng)基使用前再加入3.7%、5.6%、7.4%NaHC03溶液、羥乙基哌嗪乙磺酸液3. 細(xì)胞消化液（1）胰蛋白酶溶液

6、：分離自牛、豬等動(dòng)物胰臟的胰蛋白酶（trypsin）呈黃白色粉末狀，極易潮解，注意冷藏干燥保存.常用1:125和1:250兩種濃度（2）EDTA溶液：一種化學(xué)螯合劑，其溶液又稱Versen液，對(duì)細(xì)胞具一定的非酶性解離作用。常用濃度0.02%（個(gè)別細(xì)胞系要求濃度較高）使用完，需用Hanks液沖洗凈（血清對(duì)其無(wú)終止作用）4. 抗生素溶液防止發(fā)生微生物污染青霉素、鏈霉素、卡那霉素、制霉菌素生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的種類1. 原代細(xì)胞：直接將動(dòng)物組織或器官經(jīng)過(guò)粉碎、消化而制得的懸浮細(xì)胞（需要大量的動(dòng)物組織原料、不能直接從細(xì)胞庫(kù)獲得、生長(zhǎng)分裂不旺盛）2. 傳代細(xì)胞系：原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代、篩選、克隆等步驟，從多種細(xì)胞

7、中純化得到的某種具有一定特征的細(xì)胞系（在生物學(xué)特性上與腫瘤細(xì)胞有許多相似之處/有時(shí)是從腫瘤細(xì)胞衍生而來(lái)/從動(dòng)物胚胎組織中獲取，有明顯的貼壁和接觸抑制特性，有正常細(xì)胞的核型，一般可傳代培養(yǎng)50代，且無(wú)致瘤性/廣泛用于人用治療性藥物的生產(chǎn)，不夠理想）3. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)某個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程，失去正常細(xì)胞的特點(diǎn)而獲得無(wú)限增殖的能力得到的細(xì)胞系（大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)）（無(wú)限的生命力/較短的倍增時(shí)間/較低的培養(yǎng)條件要求Vero（正常成年非洲綠猴腎細(xì)胞）、CHO細(xì)胞（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞）、Namalwa細(xì)胞（淋巴瘤細(xì)胞）和BHK-21細(xì)胞（幼鼠腎細(xì)胞）4. 工程細(xì)胞系：采用細(xì)胞融合技術(shù)或基因工程技術(shù)對(duì)宿主細(xì)胞

8、的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修飾改造或重組，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨(dú)特性狀的細(xì)胞系（1）融合細(xì)胞系：通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)構(gòu)建（2）基因工程細(xì)胞系：通過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)載體的導(dǎo)入以及表達(dá)細(xì)胞株的篩選而構(gòu)建4. 抗體的結(jié)構(gòu)、抗體的種類、嵌合抗體、人源化抗體基本結(jié)構(gòu)：抗體單體由4條多肽鏈（2條相同的重鏈和2條相同的輕鏈）通過(guò)二硫鍵（-S-S-）鏈接而成，為“Y”字形結(jié)構(gòu)。1輕鏈（L鏈）2重鏈（H鏈）3可變區(qū)（V區(qū)）：識(shí)別并特異性結(jié)合抗原：與毒素結(jié)合可以中和其毒性/與病原體結(jié)合，可以組織其對(duì)機(jī)體細(xì)胞的黏附和感染恒定區(qū)（C區(qū)）：1. 激活補(bǔ)體系統(tǒng)抗體（IgM、IgG）與抗原結(jié)合形成復(fù)合物可通過(guò)啟動(dòng)C1q激活補(bǔ)體經(jīng)典途

9、徑；IgG4、IgA和IgE的聚合物可以激活補(bǔ)體旁路途徑。2. 介導(dǎo)免疫細(xì)胞活性抗體的調(diào)理作用；ADCC作用；介導(dǎo)超敏反應(yīng)3. 穿過(guò)胎盤(pán)與黏膜IgG是唯一能夠從母體通過(guò)胎盤(pán)屏障轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒體內(nèi)的抗體（胎兒抗感染）分泌型IgA合成和主要作用部位在黏膜（黏膜局部抗感染）4超變區(qū)（HVR），又可稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）骨架區(qū)（FR）5. 鉸鏈區(qū)6. 抗原特異性結(jié)合部位7. 補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)8. 巨噬細(xì)胞等的結(jié)合位抗體的種類：Fab和Fv、單鏈抗體、雙鏈抗體、抗體融合蛋白、嵌合抗體、人源化抗體、超變區(qū)多肽、特殊抗嵌合抗體:是利用DNA重組技術(shù)，將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，

10、轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的抗體，表達(dá)的抗體輕重鏈V區(qū)是異源，而C區(qū)是人源的，即整個(gè)抗體分子60%-70%是人源的。人源化抗體：把鼠抗體的CDR序列一直到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得的抗體。5. 疫苗的種類、各種亞單位疫苗1. 滅活疫苗2. 減毒活疫苗3. 亞單位疫苗4. 聯(lián)合疫苗5. 核酸疫苗6. 治療性疫苗滅活疫苗又稱死疫苗，是指利用加熱或甲醛等理化方法將人工大量培養(yǎng)的完整的病原微生物殺死，使其喪失感染性和毒性而保持其免疫原性，并結(jié)合相應(yīng)的佐劑而制成的疫苗。疫苗液中除含有滅活的病毒顆粒外，還含有細(xì)胞成分和培養(yǎng)病毒時(shí)加入的牛血清等蛋白類物質(zhì)，多次接種疫苗容易發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。滅活疫苗的優(yōu)點(diǎn)制造工藝簡(jiǎn)單免疫原

11、性的穩(wěn)定性高易于制備多價(jià)疫苗滅活疫苗的缺點(diǎn)需要嚴(yán)格的滅活操作，保證疫苗中不含有滅活不完全的顆粒。需要進(jìn)行多次接種，由于機(jī)體反復(fù)接受疫苗中的異性蛋白質(zhì)的刺激，而可能出現(xiàn)不良的過(guò)敏反應(yīng)。接種滅活疫苗產(chǎn)生的抗體滴度隨時(shí)間而下降滅活疫苗需要量大減毒活疫苗又稱弱毒疫苗，是指將微生物的自然強(qiáng)毒株通過(guò)物理、化學(xué)和生物學(xué)的方法，連續(xù)傳代，使其對(duì)原宿主喪失致病力，或只引起亞臨床感染，但仍保持良好的免疫原性、遺傳特性，用這種毒株制備的疫苗就叫減毒活疫苗。減毒活疫苗的作用機(jī)制最類似自然感染免疫，因而具有類似自然感染的優(yōu)越性。當(dāng)前使用的病毒疫苗多數(shù)是減毒活疫苗。常用的減毒方法：9體外減毒：即體外連續(xù)傳代減毒。在異源宿

12、主中連續(xù)傳代；在單一宿主中反復(fù)連續(xù)傳代。9冷適應(yīng)篩選 溫度可以改變病毒的特性，得到冷適應(yīng)株。 病毒冷適應(yīng)株常伴有毒力減弱和各種特征性標(biāo)志。 冷適應(yīng)篩選穩(wěn)定的減毒突變株是在傳統(tǒng)疫苗設(shè)計(jì)中較早采用的方法，而且也是最為行之有效的思路。減毒活疫苗的優(yōu)點(diǎn)1）可以誘導(dǎo)更全面的免疫應(yīng)答2）可誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，理論上只需要接種一次3）可能引起水平傳播，擴(kuò)大免疫效果4）生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉。減毒活疫苗的缺點(diǎn)1）有可能出現(xiàn)毒力回復(fù)2）可能造成環(huán)境污染而引發(fā)交叉感染等，并可能滯留在環(huán)境中形成傳染源3）產(chǎn)品的分析評(píng)估較為困難4）保存、運(yùn)輸條件要求較高亞單位疫苗是指提取或合成細(xì)菌、病毒外殼的特殊蛋白結(jié)構(gòu)，即抗原決定

13、簇制成的疫苗，這類疫苗不是完整的病毒，是病毒的一部分物質(zhì)，故稱亞單位疫苗。亞單位疫苗僅有幾種主要表面蛋白，因而能消除病毒（或細(xì)菌）的許多無(wú)關(guān)抗原決定簇和粗制或半提純的病毒（或細(xì)菌）制劑誘發(fā)的不良反應(yīng)。亞單位疫苗：純化亞單位疫苗合成肽亞單位疫苗基因工程亞單位疫苗合成肽亞單位疫苗（Syntheticpeptidesubunitvaccine）合成肽疫苗是指使用化學(xué)方法合成能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)的多肽制成的疫苗。優(yōu)點(diǎn)：純度和安全性高；副作用小；可長(zhǎng)期在常溫下保存；缺點(diǎn)：其抗原性單一；免疫原性弱。因此須用幾種合成肽抗原聯(lián)合使用，還須用多種方法提高合成肽的免疫原性。滅活疫苗減毒活疫苗亞單位疫苗制備方法

14、通過(guò)化學(xué)或物理方法使病原體失活通過(guò)非正常培養(yǎng)選擇減毒株或無(wú)毒株以化學(xué)方法獲得病原體的某些具有免疫原性的成分免疫機(jī)理病原體失去毒力但保持免疫原性，接種后產(chǎn)生特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞接種后病原體在體內(nèi)有一定生長(zhǎng)繁殖能力，類似隱性感染，產(chǎn)生細(xì)胞、體液和局部免疫接種后能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫疫苗穩(wěn)定性相對(duì)穩(wěn)定相對(duì)不穩(wěn)定穩(wěn)定毒力回升不可能有可能不可能免疫接種多次免疫接種一般為一次性多次免疫接種安全性較安全對(duì)免疫缺陷者有危險(xiǎn)安全性好常用疫苗乙腦、脊髓灰質(zhì)炎麻疹、脊髓灰質(zhì)炎減毒白喉、破傷風(fēng)類毒滅活疫苗活疫苗素，A群腦膜炎球菌多糖疫苗基因工程亞單位疫苗：是指在分離出病原體特異抗原編碼基因的基礎(chǔ)上，將外源基因轉(zhuǎn)入

15、另一個(gè)非致病性的微生物內(nèi)表達(dá)基因產(chǎn)物，然后通過(guò)分離和純化而獲得特異性的蛋白質(zhì)?；蚬こ虂唵挝灰呙绲膬?yōu)點(diǎn)： 產(chǎn)量高； 純度高； 安全性高； 用于病原體難于培養(yǎng)或有潛在致癌性，或有免疫病理作用的疫苗研究?；蚬こ虂唵挝灰呙绲娜秉c(diǎn)：與傳統(tǒng)亞單位疫苗相比，免疫效果較差。增強(qiáng)其免疫原性的方法： 調(diào)整基因組合使之表達(dá)成顆粒性結(jié)構(gòu) 在體外加以聚團(tuán)化，包入脂質(zhì)體或膠囊微球 加入有免疫增強(qiáng)作用的化合物作為佐劑（adjuvant）6. 固定化酶的性質(zhì)和指標(biāo)、有機(jī)相的酶反應(yīng)固定化酶性質(zhì)的改變：1. 酶活力的改變：固定話酶活力小于天然酶，專一性也會(huì)發(fā)生改變2. 酶穩(wěn)定性的提高：熱穩(wěn)定性3酶最適合PH改變：負(fù)電荷載體制

16、備的固定化酶，最適pH提高；反之亦然4. 酶最適溫度提高5米氏常數(shù)KM變化指標(biāo)：1. 固定化酶（細(xì)胞）的活力酶催化某特定化學(xué)反應(yīng)的能力，可表示為一定條件下它所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)初速度。單位：每毫克干重固定化酶（細(xì)胞）每分鐘轉(zhuǎn)化底物（或生產(chǎn)產(chǎn)物）的量，表示為mol/（min.mg）2. 偶聯(lián)率及相對(duì)活力的測(cè)定：用以表示影響酶固有性質(zhì)諸因素的綜合效應(yīng)及固定化期間引起的酶失活固定化酶的活力回收是指固定化以后固定化酶（或細(xì)胞）所顯示的活力占被固定的等量游離酶（細(xì)胞）總活力的百分?jǐn)?shù)3. 固定化酶（細(xì)胞）的半衰期在連續(xù)測(cè)定條件下，固定化酶（細(xì)胞）的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時(shí)間，以t1/2表

17、示是衡量操作穩(wěn)定型的指標(biāo)，而操作穩(wěn)定性是影響實(shí)用的關(guān)鍵因素。4. 固定化酶的熱穩(wěn)定性將固定化酶在不同溫度下溫育lh之后，在最適溫度下測(cè)定酶活力，固定化酶的活力一般應(yīng)保持在60%以上。應(yīng)用脂肪酶蛋白酶羥基化酶過(guò)氧化物酶多酚氧化酶膽固醇氧化酶醇脫氫酶成成化成化厶'ri'J合酯合對(duì)合對(duì)化合化化化肽酯轉(zhuǎn)聚酰肽酰氧聚氧氧酯青每素GEJ體肽合成醇與有機(jī)酸合成酯類各種酯類生產(chǎn)二酯的選擇性聚合甘醇的?；铣闪汶奶穷愼；瘹绑w轉(zhuǎn)化酚類、胺類化合物的聚合芳香化合物的釋基化膽固醇測(cè)定有機(jī)硅醇的酯化為什么采用有機(jī)相進(jìn)行酶反應(yīng)？對(duì)于大多數(shù)有機(jī)化合物來(lái)說(shuō)，水并不是一種適宜的溶劑。因?yàn)樵S多有機(jī)化合物（底物

18、）在水介質(zhì)中難溶或不溶。水的存在往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反應(yīng)的發(fā)生。有機(jī)相中酶反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)減少水引起的副反應(yīng)有利于疏水性底物的反應(yīng)熱力學(xué)平衡向產(chǎn)物方向移動(dòng)提高酶的穩(wěn)定性酶不溶于有機(jī)介質(zhì)，利于回收利用從低沸點(diǎn)的溶劑中易分離純化產(chǎn)物無(wú)微生物污染規(guī)模生產(chǎn)水解反應(yīng)（脂肪酶、蛋白酶）腈水解反應(yīng)（腈水解酶、水合酶）腈合成反應(yīng)（羥腈化酶）酯化/?；磻?yīng)（脂肪酶、蛋白酶）羰基還原反應(yīng)（酮還原酶、醇脫氫酶）有機(jī)相酶反應(yīng)的溶劑體系水-水溶性溶劑均相體系水-水不溶性溶劑兩相體系反相膠團(tuán)（束）體系單向有機(jī)溶劑體系影響有機(jī)相酶反應(yīng)的主要因素:水含量/有機(jī)溶劑/酶/固定化載體/pH7. 發(fā)酵過(guò)程的影響因素及

19、控制、優(yōu)良菌種的選育發(fā)酵過(guò)程的影響因素及控制有一個(gè)好的菌種以后要有一個(gè)配合菌種生長(zhǎng)的最佳條件，使菌種的潛能發(fā)揮出來(lái)目標(biāo)是得到最高的產(chǎn)品收率。發(fā)揮菌種的最大生產(chǎn)潛力考慮之點(diǎn)菌種本身的代謝特點(diǎn)生長(zhǎng)速率、呼吸強(qiáng)度、營(yíng)養(yǎng)要求（酶系統(tǒng)）、代謝速率菌代謝與環(huán)境的相關(guān)性溫度、pH、滲透壓、離子強(qiáng)度、溶氧濃度、剪切力等（一）菌體濃度的影響及控制 菌體濃度：是指單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。菌體濃度不僅反映菌體細(xì)胞的多少，而且反映菌體細(xì)胞生理特性的不同階段。 菌體濃度大小主要取決于：菌體的生長(zhǎng)速率以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件（溫度、pH、滲透壓和水）。（二）菌體濃度與產(chǎn)物產(chǎn)率的關(guān)系在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)速率下，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率與菌

20、體濃度成正比關(guān)系。但是，菌體濃度過(guò)高，往往也會(huì)產(chǎn)生其他的影響，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快，培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生明顯的改變，有毒物質(zhì)的累積，有可能改變菌體的代謝途徑，特別是對(duì)培養(yǎng)液中的溶解氧影響尤為明顯，影響產(chǎn)物產(chǎn)率。菌體濃度過(guò)低，同樣使產(chǎn)物的產(chǎn)率下降?？刂? 在發(fā)酵過(guò)程中必須設(shè)法使菌體濃度控制在合適的范圍內(nèi)。 通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的濃度來(lái)控制。首先要有適當(dāng)?shù)呐浔龋缓笸ㄟ^(guò)中間補(bǔ)料來(lái)調(diào)整。（二）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)發(fā)酵的合成和控制各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖和代謝產(chǎn)物的合成都很重要。1. 碳源的影響及控制2. 氮源的影響及控制3. 磷酸鹽的影響及控制4. 補(bǔ)料的控制1. 碳源的影響及控制 碳源可以分為速效碳源

21、和遲效碳源。 速效碳源能被微生物快速利用，合成菌體和產(chǎn)生能量，因此有利于菌體的生長(zhǎng)，但過(guò)多的分解代謝產(chǎn)物有時(shí)會(huì)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的合成產(chǎn)生分解代謝阻遏作用，不利于產(chǎn)物的合成。 遲效碳源為菌體緩慢利用，有利于延長(zhǎng)代謝產(chǎn)物的合成，特別有利于延長(zhǎng)抗生素的分泌期。工業(yè)上，采用速效和遲效碳源的混合培養(yǎng)基來(lái)控制菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。舉例：青霉素乳糖或緩慢滴加葡萄糖2. 氮源的影響與控制氮源分為速效氮源和遲效氮源。氨基（或銨）態(tài)氮（氨基酸、硫酸銨）和玉米漿屬速效氮源，能被菌體快速利用，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，但對(duì)某些代謝產(chǎn)物的合成，如抗生素的合成產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，影響產(chǎn)量。遲效氮源如黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉等，對(duì)延長(zhǎng)次級(jí)代

22、謝產(chǎn)物的分泌期，提高產(chǎn)量十分重要。發(fā)酵過(guò)程，要選擇合適的氮源和含量。一般選用含速效和遲效的混合氮源。3. 磷酸鹽的影響和控制磷是微生物分解代謝和合成代謝所必須的成分，保證微生物正常生長(zhǎng)所必需的磷酸鹽濃度一般為0.32300mmol，而對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物而言所允許的最高平均濃度為l.Ommol，超過(guò)lOmmol就明顯抑制產(chǎn)物合成，因此控制磷酸鹽濃度對(duì)微生物藥物，特別是次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)是非常重要的。4. 補(bǔ)料的控制 補(bǔ)料對(duì)發(fā)酵起到了重要作用：豐富了培養(yǎng)基，避免了菌體過(guò)早衰老，使產(chǎn)物合成期延長(zhǎng)；控制pH和代謝方向；改善通氣效果；補(bǔ)足因發(fā)酵過(guò)程中減少的發(fā)酵液體積。 補(bǔ)料的物質(zhì)包括碳源、氮源、水和其他

23、物質(zhì)（磷酸鹽、前體等）。 補(bǔ)料在菌體生長(zhǎng)旺盛后期，發(fā)酵液泡沫液位下降后開(kāi)始。 補(bǔ)料的關(guān)鍵：控制補(bǔ)料的時(shí)間、速率和料配比。（三）溫度的影響及控制不同微生物的生長(zhǎng)對(duì)溫度的要求不同，根據(jù)它們對(duì)溫度的要求大致可分為四類：嗜冷菌適應(yīng)于026oC生長(zhǎng)，嗜溫菌適應(yīng)于1543oC生長(zhǎng)，嗜熱菌適應(yīng)于3765oC生長(zhǎng)，嗜高溫菌適應(yīng)于65OC以上生長(zhǎng)（四）pH的影響和控制每一類菌都有其最適的和能耐受的pH范圍，大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)的最適pH范圍在6.37.5,霉菌和酵母菌生長(zhǎng)的最適pH范圍為36，放線菌生長(zhǎng)的最適pH范圍為78。微生物生長(zhǎng)階段和產(chǎn)物合成階段的最適pH往往不一樣，這與菌種的特性和產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。引起發(fā)酵

24、液pH下降的因素:培養(yǎng)基中碳、氮比例不當(dāng)，碳源過(guò)多，特別是葡萄糖過(guò)量，或中間補(bǔ)糖過(guò)多，加之溶解氧不足，致使有機(jī)酸大量積累而使pH下降；消沫劑加的過(guò)多，生理酸性物質(zhì)的存在及氮被利用等。引起發(fā)酵液pH上升的因素:培養(yǎng)基中碳、氮比例不當(dāng)，氮源過(guò)多，氨基酸釋放等；生理堿性物質(zhì)存在，中間補(bǔ)料中氨水或尿素等堿性物質(zhì)加入過(guò)多等。（五）溶氧的影響和控制 溶氧是需氧微生物生長(zhǎng)所必需的。發(fā)酵過(guò)程中需要不斷通氣和攪拌，才能滿足溶氧要求。發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)保持氧濃度在臨界氧濃度以上。一般發(fā)酵前期，由于產(chǎn)生菌大量繁殖，需氧量大幅度增加，如果此時(shí)需氧超過(guò)了供養(yǎng)，會(huì)使溶解氧明顯下降，溶解氧曲線出現(xiàn)一個(gè)低峰。(七)泡沫的影響與控制

25、發(fā)酵過(guò)程起泡的利弊：氣體分散、增加氣液接觸面積，但過(guò)多的泡沫是有害的 泡沫的定義：一般來(lái)說(shuō)：泡沫是氣體在液體中的粗分散體，屬于氣液非均相體系 美國(guó)道康寧公司對(duì)泡沫這樣定義：體積密度接訴氣體，而不接訴液體的“氣/液”分散體。優(yōu)良菌種的選育1. 遺傳性轉(zhuǎn)穩(wěn)定2. 生長(zhǎng)速度快,不易污染3. 目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量盡可能接近理論轉(zhuǎn)化率4. 目標(biāo)產(chǎn)物最好分泌到胞外5. 盡可能減少類似物的產(chǎn)量6. 其所利用生長(zhǎng)的培養(yǎng)基簡(jiǎn)單,價(jià)格低廉8. 羥化反應(yīng)、脫氫反應(yīng)、甾體邊鏈降解1. 甾體的微生物轉(zhuǎn)化：羥化反應(yīng)微生物對(duì)甾體羥化的位點(diǎn)眾多，其中以C、C,Cr、C,c,c,Cr、C、c9a11a11B14a15a16a16B17

26、a19角甲基和邊鏈C位上的羥化較為重要。26微生物轉(zhuǎn)化甾體的羥化酶多是細(xì)胞色素P450依賴型，P450作為末端氧化酶，需要利用分子氧以及與NADPH-依賴的脫氫酶相連接的電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。羥化酶所轉(zhuǎn)化的羥基由空氣中的氧直接取代甾體上的氫形成，因此工業(yè)上利用黑根霉菌轉(zhuǎn)化甾體時(shí)需要充分供氧1) C羥化：C位導(dǎo)入羥基后，容易在C-C之間引入雙鍵，并可進(jìn)一步導(dǎo)入C-羥基或9a991011B導(dǎo)入氟原子，因此C羥化屬于甾體藥物合成中的一個(gè)關(guān)鍵中間步驟。9a另一方面，C羥化還涉及甾體邊鏈選擇性降解，在微生物降解甾體邊鏈過(guò)程中，防止甾9a體母核破裂的關(guān)鍵是抑制9a-羥化酶對(duì)9a的羥化。2) C羥化：微生物所特有的

27、C羥化反應(yīng)是最早應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，它1111的成功應(yīng)用替代了困難的化學(xué)合成，而其在皮質(zhì)激素類藥物的合成中所得產(chǎn)物具有強(qiáng)抗炎活性，促進(jìn)了皮質(zhì)激素類藥物的合成。3) C仆羥化：Cr羥化同樣可以應(yīng)用于甾體激素生產(chǎn)。其中研究較廣泛的有新月彎抱霉，該霉菌對(duì)底物結(jié)構(gòu)的變化有較廣的耐受性，能對(duì)許多結(jié)構(gòu)不同的甾體進(jìn)行11B-羥化。4) C羥化:研究人員將雷斯青霉固定在海藻酸鈣凝膠上制成固定化細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，生15產(chǎn)后15羥化活性可恢復(fù)。應(yīng)用B-環(huán)糊精無(wú)論使用游離細(xì)胞還是固定化細(xì)胞都能提高轉(zhuǎn)化率。5) C羥化：除C位點(diǎn)的羥化外，皮質(zhì)甾體類藥物合成中的另一個(gè)重要反應(yīng)是甾體母核16 11的C羥化。目前C

28、羥化常采用放線菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入C-羥基后，使其對(duì)電解質(zhì)161616影響減小，同時(shí)抗炎和糖代謝作用不變。6) C羥化：在甾體母核上引入C-羥基后能增加皮質(zhì)甾體藥物的抗炎和糖代謝作用。綠17a17a色木霉能對(duì)黃體酮的C羥化，樹(shù)枝狀抱囊菌和小瓶瘤抱菌也能對(duì)甾體母核進(jìn)行C羥1717化。7) C羥化:C羥化產(chǎn)物是制備19-失碳甾體化合物的重要中間體。19-失碳甾體較原甾1919體具有更顯著的生理活性，如19失碳孕甾酮的療效較孕甾酮活性高48倍。8) 雙羥基化：目前，甾體母核常見(jiàn)的雙羥基化反應(yīng)一般發(fā)生在q與C15位置。并頭狀菌屬的某些菌株能將黃體酮轉(zhuǎn)化為7a,15B-雙羥基黃體酮。1.甾體的微生物轉(zhuǎn)化

29、：脫氫反應(yīng)在皮質(zhì)甾體類藥物的母核q,2位置導(dǎo)入雙鍵后，能成倍地增加其抗炎活性。但由于在動(dòng)物體內(nèi)缺乏相應(yīng)的酶，甾體激素類化合物的c12脫氫反應(yīng)不能進(jìn)行，而通過(guò)體外進(jìn)行c12脫氫，即可得到更高效的甾體藥物，這也是人工改造獲得高效藥物的典型例子。采用化學(xué)脫氫的方法，一般用二氧化硒脫除法，產(chǎn)品中帶有少量難以除盡的對(duì)人體有毒害的硒。微生物脫氫高效無(wú)毒，目前己經(jīng)成為甾體抗炎激素藥物合成中不可缺少的一步。一般情況下，細(xì)菌的脫氫能力比真菌強(qiáng)，如棒狀桿菌中的節(jié)桿菌和分枝桿菌脫氫活力較強(qiáng)。3-酮基甾體-A1-脫氫酶(KS1DH)是微生物體內(nèi)最常見(jiàn)的脫氫酶。(該反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè))KS1DH可催化A4-3-酮

30、甾體的脫氫，其作用是在3-酮基甾體的A環(huán)上引入1,2位雙鍵。KS1DH同時(shí)也是甾體母核降解的關(guān)鍵酶，因?yàn)殓摅w母核降解時(shí)也需要甾體A環(huán)上1,2位雙鍵的引入。KS1DH可催化脫氫反應(yīng)的逆反應(yīng)即C”-氫化反應(yīng)，該酶的氫化活性對(duì)底物的特異性類似于3-酮-4-烯甾體的脫氫反應(yīng)。1.甾體的微生物轉(zhuǎn)化：甾體邊鏈降解各類具有生理活性的甾體藥物的基本母核目前都是從高等植物和動(dòng)物中的天然甾體化合物經(jīng)過(guò)邊鏈降解、除去厄長(zhǎng)的邊鏈得到基本甾體母核研究發(fā)現(xiàn)，許多微生物都能夠?qū)⒐檀碱惢衔镒鳛樘荚蠢茫罱K將甾體母核環(huán)戊烷多氫菲和邊鏈完全氧化為CO2和水。固醇邊鏈降解的機(jī)制與脂肪酸的B氧化途徑相似。膽固醇的邊鏈降解途徑始于

31、C27羥基化，再通過(guò)氧化形成C27酸，然后B-氧化后先失去丙酸、醋酸，最后脫去丙酸，形成C17酮化合物9a-羥化酶q2-脫氫酶(KS1DH)如何避免甾體母核的降解(1) 對(duì)固醇進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造達(dá)到選擇性降解甾體邊鏈的目的。在甾體的A環(huán)形成芳香核后不再會(huì)發(fā)生母核的破裂。或當(dāng)Cr氧橋存在時(shí)會(huì)阻礙C雙鍵導(dǎo)入，從而保護(hù)甾體母核不被微生物進(jìn)一步降解。6B-191,2(2) 在酶抑制劑存在下對(duì)甾體進(jìn)行選擇性邊鏈降解。對(duì)甾體母核的選擇性邊鏈降解不但方便甾體藥物的改造，而且可以防止甾體母核的破裂。在微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中抑制甾體母核降解的關(guān)鍵酶9a-羥化酶或C12-脫氫酶的活性，從而達(dá)到選擇性降解固醇邊鏈的目的。幾類對(duì)

32、甾體母核降解有抑制作用的化合物作用機(jī)制化合物Fe3+絡(luò)合劑2，2'-雙聯(lián)吡啶、1,10-二氮雜菲羥基喹琳、5-硝基-1,10-二氮雜菲，二苯基硫卡巴腙二乙基硫氨基甲酸酯、異菸酰肼鄰苯二胺、4-異丙基-芳庚酚酮取代Fe的金屬離子Ni2+、Co2+、Pb2+阻礙巰基功能Se02-、AS0-32氧化還原染料次甲藍(lán)、刀天青(3) 應(yīng)用誘變或分子生物學(xué)技術(shù)篩選或構(gòu)建選擇性降解甾體邊鏈的菌株。采用紫外線、AT-甲基亞硝基胍等誘變劑，通過(guò)誘變技術(shù)篩選可以得到生化阻斷突變株，由于生化阻斷突變株中酶的缺損，可選擇性降解甾體邊鏈而不導(dǎo)致甾體母核的降解，且可以大量積累所需要的中間體。隨著基因工程的發(fā)展，人們

33、已大量釆用基因工程的手段如基因同源重組技術(shù)改造菌株使之穩(wěn)定高效地積累所需化合物甾體藥物中間體。9.蛋白質(zhì)化學(xué)修飾、蛋白質(zhì)藥物化學(xué)修飾、修飾的作用(意義)、修飾策略蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾:通過(guò)基團(tuán)的引入或去除而使蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的過(guò)程蛋白質(zhì)的藥物化學(xué)修飾:主要是指在分子水平上對(duì)蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行化學(xué)改造，通過(guò)對(duì)主鏈的切割、剪接及化學(xué)基團(tuán)的引入，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)藥物理化性質(zhì)和生物活性的改變，屬于蛋白質(zhì)改性的范疇蛋白質(zhì)虎穴修飾的意義:循環(huán)半衰期延長(zhǎng) 免疫原性降低或消失，毒副作用減小 物理、化學(xué)、生物穩(wěn)定性增強(qiáng)修飾策略:隨機(jī)修飾定點(diǎn)修飾隨機(jī)修飾：游離氨基多，同時(shí)發(fā)生在多個(gè)游離-nh2定點(diǎn)修飾：PEG-醛對(duì)a

34、-NH2進(jìn)行定點(diǎn)修飾2蛋白質(zhì)分子表面游離賴氨酸殘基的&-NH2和N-末端氨基酸殘基的a-NH2,兩者具有較高的親核反應(yīng)活性，是蛋白質(zhì)化學(xué)修飾中最常用的被修飾基團(tuán)。巰基修飾多為定點(diǎn)修飾。由于蛋白質(zhì)分子中巰基含量較少，利用巰基的高親和性，選取能夠特異性與巰基偶聯(lián)的化學(xué)修飾劑，可以對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行定點(diǎn)修飾。玄定點(diǎn)引入巰基：糖蛋白的糖基化位點(diǎn)、蛋白質(zhì)的抗原決定簇、蛋白質(zhì)末端等羧基修飾的位點(diǎn)包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。首先把修飾劑（如PEG）分子中的羥基轉(zhuǎn)化為氨基，再在碳二亞胺存在下與蛋白質(zhì)的羧基縮合，得到修飾的蛋白質(zhì)。10.RNA干擾、基因治療、腫瘤的基因治療（新型技術(shù)制藥PPT）有一條論

35、述大題在這里!！RNA干擾（RNAinterference，RNAi）:是一種由雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控和基因沉默的過(guò)程，其廣泛存在于從植物、無(wú)脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物的各種生物。RNAi的作用原理雙鏈RNA誘導(dǎo)誘導(dǎo)RNAi的過(guò)程主要分為兩個(gè)階段：I啟動(dòng)階段II執(zhí)行階段啟動(dòng)階段當(dāng)細(xì)胞中由于感染等原因出現(xiàn)雙鏈RNA分子時(shí)，細(xì)胞中一種稱為Dicer的核酸酶就會(huì)識(shí)別這些雙鏈RNA，并將其降解成21-23bp長(zhǎng)的小干擾RNA（siRNA），單鏈siRNA與一些蛋白形成復(fù)合體，構(gòu)成“RNA誘導(dǎo)的沉默小體”（RISC）執(zhí)行階段當(dāng)目標(biāo)mRNA與RISC中的siRNA完全配對(duì)時(shí)，RISC就會(huì)切割目標(biāo)RNA,并由細(xì)胞中的核酸酶將其進(jìn)一步降解，從而抑制目標(biāo)基因的表達(dá)長(zhǎng)鏈的RNA會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞合成并分泌干擾素，干擾素又會(huì)抑制細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，造成一定的副作用。如果直接用21-23bp的小雙鏈RNA即siRNA，則不會(huì)誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)，