HPLC測(cè)定有關(guān)物質(zhì)和含量方法驗(yàn)證小結(jié)

1、本貼的目的：討論目前審評(píng)尺度下，藥品研發(fā)過程中，分析方法的驗(yàn)證項(xiàng)目及目的，試驗(yàn)方法，試驗(yàn)要求本帖僅僅針對(duì)于HPLC方法進(jìn)行討論方法開發(fā)的內(nèi)容不在本帖討論范圍內(nèi)1 .有關(guān)物質(zhì)（適用于API,制劑J,也適用于起始物料，中間體）有關(guān)物質(zhì)方法驗(yàn)證的前提條件：2 .各雜質(zhì)與主峰的混合溶液能用擬定的分析方法有效分離3 .根據(jù)混合溶液中各峰的紫外吸收波長(zhǎng)（或單獨(dú)測(cè)定各組分紫外吸收），選擇合適的檢測(cè)波長(zhǎng)。多波長(zhǎng)檢測(cè)（如有）則分別考察。4 .在檢測(cè)波長(zhǎng)下，選擇峰高最小的，計(jì)算S/N,預(yù)估主成分濃度5 .各雜質(zhì)純度已知6 .根據(jù)合成跟蹤檢測(cè)，合理制定各雜質(zhì)的限度7 .供試品溶解方法和提取方法得到合理證明1.1 專

2、屬性：1.1.1 概念在其他成分（如其他雜質(zhì)，輔料，溶劑）可能存在的情況下，擬定的分析方法能正確測(cè)定被檢測(cè)物的能力。1.1.2 試驗(yàn)方法1.1.2.1 定位試驗(yàn)：A.目的對(duì)各已知雜質(zhì)和主峰進(jìn)行定位B.試驗(yàn)方法：a.配制一定濃度（能夠顯示出峰純度，一般為0.1mg/ml）的各已知雜質(zhì)溶液、擬檢測(cè)濃度的主成分作為定位溶液b.配制限度濃度各已知雜質(zhì)與檢測(cè)濃度的主成分的混合溶液作為分離度試驗(yàn)溶液c.使用擬定分析方法分別進(jìn)行定位。C.試驗(yàn)要求：a.空白應(yīng)不干擾各雜質(zhì)的測(cè)定：如雜質(zhì)附近有空白峰，二者分離度應(yīng)大于1.5;雜質(zhì)峰保留時(shí)間處不得為梯度峰拐點(diǎn)b.定位溶液中，已知雜質(zhì)與主峰的峰純度應(yīng)符合規(guī)定c.分離

3、度試驗(yàn)溶液中，主峰與相鄰雜質(zhì)的分離度應(yīng)大于2.0（至少1.5）;各已知雜質(zhì)之間的分離度應(yīng)大于1.5（至少1.2）;1.1.2.2強(qiáng)制降解試驗(yàn)A.目的一是通過考察藥品在一系列劇烈條件下的穩(wěn)定性，了解該藥品內(nèi)在的穩(wěn)定特性及其降解途徑與降解產(chǎn)物。其二，這些試驗(yàn)也能在一定程度上對(duì)有關(guān)物質(zhì)分析方法用于檢查降解產(chǎn)物的專屬性進(jìn)行驗(yàn)證。B.試驗(yàn)方法對(duì)于高溫、光照、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及強(qiáng)氧化劑的濃度及時(shí)間、取樣方式等沒有明確的規(guī)定。具體品種具體模索，初步試驗(yàn)了解樣品對(duì)影響的因素（高溫、光照、酸、堿、氧化）等條件基本穩(wěn)定情況后，進(jìn)一步調(diào)整破壞試驗(yàn)條件，只要使主藥有一定量的降解，并對(duì)可能的降解途徑和降解機(jī)制進(jìn)行分析，保證實(shí)

4、驗(yàn)的意義即可。試驗(yàn)一般的范圍為：強(qiáng)酸：0.15.0mol/LHCl溶液或視情況調(diào)節(jié)時(shí)間，溫度，體積強(qiáng)堿：0.15.0mol/LNaOH溶液或視情況調(diào)節(jié)時(shí)間，溫度，體積強(qiáng)氧化劑：30%的H2O2或視情況配制不同濃度的溶液或視情況調(diào)節(jié)時(shí)間，溫度高溫：固體狀態(tài)下穩(wěn)定的主藥，可以考慮溶解后以液體狀態(tài)進(jìn)行試驗(yàn)光照：固體狀態(tài)下穩(wěn)定的主藥，可以考慮溶解后以液體狀態(tài)進(jìn)行試驗(yàn)C.試驗(yàn)要求a.一般樣品含量控制在85%90%范圍（歸一化法），不一定要求每個(gè)條件都能降解出來。b.在進(jìn)行酸、堿、強(qiáng)氧化破壞試驗(yàn)時(shí)，每個(gè)試驗(yàn)最好都要做相應(yīng)的空白（溶劑，空白輔料，復(fù)方制劑還包括除去某一主藥的其他組分）破壞試驗(yàn)作為輔助。c.主

5、峰純度符合規(guī)定，與相鄰雜質(zhì)分離度大于2.0（至少1.5）,已知雜質(zhì)與相鄰雜質(zhì)分離度大于1.2d.物料守恒，即未破壞主藥的C/A與破壞后的C/A值相比，結(jié)果在0.91.1之間e.關(guān)于破壞試驗(yàn)，更多內(nèi)容請(qǐng)參閱lyslinjiu版主在帖子【討論】2013-專屬性實(shí)驗(yàn)（強(qiáng)制降解試驗(yàn)）2013-專屬性實(shí)驗(yàn)（強(qiáng)制降解試驗(yàn)）-丁香園論壇f.在此處做梯度時(shí)間（如有）延長(zhǎng)驗(yàn)證試驗(yàn)。即將分析方法的梯度中，有機(jī)相比例最大的時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)（建議延長(zhǎng)時(shí)間為主峰保留時(shí)間或1020min）,考察是否降解出難以洗脫的物質(zhì)在擬定方法的梯度周期內(nèi)能有效檢出。進(jìn)一步考察分析方法的合理性1.2 定量限1.2.1 概念樣品中能被定量測(cè)定的最

6、低量，有定量意義。1.2.2 驗(yàn)證方法A.目的考察雜質(zhì)的能被定量的最低量，同時(shí)評(píng)判供試品濃度的選擇是否合理B.試驗(yàn)方法配制限度濃度的各已知雜質(zhì)與主成分的混合溶液作為貯備液，進(jìn)樣，逐步稀釋至S/N約為10時(shí)，得定量限。C.試驗(yàn)要求定量限濃度不得高（修正，原為低）于限度濃度的1/51.3 檢測(cè)限1.3.1 概念樣品中能被檢測(cè)出的最低量，僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒有定量意義。1.3.2 驗(yàn)證方法A.目的考察雜質(zhì)的最低檢出量，同時(shí)評(píng)判供試品濃度的選擇是否合理B.試驗(yàn)方法配制限度濃度的各已知雜質(zhì)與主成分的混合溶液作為貯備液，進(jìn)樣，逐步稀釋至S/N約為3時(shí)，得檢測(cè)限。C.試驗(yàn)要求檢測(cè)限濃度不得

7、高（修正，原為低）于限度濃度的1/101.4 溶液穩(wěn)定性1.4.1 目的考察被測(cè)各溶液在特定時(shí)間周期內(nèi)的穩(wěn)定性1.4.2 試驗(yàn)方法a.配制系統(tǒng)適應(yīng)性溶液、供試品溶液、對(duì)照品溶液，在室溫條件下，分別在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣b.如不穩(wěn)定，需考察在低溫條件下的溶液穩(wěn)定性c.時(shí)間范圍根據(jù)試驗(yàn)需要來確定。比如做回收率中需要至少連續(xù)測(cè)定9份供試品，是所有單個(gè)驗(yàn)證項(xiàng)目中最長(zhǎng)的，選擇這個(gè)時(shí)間點(diǎn)是可以的。也有考慮到以后需要測(cè)定更多的樣品，選擇更長(zhǎng)的時(shí)間范圍。1.4.3 試驗(yàn)要求a.系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，各峰之間分離度應(yīng)符合要求。b.對(duì)照品溶液峰面積RSD應(yīng)小于2.0%c.供試品溶液，雜質(zhì)個(gè)數(shù)和雜質(zhì)量應(yīng)一致，峰面積RSD應(yīng)小于5

8、.0%;不得檢出新增雜質(zhì)d.如不穩(wěn)定，需臨用現(xiàn)配或低溫保存1.5 儀器精密度1.5.1 概念同一溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，其tR和峰面積的精密度，考察儀器的進(jìn)樣精密度1.5.2 試驗(yàn)方法配制限度濃度的各雜質(zhì)和主成分的混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次1.5.3 試驗(yàn)要求a.tR的RSD小于2.0%b.各峰面積RSD小于2.0%1.6 線性與校正因子1.6.1 概念在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，被測(cè)物濃度與峰面積的線性關(guān)系1.6.2 試驗(yàn)方法配制各雜質(zhì)和主成分的混合溶液，逐步稀釋，濃度范圍從定量限至限度濃度的120%以上，至少配制5份以上溶液。由2人分別進(jìn)行。1.6.3 3試驗(yàn)要求a.線性關(guān)系系數(shù)r大于0.990b.Y軸截距應(yīng)

9、在100%響應(yīng)值的25%以內(nèi)c.響應(yīng)因子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于10%d.2人測(cè)得斜率之比在0.981.02之間e.計(jì)算出來的校正因子應(yīng)進(jìn)行修約，在0.91.1范圍內(nèi)的，修約為1.0進(jìn)行計(jì)算；0.25.0范圍內(nèi)的，按校正因子計(jì)算；0.25.0范圍外的，按外標(biāo)法計(jì)算。1.7 精密度1.7.1 概念同一個(gè)均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定結(jié)果之間的接近程度。1.7.2 重復(fù)性1.7.2.1 試驗(yàn)方法由同一試驗(yàn)人員，取同一均勻供試品，平行配制6份供試品溶液，測(cè)定雜質(zhì)百分含量。1.7.2.2 試驗(yàn)要求a.檢出雜質(zhì)個(gè)數(shù)，雜質(zhì)相對(duì)保留時(shí)間，各雜質(zhì)百分含量均應(yīng)一致b.單個(gè)雜質(zhì)的百分含量的極差應(yīng)在其含量±10%

10、以內(nèi)c.雜質(zhì)總量的RSD應(yīng)小于5.0%1.7.3 中間精密度1.7.3.1 試驗(yàn)方法同一實(shí)驗(yàn)室，由不同試驗(yàn)人員在不同時(shí)間使用不同設(shè)備，平行配制6份供試品溶液，測(cè)定雜質(zhì)百分含量。1.7.3.2 試驗(yàn)要求a.同1.7.2.2-a和bb.單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量的RSD應(yīng)小于10.0%1.8 回收率1.8.1 概念用擬定分析方法所測(cè)得結(jié)果與真實(shí)值接近的程度。1.8.2 試驗(yàn)方法a.配制各雜質(zhì)的混合貯備液b.稱取供試品適量，精密加入混合雜質(zhì)貯備液適量，配制成溶液，使供試品濃度為測(cè)定濃度，雜質(zhì)濃度分別為限度濃度的50%,100%,150%o各濃度均平行配制3份c.配制混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液和自身對(duì)照溶液1.8.3

11、 試驗(yàn)要求a.各濃度下的回收率應(yīng)在90%110%之間b.回收率（N=9）的RSD應(yīng)小于10.0%c.用加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算結(jié)果應(yīng)與雜質(zhì)外標(biāo)法計(jì)算結(jié)果一致1.9 耐用性1.9.1 概念在擬定的分析方法有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的分析方法用于常規(guī)檢測(cè)提供依據(jù)1.9.2 試驗(yàn)方法a.分析方法中可變動(dòng)的因素有：流動(dòng)相組成比例，水相pH,柱溫，色譜柱（同一品牌不同批次，不同品牌的常用色譜柱），流速，檢測(cè)波長(zhǎng)b.配制系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，供試品溶液，對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定1.9.3 試驗(yàn)要求a.系統(tǒng)適應(yīng)性溶液應(yīng)符合規(guī)定；如不符合規(guī)定，則需更嚴(yán)格控制所變化的因素，直至找到一個(gè)合適的范圍；

12、如指定色譜柱，嚴(yán)格控制pH等等b.檢測(cè)雜質(zhì)個(gè)數(shù)，雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)與精密度結(jié)果一致c.測(cè)得雜質(zhì)量應(yīng)與精密度結(jié)果一致2.含量測(cè)定（適用于API,制劑J,也適用于單個(gè)雜質(zhì)控制）含量測(cè)定方法驗(yàn)證的前提條件：1 .空白（溶劑和輔料）和各雜質(zhì)不干擾主峰的測(cè)定2 .根據(jù)主成分的紫外吸收波長(zhǎng)（復(fù)方需分別單獨(dú)測(cè)定各組分紫外吸收），選擇合適的檢測(cè)波長(zhǎng)。多波長(zhǎng)檢測(cè)（如有）則分別考察。3 .在檢測(cè)波長(zhǎng)下，計(jì)算S/N,預(yù)估主成分濃度4 .供試品溶解方法和提取方法得到合理證明2.1 專屬性：2.1.1 概念在其他成分（如其他雜質(zhì)，輔料，溶劑）可能存在的情況下，擬定的分析方法能正確測(cè)定主成分的能力。2.1.2 試驗(yàn)方法

13、2.1.2.1 定位試驗(yàn)：A.目的同1.1.2.1-AB.試驗(yàn)方法同1.1.2.1-BC.試驗(yàn)要求：a.空白應(yīng)和各雜質(zhì)不得干擾主成分的測(cè)定，主峰保留時(shí)間處不得為梯度峰拐點(diǎn)（如有）b.定位溶液中，主峰的峰純度應(yīng)符合規(guī)定c.分離度試驗(yàn)溶液中，主峰與相鄰雜質(zhì)的分離度應(yīng)大于2.02.1.2.2 強(qiáng)制降解試驗(yàn)A.目的一是通過考察藥品在一系列劇烈條件下的穩(wěn)定性，了解該藥品內(nèi)在的穩(wěn)定特性及其降解途徑與降解產(chǎn)物。其二，這些試驗(yàn)也能在一定程度上對(duì)含量測(cè)定分析方法用于檢查主成分的專屬性進(jìn)行驗(yàn)證。B.試驗(yàn)方法同1.1.2.2-BC.試驗(yàn)要求a.主峰純度符合規(guī)定，與相鄰雜質(zhì)分離度大于2.0其他同1.1.2.2-C2.

14、2 定量限2.2.1 概念樣品中能被定量測(cè)定的最低量，有定量意義。2.3.2驗(yàn)證方法A.目的考察主成分的能被定量的最低量，同時(shí)評(píng)判供試品濃度的選擇是否合理B.試驗(yàn)方法配制檢測(cè)濃度的主成分溶液，進(jìn)樣，逐步稀釋至S/N約為10時(shí)，得定量限。C.試驗(yàn)要求定量限濃度不得高（修正，原為低）于檢測(cè)濃度的1/102.3 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)要求為主成分峰面積RSD小于2.0%如溶出檢測(cè)方法同含量，建議考察一個(gè)溶出曲線周期內(nèi)的溶液穩(wěn)定性其他同1.4項(xiàng)下2.4 儀器精密度試驗(yàn)要求為主成分峰面積RSD小于2.0%其他同1.5項(xiàng)下2.5 線性與校正因子2.5.1 概念在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，被測(cè)物濃度與峰面積的線性關(guān)系2.5.2

15、 試驗(yàn)方法配制主成分貯備液，逐步稀釋，濃度范圍從檢測(cè)濃度80%至120%,至少配制5份以上溶液。由2人分別進(jìn)行。2.5.3 試驗(yàn)要求同1.6.32.6 精密度2.6.1 概念同一個(gè)均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定結(jié)果之間的接近程度。2.6.2 重復(fù)性2.6.2.1 試驗(yàn)方法由同一試驗(yàn)人員，取同一均勻供試品，平行配制6份供試品溶液，測(cè)定主成分百分含量。2.6.2.2 試驗(yàn)要求6份供試品含量結(jié)果RSD應(yīng)小于2.0%2.6.3 中間精密度2.6.3.1 試驗(yàn)方法同一實(shí)驗(yàn)室，由不同試驗(yàn)人員在不同時(shí)間使用不同設(shè)備，平行配制6份供試品溶液，測(cè)定主成分百分含量。2.6.3.2 試驗(yàn)要求a.6份供試品含量結(jié)果RSD應(yīng)小于2.0%b.12份供試品含量結(jié)果RSD應(yīng)小于2.0%2.7 回收率2.7.1 概念用擬定分析方法所測(cè)得結(jié)果與真實(shí)值接近的程度。2.7.2 試驗(yàn)方法a.API在精密度，線性